הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר מחקר

אמיגדלין מווסת את השיגנלינג של FOXO3a כדי לעכב עקה חמצונית ולשפר אלופציה אראטה בעכברים

70 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/73759

⸱

29 בספטמבר 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, 2Neurosurgery, Institute of Sichuan Cancer Hospital, 3Department of Dermatology, The Affiliated Hospital, Southwest Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה נועד לבחון את המנגנונים המולקולריים הפוטנציאליים העומדים בבסיס ההשפעות הנוגדות חמצון והנוגדות דלקת של amygdalin במודל של alopecia areata בעכברי C3H/HeJ ובמודל של פגיעה במלנוציטים אפדרמליים ראשוניים של בני אדם שגרמה H2O2.

תקציר

מאמר זה נועד לבחון את המנגנון של ההשפעה הטיפולית של אמיגדלין (AMG) על אלופציה אריאטה (AA). צביעת Hematoxylin-eosin שימשה לבדיקת הרעילות הכבדית והכלייתית של AMG. לאחר הקמת מודל AA בעכברי C3H/HeJ ובמלנוציטים אפידרמליים ראשוניים של בני אדם (HPEMs) שנפגעו על ידי H2O2, ובעקבות התערבות באמצעות AMG, נוטרו תכולת המינים הreactive של החמצן (ROS) ורמות החלבון והגן של forkhead box O3A (FOXO3a). ערכות ביוכימיות או בדיקת ‌enzyme-linked immunosorbent assay‌ שימשו לזיהוי התכנים של superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase 4 (GPX-4), malondialdehyde (MDA), interleukin-15 (IL-15), interferon-gamma (IFN-γ), ו-interleukin-6‌ (IL-6). Western blot בוצע כדי להעריך את רמות ה-MHC I, IL-15, FOXO3a, SOD, CAT, GPX-4, IFN-γ, IL-6, ו-IL-15. ChIP-PCR בוצע כדי להעריך את העשירה של AMG בפרומוטורים של SOD, CAT, ו-GPX-4 ב-FOXO3a. במקביל, נחקרו ROS, אפופטוזה, ורמות החלבון והגן של FOXO3a, SOD, CAT, ו-GPX-4 ב-HPEMs עם ביטוי נמוך של FOXO3a. ל-AMG אין רעילות פוטנציאלית לכבד או לכליות והוא יכול להפחית את ביטוי חלבוני MHC I ו-IL-15 בעור, כמו גם את רמת ה-IL-15 בסרום. AMG יכול להגביר את ביטוי החלבון והגן של FOXO3a בעור, כמו גם את רמות ה-SOD, CAT, ו-GPX-4, תוך הפחתת רמות ROS ו-MDA. AMG יכול לעכב את MHC I, IFN-γ, IL-6, ו-IL-15, MDA, אפופטוזה, וייצור ROS ב-HPEMs, ולהגביר את תכני ה-SOD, CAT, ו-GPX-4. חשוב לציין, כי AMG יכול להעלות את ביטוי הגנים והחלבונים של FOXO3a, SOD, CAT, ו-GPX-4, ולהעשיר את FOXO3a בפרומוטורים של SOD, CAT, ו-GPX-4. נתונים אלו מרמזים כי AMG יכול לקדם את ביטוי FOXO3a ולעכב עקה חמצונית ותגובות דלקתיות, ובכך לשפר את מצב ה-AA בעכברי C3H/HeJ.

מבוא

אלופציה אריאטה (AA) היא הפרעה אוטואימונית המאופיינת בנשירה פתאומית של שיער ללא השארת צלקות, ושכיחותה העולמית היא כ-2–3%, עם למעלה מ-30 מיליון חולים בסין1. נתונים אפידמיולוגיים מראים כי המחלה יכולה להשפיע על אנשים בכל קבוצות הגיל, אך היא שכיחה יותר בקרב מבוגרים צעירים, כאשר כ-60% מהחולים חווים את ההתפרצות הראשונה לפני גיל 20, ביחס כמעט שווה בין גברים לנשים1,2. ברמה עולמית, השכיחות השנתית של AA היא כ-0.2–0.3%, כאשר 40% מהמקרים הם AA באתר בודד, 35% AA באתרים מרובים, 5% קרחת מלאה ו-2% אלופציה אוניברסלית3,4,5. מבחינת סיבוכים, לכ-30% מהחולים יש שקעים בציפורניים, חריצים אורכיים ונזקים אחרים, ושיעור התחלואה הנלווית למחלות אוטואימוניות כגון הפרעות בבלוטת התריס וויטיליגו גבוה מהרמות הנצפות באוכלוסייה הכללית6,7. מהיבט מזיק, AA אינה משפיעה רק על המראה החיצוני אלא נוטה לגרום גם לבעיות פסיכולוגיות כגון דיכאון וחרדה, כאשר כ-70% מהחולים עם התפרצות ראשונית חוו אירועי סטרס משמעותיים בתוך 3 חודשים לפני תחילת המחלה8,9. ללא טיפול לאורך זמן, חולים עלולים להתקדם לקרחת מלאה או לאלופציה אוניברסלית, דבר המשפיע קשות על התפקוד החברתי ועל איכות חייהם10.

נכון להיום, הרפואה המערבית משתמשת בעיקר בשילוב של תרופות מקומיות, תרופות לבליעה, פיזיותרפיה והשתלת שיער לטיפול ב-AA11,12. טיפול מקומי כולל בעיקר תמיסת minoxidil וקורטיקוסטרואידים (כגון קרם fluticasone propionate), אשר ממריצים את זקיקי השיער ומעכבים תגובות חיסוניות מקומיות כדי לעודד צמיחת שיער, אך שימוש ממושך עלול להוביל לתגובות לוואי כגון אטרופיה של העור13,14. עבור חולים עם מחלה פרוגרסיבית, מדכאי חיסון דרך הפה (כגון prednisone ו-cyclosporine) יכולים לווסת ביעילות את התגובה החיסונית הסיסטמית, אך נדרש ניטור קבוע של תפקודי הכבד והכליות12,15. בפיזיותרפיה, קרינת ultraviolet בטווח צר ובאורך גל בינוני וטיפול בלייזר בעוצמה נמוכה משפרים את המיקרוסירקולציה כדי לסייע לצמיחת שיער, אך נדרשים טיפולים מרובים, וההשפעה משתנה מאדם לאדם16,17. במקרים עקשניים, ניתוח להשתלת שיער יכול להשתיל זקיקי שיער בריאים לאזור הקירחה, אך קיים סיכון לכישלון ההשתלה, ונדרש תחזוקה תרופתית18. יתרונות הטיפול ברפואה מערבית טמונים בתחילת השפעה מהירה ובסטנדרטיזציה גבוהה, במיוחד עבור AA מוקדם ומקומית19. עם זאת, חסרונותיו כוללים נטייה להישנות (rebound) בשימוש בתרופות הורמונליות, תופעות לוואי משמעותיות של מדכאי חיסון, ויעילות מוגבלת עבור חולים עם קירחה מלאה/אלופציה אוניברסלית20,21. בנוסף, מחזור הטיפול ארוך (בדרך כלל 3–6 חודשים), והעלות גבוהה (למשל, עלות שנתית של מעכבי JAK וסוכנים ביולוגיים, העולה על 100,000 yuan), דבר המגביל את יישומם הנרחב19,22. בשל הסיבות הרבות שהוזכרו לעיל, המחברים חשים צורך דחוף לחקור תרופות מטרות חדשות.

עקה חמצונית תורמת באופן משמעותי למנגנון הפתוגני של AA. במהלך תהליך סינתזת הפיגמנט במלנוציטים, מיוצרת כמות גדולה של מימן פראוקסיד (H2O2)23,24. בנסיבות רגילות, ניתן לנקות זאת באמצעות אנזימים נוגדי חמצון (כגון superoxide dismutase (SOD) ו-catalase (CAT))25. עם זאת, בקרב אנשים עם AA, פעילות האנזימים נוגדי החמצון היא לרוב נמוכה יותר, מה שמוביל להצטברות של תוצרי חמצון וגורם לנזק ל-DNA ולאפופטוזיס של תאים26,27. מצב של עקה חמצונית זו יפעיל עוד יותר את התגובה הדלקתית, וישחרר מתווכי פרו-דלקתיים (כגון TNF-α ו-IFN-γ), מה שיצור מעגל קסמים של עקה חמצונית ודלקת28. התגובה הדלקתית תוקפת את זקיקי השיער באמצעות לימפוציטים T, מה שגורם לזקיקי השיער להיכנס לשלב מנוחה ולנשור29. ניסויים קליניים מצאו כי למטופלים עם AA יש לעיתים קרובות מחלות אוטואימוניות אחרות (כגון מחלות בלוטת התריס)30, מה שמרמז כי הפרה חיסונית סיסטמית משמשת כגורם מעורר קריטי. בנוסף, עקה חמצונית ודלקת מקדמות יחד אפופטוזיס של תאי זקיק השערה, והשיבוש באותות האפופטוטיים יפגע עוד יותר ביכולת ההתחדשות של זקיק השערה, וימנע מהשיער לצמוח מחדש31. לכן, הטיפול ב-AA צריך לקחת בחשבון פעילות נוגדת חמצון, נוגדת דלקת וויסות של מסלולי אפופטוזיס כדי לשבור את מעגל הקסמים הזה.

אמיגדלין (AMG) הוא תרכובת גליקוזיד ציאנוגנית המופיעה באופן טבעי, ונמצאת בעיקר בזרעי צמחים השייכים למשפחת ה-Rosaceae (כגון גרעיני משמש, שקד, אפרסק ונשפר)32,33,34. מחקרים קודמים הראו כי AMG יכול לשפר פסוריאזיס על ידי הגברת תפקוד מחסום העור35. במקביל, ההשפעות האנטי-אפופטוטיות והאנטי-חמצוניות של AMG מאפשרות את השימוש בו לטיפול ב-AA36,37. ראיות קודמות אישרו גם כי AMG יכול לעכב את התגובה הדלקתית כדי להקל על תסמיני AA בעכברי C3H/HeJ38. עם זאת, המנגנון המולקולרי שבאמצעותו AMG מעכב דלקת ומקל על עקה חמצונית כדי לצמצם את ה-AA לא דווח באופן מקיף. מחקר זה הדגים בעיקר אירועי עקה חמצונית המתווכים על ידי שביל הסיגנלינג של forkhead box O3A (FOXO3a) כתוצאה מהתערבות של AMG בטיפול במודל AA של עכברי C3H/HeJ ובמודל פגיעה של מלאנוציטים אפידרמליים ראשוניים של בני אדם (HPEMs) המושרה על ידי H2O2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אישור אתי והסכמה להשתתפות
הפרוטוקולים הניסויים הכוללים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של Scientist Biotechnology Co., Ltd. (מספר אישור אתי: SYST-2024-014), בהתאם להנחיות ARRIVE 2.0 ומדריך ה-NIH לטיפול בבעלי חיים במעבדה. כמו כן, ועדת האתיקה של בית החולים המהי של מחוז סיצ'ואן (Sichuan Provincial People’s Hospital) העניקה אישור לשימוש אתי בדגימות קליניות מאנשים עבור in vitro ניסויים (מספר אישור אתי: 2024103). הושגה הסכמה מדעת מכל תורמי הרקמות. כל הפרטים המסחריים של הרכיבים והציוד ששימשו במחקר זה מופיעים ב- טבלת חומרים.

הקמת מודל AA בעכברי C3H/HeJ ומתן AMG
בהתבסס על הספרות הקודמת, הוקם מודל AA בעכברי C3H/HeJ והם טופלו ב-AMG38,39. בקצרה, שלושים עכברות C3H/HeJ (בגיל 6–8 שבועות) עברו תקופת אקלימציה של שבוע לפני שחולקו באופן אקראי לחמש קבוצות נפרדות: Control, AA, AMG-L, AMG-M ו-AMG-H. למעט קבוצת הביקורת, מודל ה-AA בארבע הקבוצות הנותרות הוקם על ידי מריחת 0.05 g של קרם imiquimod על עור הגב של העכברים. מריחה זו בוצעה שלוש פעמים בשבוע, ובסך הכל ניתנו תשעה מנתקים. שטח העור שנמרח היה 1.5 cm × 1.5 cm. עכברים הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת ה-AA קיבלו 0.02 mL/g של תמיסת סלין נורמלית על ידי gavage מדי יום. עכברים בקבוצות ה-AMG קיבלו זריקות תוך-קיבתיות במינונים של 60, 90 ו-120 mg/kg מדי יום. תקופת המתן נמשכה 21 ימים. לצורך תצפית כללית והערכה של מודל ה-AA, נדרשת פריקרה (alopecia) מעגלית מוגדרת היטב בקוטר ≥ 1 cm, ללא צלקות או דלקת חמורה, ועם מוטות שיער שבורים. עכברים המראים דלידול שיער דיפוזי בכל הגוף, כיבובים חמורים בעור או צמיחה מהירה וספונטנית של שיער מוחרגים מהניסוי.

HPEMs
בהתאם לשיטה הקודמת40, נבחרו רקמות עור בריאות ממטופלים שעברו ברית מילה בבית החולים והושרגו באלכוהול 75% למשך 5 min. לאחר מכן, רקמות העור נשטפו שוב ושוב ב-PBS המכיל ampicillin (100 U/mL) ו-streptomycin sulfate (100mg/mL), והודגרו בתמיסת dispase II בטמפרטורה של 4°C למשך לילה לצורך עיכול. שכבות האפידרמיס שהופרדו ובודדו נקיצו וסוננו דרך ממבנה סטרילי כדי להפיק את תרחף התאים. לאחר צנטריפוגציה, נאספו תאי השכבה התחתונה ששקעו, ולאחר מכן הושעו מחדש במצע melanocyte 254 ללא סרום ונזרעו שוב בצפיפות של כ-5 × 105 בבקבוקי תרבית ותובעתו באינקובטור CO2. לאחר שלושה מעברים, נעשה שימוש במלנוציטים טהורים עבור הניסויים הבאים.

הקמה של H2O2מודל פגיעה ממתח חמצוני במלנוציטים אנושיים המושרה על ידי [Source missing/blank] והתערבות באמצעות AMG
מלנוציטים אנושיים עם דרגת התמזגות של 60% עד 80% חולקו לקבוצת ביקורת ולקבוצות עם ריכוזים שונים של H2O2 (200, 400, 600, 800, ו- 1000 µM). לאחר דגירה של 24 שעות, חיוניות התאים הייתה ‌הוערך‌ בשיטת CCK-8. לאחר מכן, הריכוז האופטימלי של H2O2 הושתמש להקמת מודל של עקה חמצונית במלנוציטים, וריכוזים שונים של AMG ‏(0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 ו-10 מ"ג/מ"ל) נוספו לתרבית למשך 24 שעות. לאחר מכן נבחר מדד חיוניות התאים כדי להעריך ולסנן את ריכוז ה-AMG.

בדיקת H&E
רקמות כבד וכליות של עכברים קובעו ב-4% פאראפורמאלדהיד למשך 24 שעות ונטמנו בפאראפין, לאחר מכן בוצע תהליך דהידרציה (הסרת מים) בשלבים הבאים: 70% אתנול למשך 4 שעות, 80% אתנול למשך שעתיים, 90% אתנול למשך שעתיים, 95% אתנול למשך שעתיים, אתנול אניהידרי פעמיים, שעה בכל פעם; וקסילן פעמיים, 30 דקות בכל פעם.38,39,41לאחר מכן, 4-µm חתכים בפרפין עברו צביעת H&E&צביעת E, הותיבשו, עברו בירירות (clearing) ועוגנו עם דבק ניטרלי (neutral gum). סורק 3D HISTECH שימש לדיגיטציה של חתכי הרקמה, ותמונות בהגדלה של 20× ו-40× תמונות תועדו בהגדלות שונות.

בדיקה אימונו-סורבנטית תלוית אנזים (ELISA) וזיהוי ביוכימי
רקמות עור הומוגניזו בתמיסת בופר ביחס של 1:9 (משקל/נפח), ולאחר מכן הופרדו בצנטריפוגה ב-1006–1789 × g למשך 10 דקות. לאחר כימות חלבונים בסרום, בתמריות מרקמות עור ובסופרנאט של תאים באמצעות BCA, נמדדו רמות של MDA, IL-6, IL-15 ו-IFN-γ באמצעות ערכות ELISA המתאימות. פעילויות האנזים של SOD, CAT ו-GPX-4 זוהו בהתאם להוראות של הערכות הביוכימיות הרלוונטיות.

ציטומטריה זורמת לגילוי מיני חמצן רהאקטיביים (ROS)
השתמשו במצע גידול נטול סרום לצורך דילול 10µM DCFH-DA ביחס של 1:1000. לאחר מכן, רקמות עור של עכבר או מלנוציטים אנושיים הוכנו כתלי תאים בריכוז של 1–20×106 תאים/מ"ל באמצעות 10µM DCFH-DA. התאים דגרו ב- 37°C במשך 20 דקות. במהלך תקופה זו, התאים נוערו ועורבבו מדי 3–5 דקות. לאחר שלושה שטיפות במצע נטול סרום, נמדדו רמות ה-ROS התוך-תאיים באמצעות ציטומטריית זרימה, כאשר אורכי גל העירור והפליטה נקבעו ל-488nm ו-525nm, בהתאמה.42,43.

מדידת אימונופלורסצנציה
דגרו נוגדן ראשוני FOXO3a (בדילול 1:1000) עם 4-µm חתכים של רקמת עור או HPEMs מקובעים למשך לילה ב- 4°Cלאחר מכן, הדגימות טופלו בנוגדנים משניים המסומנים בפלואורופורים מסוג Alexa Fluor וצבעו נגדי בתמיסת DAPI. לבסוף, הפרוסות נבחנו ותועדו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לצורך דימות פלואורסצנטי של ROS, נעשה שימוש ב-4-µm נתחים קפואים של רקמת עור או שקופיות HPEMs הוחממו מחדש בטמפרטורת החדר והובשו. סביב הרקמה סומן עיגול באמצעות עט היסטוכימי. השקופיות טופלו בחומר למניעת פלואורסצנציה עצמית (autofluorescence quencher) למשך 5 דקות ולאחר מכן נשטפו תחת מים זורמים למשך 10 דקות. תמיסת צביעה ל-ROS הוטפלה ודגרה בחושך ב- 37°C במשך 30 דקות. החתכים עברו שלושה שלבי שטיפה של 5 דקות ב-PBS באמצעות שייקר להסרת צבע. לאחר מכן, טפטפו תמיסת צביעה ב-DAPI והדגישו אותה ‌במשך 10 דקות בתנאי חשיכה ובטמפרטורת החדר. הזכוכיות נחתמו באמצעות תווך למניעת פלואורסצנציה (quencher). לאחר מכן נבחנו הדגימות, ותמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה. פרופילי העירור/פליטה הם 330–380/420 ננומטר עבור DAPI ו-510–560/590 ננומטר עבור Cy3.

וסטן בלוט (Western blot)
עבור רקמת עור של עכבר או מלנוציטים אנושיים, 50 מ"ג של רקמת העור או 2 × 105 תאים ו-1 מ"ל של תמיסת ליזיס RIPA, מועשרת במעכבי פרוטאז, הועברו לפרוטוקול בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. לאחר 30 דקות במי קרח, בוצעה צנטריפוגציה למשך 5 דקות ב-12,000 g כדי לאסוף את פראקציית העילוי. לאחר שנקבע ריכוז החלבון בשיטת BCA, תמיסת החלבון ו-5× ערבבו תמיסת טעינה SDS ביחס נפחי של 4:1, ולאחר מכן הרתיחו במכחול מתכתי ב- 95 °C במשך 5 דקות. לאחר שהמדגם הועבר לאלקטרופורזה ב-SDS-PAGE בריכוז של 10% במתח של 80V או 120V, הועברו החלבונים בהעברה חשמלית (electrotransfer) לממברנה של 0.22-µm ממברנת PVDF בזרם קבוע של 200 mA למשך שעה אחת44,45לאחר מכן, חסמו את הממברנות בטמפרטורת החדר במנער צנטריפוגלי למשך שעה אחת באמצעות 5% חלב דל שומן (שהוכן עם בופר TBST). לאחר מכן, חשפו את הממברנות לנוגדנים ראשוניים ספציפיים ל- ‌complex התאימות רקעיתית גדולה מחלקה I‌ (MHC I) (1:1000), IFN-γ (1:1000), IL-6 (1:1000), IL-15 (1:1000), β-אקטין (1:1000), SOD (1:1000), CAT (1:1000), גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPX-4) (1:1000), ו-FOXO3a (1:1000) ב- 4 °C במהלך הלילה. ולאחר מכן, הדמיונות נחשפו לנוגדן משני (1:10,000) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. נעשה שימוש בריאגנט כימילומנסנטי ECL לפיתוח וללכידת תמונות באמצעות ChemiScope 6100.

תגובת שרשרת פולימראז עם שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR)
ראשית, ה-RNA מהדגימה של רקמת עור של עכבר או ממלנוציטים אנושיים הופק בהתאם להוראות היצרן של ערכת מיצוי ה-RNA הכולל (total RNA). בהתאם להוראות ההפעלה של ערכת השעתוק ההפוך, פרמטרי מכשיר ה-PCR נקבעו כדלקמן: 25°C במשך 10 דקות, 42°C במשך 15 דקות, ו- 85°C במשך 5 דקות כדי לקבל דגימות cDNA. באופן דומה, הפרמטרים להגדרת מכשיר ה-PCR היו כדלקמן כדי להשיג מספר עותקים מספיק של DNA: דנטורציה ראשונית: 95°C למשך 5 דקות, מחזור אחד; דנטורציה: 95°C למשך 10 שניות, 40 מחזורים; אפשרה (Annealing) והארכה: 60°C למשך 30 שניות, 40 מחזורים. ‌הביטוי הנורמל של הגן המבוקש מחושב באמצעות הנוסחה הבאה: 2‑ΔΔCq (ΔΔCq = Cqמטרה‑Cqβאקטין-)46,47המידע על רצפי הפריימרים של הגנים עבור qRT-PCR מוצג ב- טבלה 1.

ניתוח ChIP-PCR
ניתוח ChIP-PCR בוצע בהתאם לפרוטוקול הקודם48. ראשית, התאים עברו קישור צולב (cross-linking) עם 1% formaldehyde למשך 10 דקות, ותמיסת glycine הוספה כדי להפסיק את תגובת הקישור הצולב. לאחר שטיפה עם PBS מקורר מראש המכיל PMSF, התאים עברו ליסיס באמצעות SDS lysis buffer המכיל PMSF. לאחר מכן, ה-chromatin DNA שובש למקטעים שגודלם נע בעיקר בין 200 ל-1,000 bp באמצעות ultrasonic cell disruptor, וגודל המקטעים אומת על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose. דגימות הכרומטין המשובש הושעו שוב ב-ChIP dilution buffer המכיל PMSF, ו-20µL מהדגימה נלקחו כקבוצת בקרת input. שאר הדגימות טופלו מראש עם Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA. לאחר מכן, הוסף 0.5µg של נוגדן ראשוני, ואחריו דגירה למשך לילה ב-4°C עם ניעור איטי. קבוצת הבקרה השלילית טופלה בכמות שווה של rabbit IgG. למחרת, הוספו חרוזי Protein A+G agarose כדי ללכוד את קומפלקסי האנטיגן-נוגדן, והקומפלקסים נשטפו ברצף עם low salt immune complex wash buffer, high salt immune complex wash buffer, LiCl immune complex wash buffer ו-TE buffer. הקומפלקסים שהושגו באמצעות אימונו-שיקוע (immunoprecipitated) הולוכו (eluted) באמצעות elution buffer, והן תוצרי ההלוכה והן הדגימות בקבוצת בקרת ה-input עברו טיפול בחום ב-65°C למשך 4 שעות כדי לשבור את הקשרים הצולבים. לאחר עיכול חלבונים באמצעות proteinase K, ה-DNA בודד באמצעות חילוץ phenol-chloroform ולאחריו השקיעה באתנול. ה-DNA המטוהר הומס ב-TE buffer ושימש לניתוח qRT-PCR בהמשך. מידע על רצפי הגנים עבור ChIP-PCR מוצג ב-Table 2.

האתרים הגנומיים המועמדים עבור ChIP-PCR נבחרים באמצעות חיזוי in silico באמצעות מאגר הנתונים JASPAR (https://jaspar.elixir.no/). באופן ספציפי, החוקרים שלפו את רצפי הפרומוטור המשתרעים על פני 2000 bp במעלה ה-TSS של הגנים CAT, SOD ו-GPX4. רצפים אלה נסרקו לאיתור מוטיבים של קישור FOXO3a באמצעות מטריצת משקלי מיקום (PWM) המתאימה. כדי לאזן בין הרגישות לספציפיות, קבעו המחברים סף של ציון פרופיל יחסי של >80%. מבין כל המוטיבים החזויים שעמדו בקריטריון זה, בחרו המחברים את שני האתרים המשוערים בעלי הציונים הגבוהים ביותר עבור כל גן כאזורים מועמדים לאימות באמצעות ChIP-PCR. לדוגמה, בגן CAT, האתרים שנבחרו ממוקמים ב-733- bp ו-1259- bp ביחס ל-TSS. הנוגדן anti-FOXO3a ששימש במחקר זה הוא נוגדן בדרגת ChIP הזמין מסחרית. כדי להבטיח ספציפיות, החלו המחברים שני ביקורות שליליות עצמאיות עבור כל בדיקת ChIP-PCR: נוגדן isotype IgG ולוכס גנומי שלילי. ביקרת ה-isotype IgG בוצעה כהסמכה חיסונית מקבילה באמצעות IgG לא-חיסוני מאותו מין. עבור הלוקס הגנומי השלילי, תכננו המחברים זוג פריימרים ספציפי המכוון לאזור שאינו קושר, שחסר בו כל מוטיב קונסנזוס חזוי של FOXO3a. אזור ביקורת זה אפשר למחברים לשלול העשרה הנובעת מגזירה מקרית של כרומטין או הגברה לא ספציפית של PCR. פי ההעשרה חושבו באמצעות אסטרטגיית נורמליזציה בת שלושה שלבים.

שלב 1: הזנת ΔCt מנורמל, ΔCt [IP מנורמל] = Ct[IP]-(Ct[Input]-log₂(DF))    (1)

ΔCt [IgG מנורמל] = Ct[IgG] - (Ct[Input] - log₂(DF)).     (2)

DF = מקדם דילול הקלט (Input Dilution Factor); בניסוי, DF = 10, כיוון שנעשה שימוש ב-10% קלט.

שלב 2: ΔΔCt בין IP ל-IgG:

ΔΔCt [IP/IgG] =ΔCt [normalized IP]-ΔCt [normalized IgG]      (3)

שלב 3: פי כמה העשרה (Fold enrichment) = 2(-ΔΔCt [IP/IgG]).       (4)

ניתוח סטטיסטי
הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן בהתבסס על לפחות שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 6.0). השוואה של נתונים בין קבוצות מרובות בעלות התפלגות נורמלית והומוגניות של השונות הוערכה באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA), ולאחריו מבחן post-test של Tukey. מובהקות סטטיסטית נקבעה עבור p < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ל-AMG אין רעילות כבדית-כלייתית בעכברי C3H/HeJ תקינים
כדי לזהות בבירור את הרעילות הפוטנציאלית של AMG לכבד ולכליות מנקודת מבט ניסויית, חוקרים ניהלו שלושה מינונים (60, 90 ו-120 mg/kg) שנחקרו בעבר בעכברי C3H/HeJ תקינים באמצעות הזנה בבלון קיבתי (gavage) 38. כפי שמוצג ב-איור 1, לאחר מתן תוך-קיבתי של AMG בשלושה מינונים למשך 21 ימים, מבנה האונה הכבדית היה ברור, כאשר ההפטוציטים היו מסודרים באופן מאורגן. הרקמות הקורטיקליות והמדולריות של הכליה היו תקינות, ולא נצפו נזקים או נגעים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ל-AMG עצמו אין רעילות ישירה. הוא עובר הידרוליזה על ידי אנזימים מיקרוביאליים במעיים או על ידי חומצה בקיבה, תהליך המייצר ומשחרר מימן ציאניד רעיל ביותר49. מימן ציאניד נספג לאחר מכן במהירות דרך מערכת העיכול אל זרם הדם ומתפשט ברקמות הגוף, ובכך גורם להיפוקסיה ברקמות של מערכת העצבים, מערכת הלב וכלי הדם ומערכת הנשימה50. מבחינת מנגנון הפעולה, מימן ציאניד נקשר ליוני הברזל בציטוכרום אוקסידאז, חוסם את שרשרת הנשימה התאית, מה שמוביל להיפוקסיה של הרקמות ולהפרעות מטבוליות תאיות, ומעורר הרע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תרומת המחברות:
שון הוא: חקירה, מתודולוגיה, כתיבה – גרסה מקורית. ג'ינסונג ליו, ג'יאווי וואנג, וז'ה דאי: ארגון נתונים. יוג'נג גונג, ויי לו, ו샤וואי שַה: תוכנה, ויזואליזציה ואימות. שון הוא: הקצאת מושגים, כתיבה – סקירה &עריכה, רכש מימון, ופיקוח

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות של מנהיגי מחוז סיצ'ואן (2024-221).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5×All-In-One MasterMix (עם ערכת AccuRT להסרת DNA גנומי)Applied Biological Materials Inc., ג'יאנגסו, סיןG492
βנוגדן לאקטיןAffinity Biosciences Co., Ltd., ווהאן, סיןAF7018
אמיגדליןChengdu Herbpurify Co., Ltd., צ'נגדו, סיןK-001-181216
נוגדן לקטלאזProteintech, ווהאן, סין66765-1-Ig
ערכה לבדיקת קטלאזElabscience, ווהאן, סיןE-BC-K031-M
עכברי C3H/HeJChengdu Yaokang Biotechnology Co., Ltd., צ'נגדו, סיןN000190
ערכה לבדיקת ChIPBeyotime Biotechnology, שנגחאי, סיןP2078
תווך גידול 254Gibco, Thermo Fisher Scientific, אמריקהM-254-500
סוכן צביעה DAPIServicebio, ווהאן, סיןG1012
Dispase IIShanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., שנגחאי, סיןS25046
EvaGreen Express 2×תערובת qPCR מוכנה (MasterMix) ללא צבעApplied Biological Materials Inc., ג'יאנגסו, סיןMasterMix-ES
Fast black HBSangon Biotech Co., Ltd., שנחאי, סיןA602008-0025
סרום עגל עובריכל הירוק13011-8611
מיקרוסקופ פלואורסצנציהSOPTOPCX40
נוגדן FOXO3aProteintech, ווהאן, סין10849-1-AP
מיקרוטום להקפאהThermoקריוטום E
נוגדן ל-Glutathione peroxidase 4Proteintech, ווהאן, סין67763-1-Ig
ערכה למדידת גלוטתיון פראוקסידאז 4Elabscience, ווהאן, סיןE-BC-K883-M
Image-pro plus 6.0Media Cybernetics, Inc., רוקוויל, מרילנד, ארה"ב——
קרם ImiquimodSichuan Mingxin Pharmaceutical Co. Ltd., צ'נגדו, סיןH20030129
נוגדן לאינטרפרון גמאProteintech, ווהאן, סין15365-1-AP
ערכה לגילוי interferon gammaElabscience, ווהאן, סיןE-EL-H0108 ו-E-EL-M0048
נוגדן לאינטרלוקין 6Proteintech, ווהאן, סין21865-1-AP
ערכה לבדיקת אינטרלוקין 6Elabscience, ווהאן, סיןE-EL-H6156 ו-E-EL-M0044
נוגדן לאינטרלוקין 15Affinity Biosciences Ltd., ווהאן, סיןDF2521
ערכה לזיהוי אינטרלוקין 15 (Interleukin 15 kit)Elabscience, ווהאן, סיןE-EL-H0222 ו-E-EL-M0728 
ערכה למדידת מלונדיאלדהיד (Malondialdehyde kit)Elabscience, ווהאן, סיןE-EL-0060
נוגדן MHCAffinity Biosciences Ltd., ווהאן, סיןDF8558
מיקרוסקופ אופטיZEISSPrimo Star
סכין לחיתוך פאראפיןThermo ScientificHM325
תוכנה לסריקה פתולוגית3DHISTECH (הונגריה)צופה שקופיות 2.5.0
תמיסת פניצילין-סינטרויד (Penicillin-synthroid solution)Biosharp, בייג'ינג, סיןBL505A
IgG של ארנבת Beyotime Biotechnology, שנגחאי, סיןA7016
ערכה לבדיקת ROSBeyotime Biotechnology, שנגחאי, סיןS0033M
נוגדן ל-Superoxide dismutase 1Proteintech, ווהאן, סין10269-1-AP
מכשיר להטמעה של רקמות Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd., ווהאן, סיןJB-P5
מחלץ מים מרקמה (Tissue hydroextractor)Thermo ScientificSTP420 ES
ערכה לבידוד RNA כוללForegene, צ'נגדו, סיןRE-03014
ערכה למדידת סך superoxide dismutaseElabscience, ווהאן, סיןE-BC-K020-M
וזלין לבןShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., שנגחאי, סיןP434227

מקורות

  1. Li XQ, et al. Burden of alopecia areata in China, 1990-2021: Global Burden of Disease Study 2021. Chin Med J (Engl). 2025;138:318-324.
  2. Rodríguez-Tamez G, Maskan-Bermudez N, Tosti A. Alopecia areata incognita: Current evidence. Dermatol Ther (Heidelb). 2025;15:635-645.
  3. Zhou J, et al. Global burden of alopecia areata and associated diseases: A trend analysis from 1990 to 2021. J Cosmet Dermatol. 2025;24:e70076.
  4. Jeon JJ, Lee S, Kim MS, Kim YS, Hong SH, Yon DK, et al. The burden of alopecia areata among United States, 2000-2021: A systematic analysis for the global burden of disease study 2021. J Am Acad Dermatol. 2025;S0190-9622(25)02673-8.
  5. Todorova L, Kluger N. Alopecia: A Google trends analysis of the past 5 years (2018-2023). Skin Appendage Disord. 2025;11:282-286.
  6. Pratt CH, King LEJr, Messenger AG, Christiano AM, Sundberg JP. Alopecia areata. Nat Rev Dis Primers. 2017;3:17011.
  7. Mistry J, Sibbald C. Clinical presentations and comorbidities of pediatric alopecia areata. Pediatr Dermatol. 2025;42 Suppl 1:5-11.
  8. Kuty-Pachecka M. Psychological and psychopathological factors in alopecia areata. Psychiatr Pol. 2015;49:955-964.
  9. Marahatta S, Agrawal S, Adhikari BR. Psychological impact of alopecia areata. Dermatol Res Pract. 2020;2020:8879343.
  10. Dainichi T, Iwata M, Kaku Y. Alopecia areata: What's new in the epidemiology, comorbidities, and pathogenesis J Dermatol Sci. 2023;112:120-127.
  11. Lintzeri DA, Constantinou A, Hillmann K, Ghoreschi K, Vogt A, Blume-Peytavi U. Alopecia areata - Current understanding and management. J Dtsch Dermatol Ges. 2022;20:59-90.
  12. Singh R, Kumar P, Kumar D, Aggarwal N, Chopra H, Kumar V. Alopecia areata: Review of epidemiology, pathophysiology, current treatments and nanoparticulate delivery system. Ther Deliv. 2024;15:193-210.
  13. Rizzetto G, De Simoni E, Gioacchini H, Molinelli E, Offidani A, Simonetti O. Fractionated CO2 laser in combination with topical tacrolimus for chronic alopecia areata: A case series study. Life (Basel). 2024;14:1128.
  14. Gasques L, de Brito FF, Zobiole R, Bortolini L, Assumpção VCC, Carvalho CL. Corticosteroid atrophy plaque on the scalp treated with 5-fluourouracil and bleomycin infusion in the MMP technique. Skin Appendage Disord. 2024;10:425-428.
  15. Lee D, et al. Serum levels of IL-18 and sIL-2R in patients with alopecia areata receiving combined therapy with oral cyclosporine and steroids. Exp Dermatol. 2010;19:145-147.
  16. Mlacker S, et al. A review on laser and light-based therapies for alopecia areata. J Cosmet Laser Ther. 2017;19:93-99.
  17. Jafari MA, Bazgir G, Hosseini-Baharanchi FS, Jafarzadeh A, Goodarzi A. Efficacy and safety of laser therapy and phototherapy in cicatricial and noncicatricial alopecia: A systematic review study. Health Sci Rep. 2024;7:e70180.
  18. Civaş E, Aksoy B, Aksoy HM, Eski M, Yucel K. Hair transplantation for therapy-resistant alopecia areata of the eyebrows: is it the right choice J Dermatol. 2010;37:823-826.
  19. King BA, Craiglow BG. Janus kinase inhibitors for alopecia areata. J Am Acad Dermatol. 2023;89:S29-S32.
  20. Chim I, Ghiya R, Sinclair RD, Eisman S. Novel investigational drugs for alopecia areata and future perspectives. Expert Opin Investig Drugs. 2024;33:441-449.
  21. Valdez-Zertuche JA, Ramírez-Marín HA, Tosti A. Efficacy, safety and tolerability of drugs for alopecia: A comprehensive review. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2025;21:347-371.
  22. Liu M, et al. Janus kinase inhibitors for alopecia areata: A systematic review and meta-analysis. JAMA Netw Open. 2023;6:e2320351.
  23. Sohn KC, et al. Effect of thioredoxin reductase 1 on glucocorticoid receptor activity in human outer root sheath cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;356:810-815.
  24. Sun C, Ding HH, Zhang L, Wang JL, Su MY. Co-regulatory mechanisms and potential markers of oxidative stress-related genes in vitiligo and alopecia areata. Skin Res Technol. 2024;30:e70001.
  25. Perlmutter J, et al. The role of reactive oxygen species in the pathogenesis of alopecia areata: A systematic review and meta-analysis. Skin Pharmacol Physiol. 2025;38:59-67.
  26. Xie B, Sun JY, Song XZ. Hair follicle melanocytes initiate autoimmunity in alopecia areata: A trigger point. Clin Rev Allergy Immunol. 2022;63:417-430.
  27. Shin JM, et al. The crosstalk between PTEN-induced kinase 1-mediated mitophagy and the inflammasome in the pathogenesis of alopecia areata. Exp Dermatol. 2024;33:e14844.
  28. Mustafa AI, Khashaba RA, Fawzy E, Baghdady SMA, Rezk SM. Cross talk between oxidative stress and inflammation in alopecia areata. J Cosmet Dermatol. 2021;20:2305-2310.
  29. Cohen JN, et al. Regulatory T cells in skin mediate immune privilege of the hair follicle stem cell niche. Sci Immunol. 2024;9:eadh0152.
  30. Kinoshita-Ise M, Martinez-Cabriales SA, Alhusayen R. Chronological association between alopecia areata and autoimmune thyroid diseases: A systematic review and meta-analysis. J Dermatol. 2019;46:702-709.
  31. Chen DY, Yang XY, Wang HX, Fan WL, He YQ. Molecular mechanism of polygonum multiflorum in the treatment of androgenic alopecia: based on bioinformatics and molecular docking method. Diagnosis and Therapy Journal of Dermato-Venereology 2022;29:101–108.
  32. Iwasa K, et al. Long term administration of loquat leaves and their major component, ursolic acid, attenuated endogenous amyloid-β burden and memory impairment. Sci Rep. 2023;13:16770.
  33. Makovi CM, Parker CH, Zhang K. Determination of amygdalin in apricot kernels and almonds Using LC-MS/MS. J AOAC Int. 2023;106:457-463.
  34. Li XJ, et al. Identifying the active components and mechanisms of Persicae Semen in treating androgenetic alopecia: Insights from network pharmacology and experimental evaluations. J Ethnopharmacol. 2025;347:119755.
  35. Wang Q, et al. Amygdalin alleviates psoriasis-like lesions by improving skin barrier function. Arch Dermatol Res. 2025;317:115.
  36. Li SY, et al. Effects of amygdalin on ferroptosis and oxidative stress in diabetic retinopathy progression via the NRF2/ARE signaling pathway. Exp Eye Res. 2023;234:109569.
  37. Kimura K, Liu YH, Hsieh CL. Amygdalin's neuroprotective effects on acute ischemic stroke in rats. J Ethnopharmacol. 2025;345:119621.
  38. He X, et al. Amygdalin ameliorates alopecia areata on C3H/HeJ mice by inhibiting inflammation through JAK2/STAT3 pathway. J Ethnopharmacol. 2024;331:118317.
  39. He X, et al. The antiinflammatory effects of Xuefu Zhuyu decoction on C3H/HeJ mice with alopecia areata. Phytomedicine. 2021;81:153423.
  40. Ma LP, et al. Melatonin inhibits senescence-associated melanin pigmentation through the p53-TYR pathway in human primary melanocytes and the skin of C57BL/6 J mice after UVB irradiation. J Mol Med (Berl). 2023;101:581-593.
  41. Hou Y, et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. J Ethnopharmacol. 2020;249:112426.
  42. Hou Y, Fan FH, Xie N, Zhang Y, Wang XB, Meng XL. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 2024;128:155529.
  43. Hou Y, et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 2023;109:154568.
  44. Fan FH, et al. Association between systemic immune-inflammation indexes and Nuodikang capsule’s protection in LPS-induced acute lung injury in mice. Phytomedicine. 2025;147:157229.
  45. Wang XB, et al. Mechanistic insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 cells. JoVE. 2025;218:e66923.
  46. Wang XB, et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. J Ethnopharmacol. 2019;241:111801.
  47. Fan SJ, et al. PRMT5 encourages cell migration and metastasis of tongue squamous cell carcinoma through methylating ΔNp63α. Cell Death Differ. 2026; 33:465-479.
  48. Zhao Y, et al. Integrated analysis reveals that EGR1 promotes epithelial IL33 production in T2 asthma. J Transl Med. 2025;23:203.
  49. He XY, Wu LJ, Wang WX, Xie PJ, Chen YH, Wang F. Amygdalin - A pharmacological and toxicological review. J Ethnopharmacol. 2020;254:112717.
  50. Alan-Albayrak E, Simonsen U. Cyanide beyond toxicity: A systematic review of its effects on vascular function. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2025;137:e70124.
  51. Lachowicz JI, Alexander J, Aaseth JO. Cyanide and cyanogenic compounds-toxicity, molecular targets, and therapeutic agents. Biomolecules. 2024;14:1420.
  52. Jaszczak-Wilke E, Polkowska Ż, Koprowski M, Owsianik K, Mitchell AE, Bałczewski P. Amygdalin: Toxicity, anticancer activity and analytical procedures for its determination in plant seeds. Molecules. 2021;26:2253.
  53. Deeths MJ, Endrizzi BT, Irvin ML, Steiner LP, Ericson ME, Hordinsky MK. Phenotypic analysis of T-cells in extensive alopecia areata scalp suggests partial tolerance. J Invest Dermatol. 2006;126:366-373.
  54. Garzorz N, et al. Dissecting susceptibility from exogenous triggers: the model of alopecia areata and associated inflammatory skin diseases. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2015;29:2429-2435.
  55. Belpaire A, Demeyer A, Van Caelenberg E, van Geel N, Speeckaert R. The AhR pathway is dysregulated in alopecia areata. J Transl Autoimmun. 2025;10:100282.
  56. Gilhar A, Schrum AG, Etzioni A, Waldmann H, Paus R. Alopecia areata: Animal models illuminate autoimmune pathogenesis and novel immunotherapeutic strategies. Autoimmun Rev. 2016;15:726-735.
  57. Oelert T, Gilhar A, Paus R. T-cell "induced-self" MHC class I/peptide complexes may enable "de novo" tolerance induction to neo-antigens occurring outside of the thymus: Lessons from the hair follicle. Exp Dermatol. 2017;26:529-531.
  58. Freyschmidt-Paul P, et al. Interferon-γ-deficient mice are resistant to the development of alopecia areata. Br J Dermatol. 2006;155:515-521.
  59. Lensing M, Jabbari A. An overview of JAK/STAT pathways and JAK inhibition in alopecia areata. Front Immunol. 2022;13:955035.
  60. Suzuki T, et al. Interleukin-15 is a hair follicle immune privilege guardian. J Autoimmun. 2024;145:103217.
  61. Fitzhugh MH, Hansen JG, Jabbari A, Berrebi KG. Pathophysiology of Alopecia Areata in the Pediatric Patient. Pediatr Dermatol. 2025;42:24-30.
  62. Ma YQ, Sun Z, Li YM, Xu H. Oxidative stress and alopecia areata. Front Med (Lausanne). 2023;10:1181572.
  63. Bakry OA, Elshazly RM, Shoeib MA, Gooda A. Oxidative stress in alopecia areata: A case-control study. Am J Clin Dermatol. 2014;15:57-64.
  64. Peterle L, Sanfilippo S, Borgia F, Cicero N, Gangemi S. Alopecia areata: A review of the role of oxidative stress, possible biomarkers, and potential novel therapeutic approaches. Antioxidants (Basel). 2023;12:135.
  65. Yang X, et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma promote hair regeneration by regulating the SIRT1/FoxO3a pathway to alleviate oxidative stress. Regen Ther. 2025;30:710-718.
  66. Xu SC, Huang P, Yang JH, Du HX, Wan HT, He Y. Calycosin alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by repressing autophagy via STAT3/FOXO3a signaling pathway. Phytomedicine. 2023;115:154845.
  67. Tang QY, et al. Orlistat facilitates immunotherapy via AKT-FOXO3a-FOXM1-mediated PD-L1 suppression. J Immunother Cancer. 2025;13:e008923.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

טיפול באמיגדליןעכברי C3H/HeJמיני הלד (ROS)superoxide dismutaseגלוטתיון פרוקסידאזWestern Blotתגובה דלקתית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.