פרוטוקול זה מתאר מודל של אוטם שריר הלב ex vivo בלב עכבר מבודד תחת פרפוזיה קריסטלואידית. גישה זו עוקפת משתנים סיסטמיים, ובכך מאפשרת לחוקרים להעריך ישירות השפעות קרדיאליות בהיעדר גורמים חיצוניים שעלולים להשפיע על הישרדות התאיים השריריים של הלב (cardiomyocytes), ולבחון התערבויות פרמצבייות מקומיות.
מאמר שיטה
Ex Vivo מודל לאוטם בשרי בלב עכבר המבוסס על פרפוזיה בקריסטלואיד
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אוטם שריר הלב (MI) ניסיוני מודל לרוב בבעלי חיים באמצעות חסימה זמנית של העורק הכלילי השמאלי היורד (LAD) או, ברמה התאית, באמצעות פרוטוקולים של היפוקסיה–רי-אוكسגנציה. כמודל חלופה לאיסכמיה ברמת האיבר, לב בביצוע פרפוזיית Langendorff נותר כלי מרכזי לחקירת ההשפעות של הפרעות פיזיולוגיות והתערבויות פרמקולוגיות על הגנה לבבית (cardioprotection). כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה הבסיסית והכללים היסודיים הנדרשים להקמת מודל של איסכמיה/reperfusion אזורית של שריר הלב בלב עכבר מבודד. בקצרה, בעקבות עצירה קרדיופלגית, ה-LAD נקשר לאחר שטיפה קצרה ב-PBS קר מאוד. לאחר מכן הלב הותקן על מכשיר Langendorff ועבר פרפוזיה עם בופר מחומצן עשיר ברכיבי תזונה ב-37°C תחת לחץ פרפוזיה קבוע של 110 cmH₂O. משך האיסכמיה של שריר הלב השרה למשך 30, 45, 60, 90 ו-120 min, ולאחריהם 90 min של reperfusion. חיוניות התאי השריר הלבבי וגודל האוטם הוערכו באמצעות גישת צביעה מיקרוסקופית ב-2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC). הדגמנו כי מודל ה-MI ex vivo הניב באופן אמין פגיעה בשריר הלב הניתנת לשחזור, שאופיינה באובדן הדרגתי של תאי שריר לבביים חיוניים בתוך אזור האוטם ככל שמשך האיסכמיה התארך. בנוסף, נדרשו לפחות 30 min של reperfusion כדי להשיג הגדרה ברורה של שריר הלב המוהם באמצעות TTC. גישה זו עוקפת משתנים מערכתיים, ובכך מאפשרת לחוקרים להעריך ישירות השפעות לבביות בהיעדר השפעות רגולטוריות חיצוניות, כגון גורמים הומורליים במחזור הדם וחדירה של תאי מערכת החיסון, שעלולים להשפיע על התקדמות ה-MI, ולבחון התערבויות פרמצבטיות מקומיות. לפיכך, מודל ה-MI ex vivo מהווה פלטפורמה שימושית לחקירת מנגנוני הגנה לבביים הפועלים ישירות על תאי שריר הלב.
מבוא
אוטם בשריר הלב (MI) מתרחש כאשר זרימת הדם בעורקים הכליליים נפסקת, מה שגורם למוות של רקמות ולליקוי תפקודי חמור. בעוד שנושא זה נחקר בדרך כלל באורגניזמים שלמים, המונח יכול להתייחס ל-MI אזורי המוגבל למבני לב ספציפיים, או למודלים מעבדתיים של לב מבודד ex vivo (למשל, פרפוזיה של Langendorff) המשמשים לחקר אוטמים בהיעדר השפעה מערכתית1. ככזה, לב בפרפוזיית Langendorff שימש כמודל ניסויי חסון ומבוסס לחקר פגיעה איסכמית בשריר הלב במשך יותר מ-50 שנה2.
מודל MI ex vivo בלב מבודד מציע מספר יתרונות, כולל בקרה מדויקת על הסביבה הניסיונית והיכולת להעריך את ההשפעות הישירות של התערבויות, כגון חומרים פרמקולוגיים, על המיוקרדיום באופן בלתי תלוי בהשפעות סיסטמיות, כולל גורמים הומורליים במחזור הדם, רכיבי דם ובקרה נוירו-הומורלית3. באמצעות מזעור של גורמים מבלבלים אלו, מודל ה-ex vivo מספק גישה צפויה וניתנת לשחזור יותר מאשר מודלים in vivo, ובכך הוא מאפשר חקירה קפדנית של תהליכי המחלה והמסלולים המולקולריים המעורבים ב-MI4.
בלבבים מבודדים, ניתן להשרות איסכמיה מיקרדיאלית באופן גלובלי או אזורי5. במודל של MI גלובלי, זרימת הפרפוזאט דרך כל מחזור הדם הכלילי מופסקת לחלוטין, בעוד שבמודל של MI אזורי, רק העורק הכלילי השמאלי היורד (LAD) נחסם באופן זמני באמצעות קשירה, מה שמוביל לפגיעה איסכמית המוגבלת לשריר הלב (myocardium) המרוחק מאתר הקשירה. למרות שמודל ה-MI הגלובלי פשוט לביצוע מבחינה טכנית, יש לו מספר מגבלות המצמצמות את יישומו במחקרים של הגנה לבבית (cardioprotection)6. מגבלה מרכזית אחת היא שמשך האיסכמיה מוגבל על ידי עמידותו של הלב כולו, מה שמקשה על השראת איסכמיה ממושכת, עם סבירות לאוטם טרנסמורלי הדומה למצבים in vivo7. יתרה מכך, למרות שמודלים ex vivo מספקים בדרך כלל הדירות מצוינת כאשר משכי האיסכמיה והרפרופוזיה נשלטים בקפידה, פרוטוקולים אלו משתנים במידה ניכרת בין מעבדות. שונות זו מדגישה את הצורך בסטנדרטיזציה ואפיון טובים יותר של לב עכבר מבודד, במיוחד מכיוון שפרטים מתודולוגיים קריטיים רבים נותרו לא מתוארים מספיק בספרות8.
מצד שני, הקמה של מודל MI אזורי היא מאתגרת יותר מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים מספר שינויים ואסטרטגיות מעשיות לאופטימיזציה של השראה של MI אמינה ex vivo בלב עכבר מבודד, ובמיוחד להערכת התערבויות פרמקולוגיות למטרת cardioprotection9,10. לפיכך, פרוטוקול MI ex vivo משופר זה, המשתמש בלב עכבר בבישוף Langendorff, מספק פלטפורמה יעילה להערכה ישירה של הישרדות השריר הלבבי בעקבות התערבויות טיפוליות.
פרוטוקול
מודל הלב המבוהק המבודד המתואר כאן הוא ניסוי חריף ללא הישרדות, ואושר על ידי הרשויות המקומיות (O1019/25, LANUV של נורדריין-וסטפאלן, גרמניה). כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות ARRIVE ולמדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה. הציוד והכימיקלים הדרושים לניסויים מפורטים בטבלת החומרים.
1. הקמה של מערכת רטרו-פרפוזיה של לנגנדורף (Langendorff) עבור לב עכבר מבודד
הערה: מערכת המונעת על ידי כוח הכבידה ללא רסריקולציה תוכננה כדי לספק פרפוזאט קריסטלואידי מחומצן (בופר Krebs-Henseleit, KHB) ללב עכבר מבודד בלחץ קבוע של 110 cmH2O (איור 1A).
- יש לנקות את כלי הזכוכית של מערכת הלנגנדורף (Langendorff) באמצעות 0.1 M/L HCl ו-100% ethanol, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים לפני הרכבת המערכת.
- שקלו את כל הכימיקלים הדרושים להכנה של 2 L של KHB משופר, בהתאם לריכוזים הסופיים הבאים (mM): 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO4·7H2O, 1.21 KH2PO4, 2.52 CaCl2·2H2O, 24.88 NaHCO3, 8.30 D-glucose, 2.0 sodium pyruvate.
- המיסו את כל הכימיקלים למעט CaCl₂ במים מזוקקים פעמיים בבีกקר של 2 L, תוך כדי הבעבוע רציף של Carbogen (95% O₂/5% CO₂) למשך 10 min לפחות כדי להביא את ה-pH לשיווי משקל בערך 7.4.
- הוסיפו את ה-CaCl₂ לתמיסה לאחר מכן כדי למנוע שקיעה.
- המשיכו להבעבע את התמיסה עם Carbogen למשך 10 min נוספים.
- סננו את תמיסת ה-KHB תחת ואקום דרך מסנן ממברנה של 0.2 µm כדי להסיר חלקיקים קטנים שעלולים לחסום את המיקרו-וסקולטורה הכלילית.
- העבירו את תמיסת ה-KHB המסוננת למכל זכוכית של 2 L הממוקם באמבט מים שחומם מראש ל-37 °C.
- חברו את מכל ה-KHB לעמוד הלחץ מזכוכית, כך ש-KHB מחומצן ימלא באופן רציף את העמוד באמצעות הלחץ שנוצר על ידי גז ה-Carbogen במכל.
- וודאו שמערכת צינורות המוצא נקייה מבועות אוויר.
- הביאו את תמיסת ה-KHB לשיווי משקל עם Carbogen למשך 30 min נוספים לפני תחילת הניסוי.
2. בידוד וקנולציה של הלב
הערה: בניסויים הנוכחיים נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים במשקל 20–25 g. יש לתעד את כל הפרוצדורות הניסיוניות כראוי בהתאם לתקנות המקומיות, כולל הרציונל, התאריך ושיטת ההמתה (euthanasia).
- הנח בעדינות את העכבר בתא השראה המכיל 5% isoflurane (v/v) להשראת הרדמה.
- אשר את עומק ההרדמה על ידי היעדר מוחלט של תגובה לצביטה חזקה בבהונות, ולאחר מכן העבר לשולחן הניתוח. בצע קטילה מיידית של העכבר באמצעות פריקה צווארית, כפי שמעידים היעדר נשימה ואובדן טונוס שרירי בחלק התחתון של הגוף.
- גזור את כלוב הצלעות משני הצדדים לכיוון עצם החזה כדי לחשוף במלואו את הלב ואת האביון העולה (ascending aorta).
- אחוז ברקמה החוץ-לבבית באמצעות פינצטה והוצא את הלב.
- הנח את הלב בכלי זכוכית קטן שקולל מראש ומכיל 50 mL של תמיסת KHB קרה מאוד למשך 30 s לפחות כדי להשריות עצירה קרדיופלגית.
הערה: מכיוון שהפעילות הלבבית רגישה מאוד לטמפרטורה, הלב נעצר לחלוטין על ידי טבילה בתמיסת KHB קרה מאוד. - העבר את הלב על גבי פד כותנה שקולל מראש והורטב ב-KHB, המונח בתוך צלחת מתכת שבה הותקנה מערכת קנולות המחוברת לברז תלת-דרכי. (איור 1B).
הערה: מערכת הפרפוזיה צריכה להיות נקייה מבועות אוויר. - הכן מראש קשר חצי-ריבועי רפוי באמצעות חוט משי 5-0 בקצה הדיסטלי של הקנולה.
- בצע דיסקציה זהירה להסרת התימוס, רקמה חיבורית ושאריות רקמות חוץ-לבביות (כולל הריאות והוושט) כדי לחשוף ולגזום את שורש האביון (aortic root).
הערה: ודא כי קיים אורך מספיק של האביון העולה להצלחת הקנולציה. - העמד את הלב על הקנולה ואבטח אותו באמצעות התפר שהוכן מראש.
- שטוף את הלב עם 5 mL של PBS קר מאוד כדי להוציא שאריות דם ממחזור הדם הכלילי.
3 איסכמיה וreperfusion של השריר הלבבי Ex vivo
הערה: איסכמיה מיקארדיאלית גלובלית הושרה על ידי הפסקה פשוטה של פרפוזיית הלב, בעוד שאיסכמיה מיקארדיאלית אזורית נוצרה על ידי קשירה זמנית של ה-LAD תחת מיקרוסקופ סטריאו.
- ממרכזו את ה-LAD בשדה הראייה על ידי סיבוב עדין של הלב באמצעות כיונון פד הכותנה שמתחתיו. ה-LAD הפך לשקוף וניתן להבחנה בבירור מהמיוקרדיום שסביבו במהלך פרפוזיה של PBS.
- העבירו מחט קונית הנושאת תפר פוליפרופילן 8–0 מתחת ל-LAD, 1 mm מתחת לשוליים התחתונים של העלייה השמאלית.
הערה: ודאו שה-LAD נמצא במרכז בין שני אתרי הדקירה כדי למנוע פגיעה כלי דם הנגרמת מהקשירה. - הניחו פיסת pledget רכה מעל ה-LAD.
- הדקו את התפר בחוזקה כדי להפסיק את הפרפוזיה במקטע שדיסטלי לאתר הקשירה.
- העבירו את הלב הקנולי למיקרו-מכשיר Langendorff והתחילו פרפוזיה רטרוגרדית.
- טבלו את הלב באמבט איברים עם מעטפת מים כדי לשמור על טמפרטורה קבועה (37 °C) לאורך תקופת הניסוי.
- נטרו את שיא זרימת כלי הדם הכליליים ואת זרימת מצב היציבה (טבלה 1).
- בנקודות הזמן שנקבעו לאיסכמיה של המיוקרדיום (ראו סעיף תוצאות), הפסיקו את הפרפוזיה והוציאו את הלב הקנולי ממכשיר הפרפוזיה.
- טבלו מיד את הלב ב-KHB קר מאוד (4 °C) כדי להפסיק לחלוטין את התכווצות הלב.
- הניחו את הלב בחזרה על פד הכותנה בצלחת המתכת שקוללה מראש ושחררו את קשירת ה-LAD.
- במחקרי התערבות פרמקולוגית, הזריקו בשלב זה 5 µL של Interleukin-6 (IL-6, 0.1 mg/mL) לדופן הקדמית המשתחרת באמצעות מזרק אינסולין 30 G.
- החזירו את הלב הקנולי למכשיר הפרפוזיה וחזרו לפרפוזיה של הלב (reperfusion).
4. הערכת פגיעה בשריר הלב והישרדות
הערה: צביעה ב-2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) מסמנת שריר לב (myocardium) חיוני בצבע אדום כהה, בעוד שרקמה שעברה אינפארקציה/נמק מופיעה בגוון בז' לאחר קיבוע בתמיסת Zamboni.
זהירות: TTC נחשב בדרך כלל לחומר מסוכן ודורש טיפול זהיר שכן הוא עלול לגרום לגירוי קל של העור, לגירוי חמור של העיניים, והוא מזיק בשאיפה. יש להשליך פסולת ושאריות בהתאם לדרישות הרשויות המקומיות.
- הפסיקו את הפרפוזיה 90 דקות לאחר הרפרופוזיה והטביעו מיד את הלב ב-KHB קר מאוד כדי לעצור את התכווצות הלב.
- חבר את הקנולה למזרק של 3 מ"ל הממול מראש בתמיסת צביעה של TTC (1% TTC מומס ב-PBS) באמצעות ברז תלת-כיווני.
- הזרק 1 מ"ל של תמיסת TTC לתוך הלב, חזור על ההזרקה שלוש פעמים, והחדר נפח כולל של 3 מ"ל לאורך 15 דקות.
- כסו את הלב בנייר רקמה לח כדי למנוע התייבשות של פני השטח.
- הנח את הלב בתוך מבחנה לצנטריפוגה המכילה 3 מ"ל תמיסת TTC ב- 4 °C במהלך הלילה.
- הכנת בלוק רקמה באמצעות תרכובת OCT (Optimal Cutting Temperature).
הערה: ניתן לשמור את גוש הרקמה בטמפרטורה של −80 °C למשך מספר חודשים עד לניתוח נוסף. - הצמד את בלוק הרקמה למחזיק (chuck) של הקריוסטט באמצעות תרכובת OCT.
- בצעו חיתוכים קפואים (Cryosection) של הלב באופן רציף בעובי של 50 µm ואסוף כל 10th חתך; בדרך כלל מתקבלים כ-8 פרוסות רקמה ללב.
- סדרו את כל 8 הפרוסות על גבי זכוכית מיקרוסקופ אחת וייבשו אותן בעזרת מייבש שיער למשך 2–3 דקות.
- טבול את הפרוסות בתא צביעה המכיל תמיסת Zamboni (מקבע המכיל 2% פאראפורמאלדהיד ו-0.4% חומצה פיקרית, משקל לנפח) למשך לילה ב- 4 °C.
אזהרה: מקבע זמבוני (Zamboni’s fixative) עלול לגרום לתגובת עור אלרגית וחשוד כגורם למוטציות גנטיות ולסרטן. יש להשליך פסולת ושאריות בהתאם לתקנות הרשויות המקומיות. - שטפו את הפרוסות 3 פעמים ב-PBS וכסו את הנתחים בתמיסת קיבוע (mounting medium).
הערה: ניתן לאחסן דגימות לב שנצבעו ב-TTC בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים. - רכשו תמונות של הלב באמצעות מיקרוסקופ אור עם עדשה אובייקטיבית של 1.25x תוך שימוש בתוכנת CellSens.
- לצורך כימות גודל האוטם, ייבא את קובצי התמונה לפלטפורמת ImageJ.
- מתוך תפריט ImageJ, בחר/י תמונה -> כוון -> סף צבע כדי לפתוח את חלון סף הצבע (Color Threshold windowאיור 2B).
- בחר אזור עניין (ROI) קטן בתוך נתח הלב, והשתמש בשריר הלב החי בצבע אדום כהה וברקמה שעברה אינפקט/נמק בצבע בז' כנקודות ייחוס לצבע.
- לחץ על דגימה ב- סף צבע הגדירו חלון וכוונו את טווח הרוויה עד שהאזור הנבחר יתאים בדיוק לאזור צבע היעד.
- לחץ על בחירה כדי להגדיר את השטח התואם לצבע שנבחר.
- מתוך התפריט של ImageJ, בחר את נתח -> מדודשטח האזור שנבחר, שידווח בפיקסלים, יוצג בחלון התוצאות (Results).
- ייצא את נתוני המדידה לגיליון אקסל (Excel) לצורך חישוב גודל השבץ האיסכמי בשיטה פלנימטרית.
- כדי לכמת את השריר הלבבי החיוני בתוך האזור שעבר אוטם, הגדירו את אזור העניין (ROI), בעיקר בדופן הפרונטלית של החדר הלבבי שבה התרחש האוטם ושם הוזרק IL-6.
- פתח את ה- מנהל ROI (Region of Interest) מתפריט ImageJ ולחצו על הוסף לשמירת ה-ROI הנבחר לרשימת ה-ROI (איור 2C).
- השתמשו בפונקציות "Sample" ו-"Selection", כפי שמתואר לעיל, כדי לתחום את השריר הלבבי החיוני (אדום כהה).
- הוסיפו את האזור החי שנבחר לרשימת ה-“ROI Manager”, ולאחר מכן בחרו וְ כדי לקבל את החפיפה בין ה-ROI לבין השריר הלבבי החי (viable myocardium).
- מדוד את שטח השריר הלבבי (myocardium) החיוני וחשב את שיעור ההישרדות של התאי השריריים הלבביים (cardiomyocytes) בתוך ה-ROI שנבחר.
הערה: פרטים מתודולוגיים לגבי צביעת TTC וכימות גודל השחור (infarct size) דווחו בעבר11.
תוצאות
בפלטפורמת ה-MI מסוג ex vivo, נבחנו שני פרוטוקולים של איסכמיה בלב עכבר מבודד. איסכמיה גלובלית, שנעשה בה שימוש נרחב במחקרי MI מסוג ex vivo, גרמה לפגיעה איסכמית הטרוגנית בכל רחבי הלב. באמצעות גישת זיהוי מיקרוסקופית מהימנה וברזולוציה גבוהה המבוססת על TTC12, הודגם כי השריר העמדי של העליות (atrial myocardium) והאזור האפקלי היו עמידים יחסית לאיסכמיה ונשארו חיוניים לאחר 45 min של איסכמיית no-flow גלובלית (איור 2A, פאנל עליון). לעומת זאת, MI אזורי גרם לפגיעה איסכמית מקומית בשריר הלב המרוחק מאתר הליגציה של ה-LAD. בתנאים אלו, חלקים מהשריר התת-אפיקרדיאלי נותרו חיוביים ל-TTC, דבר המעיד על שימור של רקמה חיונית (איור 2A, פאנל תחתון). ממצאים אלו חושפים דפוסים שונים של הישרדות שריר הלב בין שני פרוטוקולי האיסכמיה.
המשך הבדיקה של משך הזמן המינימלי של איסכמיה ורפרפוזיה הנדרש כדי להשרות אוטם בשריר הלב באופן מהימן וניתן לשחזור בוצעה בלב עכבר מבודד. הפגיעה בשריר הלב הגבירה בהדרגה ככל שמשך האיסכמיה הוארך מ-30 min ל-120 min (איור 3A). בולט כי גודל האוטם יותר מהכפיל את עצמו בין 30 min (n = 3) ל-45 min (n = 5) של איסכמיה, ונראה כי הגיע למישור (plateau) כאשר משך האיסכמיה הוארך ל-60 min (n = 5), 90 min (n = 4), ו-120 min (n = 3) (איור 3B). ממצאים אלו מעידים כי החיות של שריר הלב רגישה מאוד למשך האיסכמיה מעבר ל-30 min. בהשוואה למודל MI in vivo (ivMI, n = 5), מודל MI ex vivo (evMI, n = 8) הניב גדלי אוטם כמעט זהים תחת משכי איסכמיה ורפרפוזיה דומים (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27), מה שמרמז כי הפגיעה בשריר הלב לא הושפעה באופן מהותי מפרפוזיה של קריסטלואידים. עם זאת, לבבות evMI הפגינו דפנות פרוזדור עבות יותר ולומן פרוזדור מצומצם, ככל הנראה עקב בצקת בשריר הלב הקשורה לפרפוזיה של קריסטלואידים (איור 3C).
תוך ניצול הסביבה המבוקרת יחסית, שהיא חופשייה מהשפעות חוץ-לבביות, הוערכו ההשפעות הקרדיופרוטקטיביות של הזרקת IL-6 תוך-שריר הלב. בלבבות ביקורת שטופלו ב-PBS, נותרו תאי שריר לבב חיוניים (viable CMs; בצבע אדום כהה), מפוזרים אך מדידים, בתוך האזור המקור/הנמקרי (בז'וף), גם לאחר 45 min של איסכמיה (איור 4; 1.05% ± 0.44%, SEM, n = 4). באופן בולט, הזרקה תוך-שריר הלב של IL-6 (i.m.; חצים) הגבירה באופן משמעותי את כמות תאי ה-CM החיוניים, אשר התרכזו בעיקר סביב אתר ההזרקה בתוך אזור העניין (ROI; 4.08% ± 0.99%, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-test). ממצאים אלו מרמזים כי IL-6 עשוי לשפר את הישרדות תאי שריר הלב בעקבות פגיעה איסכמית.
לבסוף, למודל ה-MI הנוכחי ex vivo ישנם מספר מכשולים פוטנציאליים העלולים להשפיע על השחזור של תוצאות הניסוי. כפי שמוצג ב-איור 5, החלקה של הקשירה עלולה להוביל לחסימה לא מספקת של ה-LAD ולהישרדות נרחבת של השריר הלבבי (4/168), ובמקביל, פרפוזיה חוזרת (reperfusion) חלקית עלולה להתרחש כאשר ענפים של ה-LAD נפגעים (12/168). בנוסף, תסביב אוויר במהלך הקניולציה של אבי העורקים עלול לגרום לפגיעה בשריר הלבבי (חצים, 7/168), דבר המקשה על ההבחנה בין פגיעה איסכמית לפגיעה תסביבית לצורך כימות. לבסוף, צביעת TTC לא מספקת עלולה להתרחש כאשר הלב עובר פרפוזיה מרובה מדי (11/168), דבר המקשה משמעותית על הגדרת שטח העשקה (infarct area).
איור 1סכימה של מערך הניסוי. מערכת לנגנדורף (Langendorff) בעלת לחץ קבוע, המונעת על ידי כוח הכבידה וללא סירקולציה, תוכננה לספק בופר קרבס-הנסלייט (KHB) מחומצן ועשיר בחומרים מזינים בלחץ הידרוסטטי קבוע של 110 סמ"ז מים.₂ראשית, בוצע חימום מקדים של KHB ל- 37 °C במאגר ומוזן לעמודה בלחץ בעלת מעטפת מים, שבה נשמר לחץ הידרוסטטי קבוע של 110 cmH2שומרה ברמה קבועה דרך ווסת לחץ. הלב המבושף הוטבל באמבט איברים בעל מעטפת מים ובגובה מתכוונן כדי לשמור על טמפרטורה קבועה של 37 °C לאורך תקופת הניסוי (A). אוטם שריר הלב (Myocardial infarction) הושרה באמצעות קשירה זמנית של העורק הכלילי הקדמי השמאלי (LAD), לאחר עצירה קרדיופלגית על פד כותנה בתוך צלחת מתכת שקוללה מראש (Bהפרוצדורה בוצעה תחת מיקרוסקופ סטריאומקרוסקופ. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה מורחבת של דמות זו.
איור 2: השוואה בין אוטם שריר לב (MI) אזורי לגלובלי וקביעת גודל השברון. MI גלובלי גורם לפגיעה איסכמית בכל רחבי הלב, כפי שמעיד הצביעה הצהובה בתמונות מיקרוסקופיות של TTC. נראה כי שריר הלב בעלייה ובאזור האפיקס (החוד) עמידים יותר לאיסכמיה ונשארו חיוניים לאחר 45 min של איסכמיה גלובלית ללא זרימה (פאנל עליון ב-A). MI אזורי גורם לפגיעה איסכמית בשריר הלב המרוחק מאתר הליגציה של ה-LAD. במצב זה, חלקים משריר הלב התת-אפיקרדי얼 נצבעים באדום, מה שמעיד על שימור של רקמה חיונית (פאנל תחתון ב-A). גודל השברון כומת באמצעות ImageJ, כאשר השטח המוטמא/נקרוטי ושריר הלב החיוני הוגדרו על בסיס צבעי הצביעה המובחנים שלהם (B). הישרדות התאי הלב (Cardiomyocyte) בתוך אזור העניין (ROI) חושבה על ידי קביעת אחוז הצביעה האדומה-כהה ב-ROI שנבחר (C). סרגי מידה: 1 mm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעת משך האיסכמיה על גודל האוטם. הפגיעה בשריר הלב החמירה באופן הדרגתי ככל שמשך האיסכמיה הוארך מ-30 min עד 120 min (A). גודל האוטם גדל ביותר מפי שניים בין 30 min (n = 3) ל-45 min (n = 5) של איסכמיה, ונראה כי הגיע למישור (plateau) עם הארכת משך האיסכמיה ל-60 min (n = 5), 90 min (n = 4), ו-120 min (n = 3) (B). בהשוואה למודל MI in vivo (ivMI, n = 5), מודל MI ex vivo (evMI, n = 8) הפיק גדלי אוטם כמעט זהים תחת משכי איסכמיה דומים (36.88% ± 3.91% vs. 37.8% ± 2.17%, p = 0.27, Student’s t-Test). לבבות ה-evMI הפגינו דופן פרוקיבט עבה יותר ולומן ונטריקולרי מצומצם, ככל הנראה עקב בצקת של שריר הלב הקשורה לפרפוזיה של קריסטלואידים (C). פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע (SDM). סרגי קנה מידה: 1 mm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: IL-6 שיפר את הישרדות הקרדיומיוציטים בעקבות פגיעה איסכמית.מתן IL-6 תוך-שרירי (i.m.) במודל evMI הניב מספר מדיד של קרדיומיוציטים חיים (viable CMs; בצבע אדום כהה) בתוך האזור שעבר אוטם/נמק (בז'). אלה התמקדו בעיקר סביב אתר ההזרקה של IL-6 (חצים, פנל שמאלי). כימות של קרדיומיוציטים חיים בתוך אזור העניין (ROI, מסומן בקווים מקווקווים) העלה כי הזרקת PBS הובילה לשיעור קטן בלבד של מיוקרדיום חי (1.05% ± 0.44%, SEM, n = 4), בעוד שהזרקת IL-6 העלתה באופן מובהק את כמות הקרדיומיוציטים החיים בתוך ה-ROI (4.08% ± 0.99%, SEM, n = 6; p = 0.005, Student’s t-test). פסי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע (SDM). אנא לחצו כאן להצגת גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תוצאות לא מספקות או לא מוצלחות שנגרמו עקב כשל טכני. כפי שמוצג בדוגמה של פגיעה בשריר הלב במודל MI ex vivo (שמאלה), ניתן בדרך כלל להבחין בבירור בין מיוקרדיום חיוני לבין מיוקרדיום נמק בצביעת TTC טיפוסית. עם זאת, מספר כשלים טכניים עלולים להוביל לתוצאות לא מספקות או שאינן ניתנות לפירוש. קשירה לא מספקת של ה-LAD עקב החלקת התפר עלולה להוביל להישרדות נרחבת של שריר הלב למרות איסכמיה ממושכת. רפרופזיה חלקית עלולה להתרחש כאשר ענפים של ה-LAD נפגעים במהלך הקשירה ולאחר מכן סובלים מאספקת דם דלה, מה שיוצר תבנית הדומה לתופעת ה-"no-reflow" הנצפית באופן קליני. אזורים אלו עשויים להפגין גוון ורדר (חצים). אמבוליזציה מיקרו-וסקולרית על ידי בועות אוויר החודרות למחזור הכלילי במהלך הליך הקניולציה עלולה לגרום גם היא לפגיעה בשריר הלב (חצים), מה שמקשה על ההבחנה בין פגיעה איסכמית לפגיעה אמבולית לצורך כימות. לבסוף, צביעת TTC לא מספקת עלולה להתרחש כאשר הלב עובר פרפוזיה מוגברת, דבר שעלול לגרום לפגיעה בשריר הלב מעבר לאיסכמיה. סריג קנה מידה: 1 mm. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.
| F-peak (n = 19) | F-steady (n = 19) | RF-peak (n = 19) | RF-steady (n = 19) | |
| ממוצעים (mL/min) | 2.54 | 0.78 | 2 | 0.99 |
| SD | 0.59 | 0.29 | 0.56 | 0.53 |
טבלה 1: זרימה כלילית ברמות המקסימליות (F-peak) ובמצב יציב (F-steady) במהלך איסכמיה וreperfusion (RF-peak ו-RF-steady).
דיון
מודל ה-MI הנוכחי מסוג ex vivo מבוסס בעיקר על מערכות מתוחכמות של לב בבישול לנגנדורף (Langendorff-perfused heart systems)2. טעות נפוצה במהלך ההכנה היא החדרת בועות אוויר למערכת הנימים הכליליים, דבר שעלול לגרום לפגיעה אמבולית ולהטעות את הערכת הפגיעה האיסכמית. כדי למנוע בעיה זו, חיונית בדיקה קפדנית של מערכת הפרפוזיה מיד לפני כל ניסוי. אם בועות אוויר קטנות נלכדות בתוך מערכת הפצעות, שטיפה רטרוגרדית באמצעות KHB כדי להוציא את הבועות חזרה לעמוד הלחץ עשויה לסייע בפתרון הבעיה.
השלב המכריע בפרוטוקול זה הוא קשירת עורק כלילי LAD. לכן, ראשית, זיהוי חזותי מדויק של ה-LAD הוא קריטי. ברוב המקרים, כלי הדם הכליליים הופכים שקופים לאחר שטיפת הלב ב-PBS קר מאוד, מה שמאפשר להבדיל בבירור את ה-LAD מהמיוקרדיום שסביבו. יתר על כן, טכניקת קשירה נכונה ומיומנת חשובה באותה מידה, שכן מתיחה מוגברת של תפר Polypropylene 8-0 עלולה לחתוך את ה-LAD, ובכך להפוך את הפרפוזיה העוקבת לבלתי אפשרית. כדי למזער סיכון זה, יש להניח פלדגט (pledget) רך בגודל מתאים בין התפר לכלי הדם, כדי לפזר את כוח הקשירה ולהגן על העורק הכלילי מפני פגיעה מכנית. עם זאת, פגיעה מינימלית במיוקרדיום כתוצאה מהקשירה היא בלתי נמנעת, אך בדרך כלל אינה פוגעת בפרפוזיה הכלילית או משפיעה על תוצאות הניסוי. לבסוף, מכיוון שפגיעה במיוקרדיום היא רגישה מאוד לטמפרטורה13, שמירה על טמפרטורה קבועה לאורך כל הניסוי היא בעלת חשיבות מכרעת. במיוחד בתנאי פרפוזיה בלחץ קבוע, עשוי להתרחש איבוד חום בין עמוד הפרפוזיה ללב, אשר משתנה באופן דינמי בהתאם לקצב הזרימה הכלילית14. לפיכך, תנודתיות עשויה להוביל לשינויים בטמפרטורת המיוקרדיום. בהקשר זה, שימוש באמבט איברים בעל מעטפת מים (water-jacketed organ bath) הוא רצוי מאוד לשמירה על תנאים תרמיים יציבים (איור 1A).
ברגע שאתגרים טכניים אלו נפתרים, מודל ה-MI ex vivo מספק פלטפורמה אמינה וניתנת לשחזור להשראת פגיעה בשריר הלב בלב עכבר מבודד (איור 3A). לפיכך, הוא מהווה מערכת ניסויית בעלת ערך לחקירת הישרדות השריר הלבבי לאחר MI, להערכת התערבויות טיפוליות המועברות באופן מקומי, ולביצוע דימות ברזולוציה גבוהה ללא הפרעה מתנועות נשימה או תנועות לב. למרות שפרוטוקול ה-MI הגלובלי הוא פשוט מבחינה טכנית ונעשה בו שימוש נרחב במחקרים קודמים4, מגבלתו העיקרית היא שמשך האיסכמיה הגלובלית מוגבל בדרך כלל לפחות מ-45 min3. כתוצאה מכך, בניגוד למודל ה-MI אזורי, הוא מפיק לעיתים רחוקות אוטם טרנסמוראלי (איור 2).
מאפיין ייחודי אחד של מודל ה-MI מסוג ex vivo הוא היעדרה של השפעות סיסטמיות, כולל ויסות עצבי ומרכיבי דם במחזור, דבר המאפשר לחוקרים להעריך את ההשפעות המקומיות הישירות של התערבויות טיפוליות על המיוקרדיום8. דבר זה רלוונטי במיוחד עבור ציטוקינים כגון IL-6 ושבילי השאת ה-PI3K/AKT, אשר הוכח כי הם בעלי השפעה קרדיופרוטקטיבית בתאי שריר לב (cardiomyocytes) מבודדים15. עם זאת, in vivo, ההשפעות הלבביות של IL-6 הן לעיתים קרובות לא עקביות או אפילו סותרות, מכיוון ש-IL-6 מפעיל בו-זמנית תאי מערכת חיסונית ומעודד תגובות דלקתיות שעשויות לבטל את פעולותיו הקרדיופרוטקטיביות הישירות16. בקו התהליך עם קונספט זה, מודל ה-ex vivo שלנו הדגים באופן משכנע כי מתן מקומי תוך-מיוקרדיאלי של IL-6 שימר באופן משמעותי את חיוניות המיוקרדיום לאחר פגיעה איסכמית17,18, דבר התומך בהשפעה קרדיופרוטקטיבית ישירה של IL-6 על תאי שריר לב (איור 4).
אנו מכירים במספר מגבלות של מודל ה-MI ex vivo הנוכחי. במערך הנוכחי, לא הוערכה תפקודי התכווצות לבבית בפרוטוקול הנוכחי.3זאת משום שהמטרה העיקרית הייתה לאפיין את השרידות של השריר הלבבי במודל של אוטם שריר הלב (MI) אזורי, ומכיוון שדספונקציה התכווצית משקפת ליקוי תפקודי בעקבות פגיעה איסכמית אך אינה מעידה בהכרח על מוות של קרדיומיוציטים.8בנוסף, ה- ex vivo מודל MI מושלך מטבעו רכיבי דם במחזור, תאי מערכת החיסון והשפעות נוירוהומוראליות שעשויות לתרום באופן משמעותי להתקדמות ה-MI ולremodeling לבבי in vivoעל אף שצמצום זה במורכבות המערכתית מהווה יתרון מרכזי של ה- ex vivo מודל MI, הוא גם מגביל את השימוש הנרחב בו בחיקוי התגובות הדלקתיות, הווסקולריות, העצביות והאנדוקריניות שעשויות להתרחש in vivoלבסוף, נמצא כי פרפוזיה קריסטלואידית קשורה לבצקת בשריר הלב, כפי שהוכח על ידי עיבוי של דופן הפרוקיב וצמצום של חלל הפרוקיב בהשוואה ל- in vivo לבבות עם אוטם שריר הלב (MI). הופעתו המוכרת של בצקת עלולה לשנות את הארכיטקטורה של השריר הלבבי, את הדיפוזיה ברקמה, וייתכן שגם את החיוניות התאית. לפיכך, יש להתייחס למודל הנוכחי כפלטפורמה מבוקרת לחקירת פגיעה בשריר הלב ומנגנונים ספציפיים לתאי שריר הלב (cardiomyocytes).
עם זאת, מודל ה-MI ה-ex vivo המתואר כאן מהווה פלטפורמה פשוטה וחסכונית להערכת הישרדות השריר הלבבי בהיעדר השפעות רגולטוריות חיצוניות. בהינתן השימוש הגובר במודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי, גישה זו עשויה להיות בעלת ערך מיוחד לחקירת מנגנוני הגנה על הלב באמצעות דימות מתקדם, רישום אלקטרופיזיולוגי ואנליזות מולקולריות. בנוסף, ניתן להתאים את המודל לבחינה שיטתית של התערבויות פרמקולוגיות מקומיות או התערבויות מבוססות גנים, ולניתוח מנגנונים ספציפיים לקארדיומיוציטים ללא גורמים מערכתיים מבלבלים. לפיכך, מודל ה-MI ה-ex vivo מספק פלטפורמה ניסיונית משלימה המקלה על זיהוים וחקירת המנגנונים של מסלולי הגנה לבביים.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים. המחברים מצהירים כי לא נעשה שימוש בכלי בינה מלאכותית (AI) או בטכנולוגיות מסייעות מבוססות בינה מלאכותית יוצרת (generative AI) בניסוח, בניתוח הנתונים, ביצירת האיורים או בתיקוף של עבודה זו.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט הכללי של אגודת הגריאטריה של ג'יאנגסו (JGS2026MS019 ל-WO), קרן הפיתוח החברתי של מחלקת המדע והטכנולוגיה של העיר ז'נגג'יאנג (מענקים מס' SH2023023 ל-H.Z. ו-SH2023057 ל-X.L.), תוכנית FoKo (מענק מס' 23/2013 ל-ZD), ומכון דסלדורף למחקר קרדיווסקולרי (CARID).
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Milipore | 1.08380.0100 | כימיקלים |
| קנולה אאורטלית | BD | 305895 (20 G) | רטרו-פרפוזיה |
| Aquamount | BDH | 362262H | קריו-חתך |
| מאזניים | Ohaus | - | שקילת כימיקלים |
| פינצטה גדולה | AESCULAP | - | מכשור כירורגי |
| מנתחי גזי דם | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | מנתח גזים |
| קלציום כלוריד דיהידראט | Fluka | 21097 | כימיקלים |
| קרבוגן | Linde | 4040152 | מערכת לנגנדורף |
| CellSens | Olympus | Version 3.1.1 | תוכנת דימוי |
| פדי כותנה | BEESana | PZN-1330900 | מכשור כירורגי |
| זכוכית כיסוי | Epredia | BB02400500A113MN20 | קריו-חתך |
| קריוסטט | Leica | M850 | קריו-חתך |
| D(+)-Glucose anhydrous | Merck | 8337.1000 | כימיקלים |
| מים מזוקקים פעמיים | Milipore | - | המסת כימיקלים |
| אתנול (100%) | Merck | 64-17-5 | ניקוי צינורות |
| אתנול (70%) | VWR | UN1170 | ניקוי צינורות |
| ממברנת סינון (0.2 µm) | Thermo Scientific | 8-000-230511 | מערכת לנגנדורף |
| מד זרימה | Transonic | T4S410 | מערכת לנגנדורף |
| שקופיות מיקרוסקופ מזכוכית | Engelbrecht | 11102 | קריו-חתך |
| עמוד מים מזכוכית | Homemade | - | מערכת לנגנדורף |
| חומצה קלורידית | Roth | P074.1 | כימיקלים |
| ImageJ | NIH | version 1.54g | תוכנה |
| Interleukin-6 | Biolegend | 570804 | כימיקלים |
| איסופלורן | Piramal | 14150097146754 | כימיקלים |
| מיקרוסקופ אור | Olympus | BX61 | דימוי |
| מגנזיום סולפט הפטהידראט | Merck | 5886.1000 | כימיקלים |
| גש סריקה רפואי למדידת זרימה | Transonic | 3PXN | מערכת לנגנדורף |
| צלחית מתכת | Homemade | - | מכשור כירורגי |
| מזרק Micro-Fine | BD | 30G / 0.3 mL | מערכת לנגנדורף |
| עכבר | Janvier | C57BL/6J | בעלי חיים |
| עדשה (x 1.25) | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | דימוי |
| תרכובת OCT | Sakura | 4583 | כימיקלים |
| צלחת פטרי | Thermo Scientific | 172931 | מערכת לנגנדורף |
| סליין בופר פוספט | Roth | 9143.1 | כימיקלים |
| אשלגן כלוריד | Merck | 4936.1000 | כימיקלים |
| אשלגן דיהידרוגן פוספט | Merck | 4873.1000 | כימיקלים |
| חוט תפירה ממשי | F.S.T | 18020-60 | מכשור כירורגי |
| נתרן כלוריד | Sigmaaldrich | SZBD0810V | כימיקלים |
| נתרן מימן קרבונט | Roth | 6885.2 | כימיקלים |
| נתרן פירובט | Sigmaaldrich | 113-24-6 | כימיקלים |
| פד רכה (pledget) | Deknatel | L-705 | מכשור כירורגי |
| פינצטה מפלדת אל חלד (8m/m) | F.S.T | 11052-10 | מכשור כירורגי |
| מספריים מפלדת אל חלד | AESCULAP | BC702R | מכשור כירורגי |
| מספריים מפלדת אל חלד | AESCULAP | BC257R | מכשור כירורגי |
| סטריאו-מיקרוסקופ | Leica | MZ6 | מכשור כירורגי |
| חוט תפירה (8-0) | Ethicon | TG-108 | מכשור כירורגי |
| מזרק (3 mL) | B. Braun | 4617100V | רטרו-פרפוזיה |
| ברז תלת-כיווני | B. Braun | 16494C | רטרו-פרפוזיה |
| צינורית | Tygon | T3304-23 | מערכת לנגנדורף |
| מקלח מים | HAAKE | DC1/B3 | מערכת לנגנדורף |
| תמיסת Zamboni | Morphisto | 12773.0050 | כימיקלים |
מקורות
- Pendexter CA, et al. Modified Langendorff perfusion method for extended perfusion times of rodent cardiac grafts. J Vis Exp. 2024;(208):66815.
- Bell RM, Mocanu MM, Yellon DM. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. J Mol Cell Cardiol. 2011;50(6):940-950.
- Rossello X, Hall AR, Bell RM, Yellon DM. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2016;21(3):286-295.
- Yang T, et al. Isolated perfused hearts for cardiovascular research: an old dog with new tricks. J Cardiovasc Transl Res. 2024;17(5):1207-1217.
- Martin TP, et al. Preclinical models of myocardial infarction: from mechanism to translation. Br J Pharmacol. 2022;179(5):770-791.
- Hurt CM, et al. Transient receptor potential vanilloid 1 regulates mitochondrial membrane potential and myocardial reperfusion injury. J Am Heart Assoc. 2016;5(9):3774.
- Herr DJ, Aune SE, Menick DR. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. 2015;(101):52908.
- Lindsey ML, et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H812-H838.
- Zhu H, et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 2023;12(12):137-150.
- Ouyang W, et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1598314.
- Ding Z, Zhang H, Bouvain P, Ding Z, Flögel U. A microscopic 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride assay for accurate and reliable analysis of myocardial injury. J Vis Exp. 2025;(225):68596.
- Ding Z, et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 2024;14(1):25214.
- El Farissi M, et al. Hypothermia for reduction of myocardial reperfusion injury in acute myocardial infarction: closing the translational gap. Circ Cardiovasc Interv. 2021;14(8):010326.
- Ding Z, Gödecke A, Schrader J. Contribution of cytochrome P450 metabolites to bradykinin-induced vasodilation in endothelial NO synthase deficient mouse hearts. Br J Pharmacol. 2002;135(3):631-638.
- Smart N, et al. IL-6 induces PI 3-kinase and nitric oxide-dependent protection and preserves mitochondrial function in cardiomyocytes. Cardiovasc Res. 2006;69(1):164-177.
- Broch K, et al. Randomized trial of interleukin-6 receptor inhibition in patients with acute ST-segment elevation myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 2021;77(15):1845-1855.
- Fontes JA, Rose NR, Čiháková D. The varying faces of IL-6: from cardiac protection to cardiac failure. Cytokine. 2015;74(1):62-68.
- Preda A, et al. IL-6 in the spotlight: from cardiovascular pathophysiology to therapy. Eur J Clin Invest. 2026;56(1):e70161.
הדפסות חוזרות והרשאות
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב