Name: Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למדו שיטת מוות תאים להערכת חסינות מופעלת על ידי PAMP ב-Nicotiana benthamiana. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני הגנה צמחיים ולזהות גנים מעורבים בתגובת החסינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים היאה-סוק הו, ג&#39;ואן מורלו ואלן Collmer, המחלקה הצמח פתולוגיה הצמח-Microbe לביולוגיה, אוניברסיטת קורנל, לדיונים חשובים. אנו מודים ג&#39;סי Munkvold הערות על המאמר. המימון ניתן על ידי תוכנית הקרן הלאומית למדע הגנום הצמח, מספר פרס DBI-0605059 (GBM).

חלק 1: גידול הצמח תחזוקה ניקוטיאנה benthamiana צמחים המשמשים assay צריך להיות כ 7 שבועות. הם צריכים להיות גזומים לפחות 4-5 ימים לפני assay כדי להסיר כל ענפי השחי ופרחים. זה רעיון טוב להוציא סניפים בבית השחי מיד אחרי שהם יוצאים כדי להפוך את הצמחים יותר לניהול. חלק 2: תרבות חיידקית יום 1: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלטות או תרבויות לכל זני המשמש assay הם יזמו באותו זמן. עבור Pseudomonas spp. אשר כוללים 2 ו - 3 זנים מעוררים אתגר, חיידקים על גבי צלחות פס KBM המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה מתוך מניות גליצרול קפוא (טבלה 2). כמות קטנה של חיידקים צריך להתפשט במרכז הצלחת. דגירה את הצלחת על 30 מעלות צלזיוס למשך כ 18-24 שעות. עבור Agrobacterium, להתחיל תרבות נוזלי LB 2 מ&quot;ל מהצלחת טרי לגדול בין לילה ב 250 סל&quot;ד, 30 ° C. </li></ol> יום 2: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור Pseudomonas, להוסיף 150-200 μl של KBM נוזל החיידקים ולהפיץ אותם מעל צלחת כולו באמצעות מפזר זכוכית סטרילית. שים את הצלחת בחזרה בחממה ולתת לו לגדול עוד 20-24 שעות. לא צריך להיות דשא בקטריאלי על הצלחת למחרת, המעיד על צמיחה טוב. עבור Agrobacterium, להתחיל התרבות משנית LB על 5-10 מ&quot;ל עם acetosyringone 20 מיקרומטר ולתת לו לגדול בין לילה עד 20 שעות 250 סל&quot;ד, 30 ° C. </li></ol> חלק 3: צמחים הכנה assay יום 2: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני assay הצמחים יש להעביר לחדר בבית 22-24 ° C, ~ 35-40% לחות יחסית קל וקבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרק עיגולים על העלים לפחות 1.5 ס&quot;מ קוטר באמצעות בטוש שחור עבה. שניים עד ארבעה עיגולים ניתן לסמן לכל עלה. חוגים צריכה להיות מחולקת היטב ועדיף לא לחצות וריד גדול. בחר היטב מורחבת עלים. הימנע עלים מבוגרים או עלים קשים או עבה לגעת ולהימנע סימון חוגים על חלקים התחתון של העלה. </li></ol> חוגים לציון יום לפני הניסוי אינו חיוני בפרוטוקול. עם זאת, זה חוסך זמן אם יש מספר גדול של צמחים להיות assayed, ומקלה על מנת להשיג תזמון מדויק בין אינדוקציה של PTI וכן חיסונים אתגר. חלק 4: אינדוקציה של PTI יום 3: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים מהצלחת של 10 mM MgCl 2 עבור fluorescens פ ו פ putida. עבור Agrobacterium, צנטריפוגה התרבות לאסוף תאים resuspend ב 10mm MgCl 2 + 10 mM MES-pH 5.6. חזור על צנטריפוגה ו resuspend בפתרון 2-MES MgCl. מדוד את צפיפות אופטית (OD) של תאים ב 600 ננומטר. התאם את מכנסי הש&quot;כ לערכים הנדרשים הסופי כפי שמתואר בטבלה 2. Pseudomonas צריך להיות resuspended לבסוף 10 מ&quot;מ MgCl 2 ו Agrobacterium של MgCl 2-MES פתרון. הנפח הכולל של 25 מ&quot;ל מספיקה כדי לחסן על 40-50 נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסתנן מעוררים PTI לתוך מראש סימנה עיגולים על העלים באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ללא מחטים. רשמו את הסדר שבו הצמחים היו הסתננו ואת הזמן המדויק שבו החלה הסתננות. </li></ol> חלק 5: חיסון אתגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פ syringae pv. עגבניה DC3000, PST DC3000 Δ hopQ1-1 ו-PV תהלים. tabaci לאתגר כמתואר בחלק 4.1 ולוח 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבע שעות לאחר החדירה inducer, לבצע את החדירה אתגר באותו סדר של צמחים כמו הגיוס נעשה. בדרך כלל, נקודת בשולי המעגל חיסון הראשון יכול לשמש מרכז המעגל הרכבה השני. אם ישנם כתמים רבים על עלה מכן ודא חדירות אינם חופפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט דילולים הסידורי של כל התרבויות השתמשו assay על צלחות KBM או LB המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה כדי לקבוע את המספר המדויק CFU. </li></ol> חלק 6: ניקוד עבור פירוט של PTI יום 5: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש הופעתו של מוות של תאים עקב אתי במקומות שהיו תיגר עם Pst DC3000. מוות של תאים בתוך שטח חופף של חדירת מציין פירוט של PTI ויש הבקיע כמו פנוטיפ חיובית. </li></ol> יום 7: <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש הופעתו של מוות של תאים עקב מחלת במקומות שהיו תיגר עם Pst DC3000 Δ hopQ1-1 או תהלים pv. Tabaci </em&gt;. ציון עבור פנוטיפ חיובית באותו אופן כפי שתואר בחלק 6.1. </li></ol> כאשר הצמחים הביקורת (שלא צריך להתפשר על PTI) מתחילים להראות מוות של תאים באזור חופפים החדירה, להפסיק ביצוע תצפיות נוספות. חלק 7: תוצאות נציג איור 1 מציג את תוצאות assay כאשר פ fluorescens שימש inducer ו DC3000 Pst כאתגר. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /> באיור 1. פ fluorescens היה הסתננו אל נ benthamiana עלים (עיגול שחור) כדי לגרום PTI ו -7 שעות לאחר מכן, המקום היה תיגר עם Pst DC3000 (עיגול לבן). צמחים השתיק עבור FLS2 הראה פירוט של PTI באזור שבו פ fluorescens היה הסתננו (א), כפי שניתן לראות על ידי מוות של תאים. צמחים בקרה שלא הושתקו לא הראה שום מוות של תאים באזור חופפים בשל גיוס של PTI (B). החצים האדומים מצביעים על העדר או נוכחות של מוות של תאים באזור חופפים של חדירה. התמונות צולמו ימים לאחר 2 חדירות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PTI inducer </td><td> Cell מוות לעורר אתגר </td><td> הטבע של מוות של תאים </td><td> קוד </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv עגבניות (PST). DC3000 6 </td><td> אתי </td><td> PF / DC </td></tr><tr><td> פ putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> אתי </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> פ fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> מחלה </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> פ syringae pv. tabaci 11528R </td><td> מחלה </td><td> אגרו / Ptab </td></tr></tbody></table> טבלה 1: שילובים של גרימת PTI ותא מוות לעורר חיידקים המשמשים assay התא למוות PTI. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> זן חיידקי </td><td> מבחר בינוני </td><td> סופי OD השתמשו בניסוי </td><td> מקבילים CFU / ml </td></tr><tr><td> פ fluorescens 55 </td><td> KBM אמפיצילין (100 UG / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> פ putida KT2440 </td><td> KBM אמפיצילין (100 UG / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> א tumefaciens GV2260 </td><td> LB ריפמפיצין (100 UG / ml) </td><td> 0.5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM ריפמפיצין (100 UG / ml) </td><td> 0.02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM ריפמפיצין (100 UG / ml) </td><td> 100 דילול של פי 0.1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> פ syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM ריפמפיצין (100 UG / ml) </td><td> 100 דילול של פי 0.1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: התנאים התרבות רמות inoculum בשימוש assay. OD ו המקביל רמות CFU עשוי להשתנות בין מותגים שונים של הספקטרופוטומטרים.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

התא assay מוות מבוססי ניתן להשתמש כדי לקבוע את מעורבותם של גנים ב PTI. למשל, הפסד של פונקציה מוטציות של הגן של עניין, ניתן לבדוק באמצעות assay. מתוך 4 שילובים של inducer ו חיסונים אתגר נתון בטבלה 1, זה אפשרי, כי רק שילוב אחד עלול לגרום פנוטיפ ברקע המפעל שלך. ראינו כי הצמחים השתיק עבור FLS2 להראות פירוט של PTI ב PF / DC ו Pf/Q1-1 שילובים של inducer ו חיסונים אתגר (טבלה 1). זה חיוני כי התנאים הסביבתיים עבור assay הם קרוב ככל האפשר לאלה המתוארים בפרק 3.1. לחות נמוכה גורמת למוות התא להתקדם מהר מדי, מה שהופך assay קשה להבקיע. אם התנאים המתוארים בפרוטוקול שלנו לא עובדים במעבדה שלך, ואז לנסות לשנות את רמת inducer או חיסון אתגר. פרמטר נוסף אשר יכול להיות שונה הוא פער הזמן בין אינדוקציה אתגר, אם כי מצאנו כי פערי זמן קצר גרם assay להישבר מהר מדי בצמחים שליטה. אנו ממליצים כי לפחות 4-5 צמחים להיבדק בניסוי לבין פנוטיפ חיובית יש לחזור לפחות ניסויים עצמאיים 3-4.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>הכינו תמיסת מקור בריכוז 1M, כווןו את ה-pH ובצעו סטריליזציה באמצעות סינון. אחסנו בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר UV/Vis Life Science</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

assay עבור תבנית הפתוגן-associated מולקולרית (pamp)-שהופעלו חסינות (pti) בצמחים

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

כדי לתפוס פתוגנים פוטנציאליים בסביבה שלהם, הצמחים להשתמש זיהוי תבניות קולטנים (PRRs) בהווה על ממברנות פלזמה שלהם. PRRs להכיר תכונות חיידקים נשמרת בשם הפתוגן הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) וגילוי זה מוביל חסינות PAMP-מופעלות (PTI), אשר למעשה מונע קולוניזציה של רקמות הצמח על ידי 1,2 שאינם פתוגנים. מערכת ביותר למד היטב PTI הוא 3 FLS2 תלוי מסלול. FLS2 מכירה flg22 PAMP כי הוא רכיב של flagellin חיידקי. פתוגנים מצליחים להחזיק גורמים ארסיות או effectors שיכולים לדכא PTI ולאפשר הפתוגן לגרום למחלה 1. יש צמחים בעלי גנים להפוך התנגדות המאתרות effectors או הפעילות שלהם, מה שמוביל חסינות מפעיל-מופעלות (אתי) 2. אנו מתארים מוות מבוססי תאים assay עבור PTI שונה מ הו ו Collmer 4. Assay היתה סטנדרטית ב נ benthamiana, אשר נמצא בשימוש יותר ויותר כמערכת מודל לחקר יחסי גומלין צמח פתוגן 5. PTI הוא המושרה על ידי חדירה של זן לא פתוגני חיידקי לתוך העלים. שבע שעות מאוחר יותר, זן חיידקי או מחלה או גורם אשר מפעילה אתי הוא הסתנן לאזור חופפות את אזור החדירה המקורי. PTI הנגרמת על ידי חדירת הראשון הוא מסוגל לעכב או למנוע את המראה של מוות של תאים עקב חדירת האתגר השני. לעומת זאת, את המראה של מוות של תאים באזור חופפים של חיסון מציין פירוט של PTI. ארבעה שילובים שונים של מעוררים של PTI וכן חיסונים אתגר היו סטנדרטיים (טבלה 1). Assay נבדקה על אי - השתיק נ benthamiana צמחים ששימשו לשלוט וצמחים השתיק עבור FLS2 אשר נחזו להיות פגיעה ביכולתם לפתח PTI.

מוות מבוססי תא assay עבור PTI בצמחים ניקוטיאנה benthamiana מתואר.

Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

כדי לזהות פתוגנים פוטנציאליים בסביבתן, צמחים משתמשים בקולטני זיהוי תבניות (PRRs) הנמצאים על ממברנות הפלזמה שלהם. PRRs מזהים...

שלום, אני Suma TI מהמעבדה של Greg Martin במכון Voice Thompson למחקר צמחים. היום נדגים לכם פרוצדורה לבדיקה המבוססת על מוות תאי עבור חסינות המופעלת על ידי PAM, או PTI. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לבחון מעורבות של גן ב-PTI.אם כן, בואו נתחיל. התחילו את הפרוצדורה בגידול של Nicotiana ANA עד שיגיעו לגיל של כשבעה שבועות. ארבעה עד חמישה ימים לפני התחלת התהליך.בדיקת החסינות המופעלת על ידי PAM או PTI. יש לגזום את הצמחים כדי להסיר את כל הענפים הצמיגיים והפרחים. נסו להסיר את הענפים הצמיגיים זמן קצר לאחר הופעתם כדי להקל על הטיפול בצמחים.לאחר הכנת הצמחים, עברו לגידול החיידקים. הליך זה משתמש בחיידקים שאינם פתוגניים להשראת חסינות הצמח לפני הזרקה שנייה של חיידקי אתגר; התחילו את גידול כל החיידקים המשמשים במערך הבדיקה. במקביל, השתמשו במקלות גליצרין קפואים של חיידקי ה-pseudomonas עבור כל מקל חיידקי pseudomonas.מרחו כמות קטנה של חיידקים במרכז צלחת KBM המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה, והדגירו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C למשך כ-18 עד 24 שעות. עבור ה-agrobacterium, השתמשו בצלחת טרייה שהוכנה מראש כדי להתחיל תרבית נוזלית בשני milliliters של lb. גדלו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור, וביצעו את השלבים הבאים למחרת.הוסיפו 150 עד 200 microliters של KBM נוזלי לצלחות עם חיידשאי ה-pseudomonas. פזרו את החיידקים על פני כל הצלחת, באמצעות גורר (spreader) סטרילי.החזירו את הפתחים לאינקובטור ל-20 עד 24 שעות נוספות. ארבעה agrobacterium. התחילו תרבית משנית בכ-5 עד 10 milliliters של LB המכיל 20 micromolar אצטון.גדלו את התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius תחת ניעור. לאחר הכנת החיידקים, עברו להכין את הצמחים לבדיקה ביום שלפני ביצוע בדיקת ה-PTI. לאחר הכנת החיידקים, העבירו את הצמחים לחדר בטמפרטורה של 22 to 24 degrees Celsius עם לחות יחסית של כ-35 to 40% ותאורה קבועה.בשלב הבא, השתמשו בטוש שחור עבה כדי לסמן עיגולים על העלים. בחרו עלים שהתרחבו היטב והימנעו מעלים זקנים או עלים שהם קשיחים או עבים למגע. הימנעו מסימון החלקים התחתונים של העלה.העיגולים הם בקוטר של לפחות 1.5 סנטימטרים, וניתן לסמן בין שניים לארבעה עיגולים לכל עלה. על העיגולים להיות מרוחקים זה מזה ורצוי שלא יחצו וריד גדול. התחילו את בדיקת ה-PTI על ידי קציר החיידקים ששימשו להשראת ה-PTI.מיני ה-pseudomonas שבהם נעשה שימוש צריכים להיות בעלי מסף חיידקי המעיד על גדילה טובה. יש לאסוף אותם מהצלחת על ידי גירוד באמצעות מקל עץ ארוך וסטרילי, ולסבסב אותם בערך ב-20 עד 25 milliliters של תמיסת Magnesium chloride בריכוז 10 millimolar עבור סבוב של agrobacterium בצנטריפוגה.יש לאסוף את התאים מהתרבית ולסספנד (resuspend) בכ-20 עד 25 מיליליטר של 10 millimolar magnesium chloride בתוספת 10 millimolar MES pH 5.6, לחזור על הסבב של הסריפוגציה ושוב לסספנד בכ-20 עד 25 מיליליטר של תמיסת ה-magnesium chloride וה-MES. כעת, כאשר חיידקי ה-pseudomonas וה-agrobacterium המעוררים נמצאים בסספנד.מדוד את הצפיפות האופטית של כל שלושת התרביות באורך גל של 600 ננומטר. התאם את ה-OD על ידי דילול התאים עם מגנזיום כלוריד עבור ה-pseudomonas ועם MES בתוספת מגנזיום כלוריד עבור ה-agrobacterium. ערכי ה-OD הסופיים הנדרשים מופיעים בפרוטוקול הכתוב המצורף.נפח כולל של 25 מיליליטר של תרבית חיידקים מספיק להדבקת כ-40 עד 50 נקודות. כעת התחילו את הבדיקה על ידי הזרקה של משרהי PTI לתוך העיגולים שסומנו מראש על העלים, באמצעות מזרק של מיליליטר אחד ללא מחט. רשמו את הסדר שבו בוצעה ההזרקה לצמחים ואת השעה המדויקת שבה התחילה ההזרקה לאחר ההשראה.בצעו את ההזרקה של אתגר הזיהום מספר שעות לאחר ההזרקה להשראה. קצרו את זני החיידקים הדרושים להזרקת האתגר כפי שהודגם בעבר עבור זני הפסאודומונאס המשרים. שוב, מדדו את ה-OD וכווןו את ריכוז התרביות בהתאם לפרוטוקול ה-GR המצורף.התחילו את ההחדרה של גורם האתגר שבע שעות לאחר החדרת המשרה. השתמשו בשילובי המשרה והאתגר הבאים. בחרו נקודה על ההיקף של מעגל ההחדרה הראשון כמרכז של מעגל ההחדרה השני.בצעו את חדירת האתגר באותו סדר של הצמחים שבו בוצע ההשראה. אם ישנן מספר נקודות על עלה, וודאו שהחדירות אינן חופפות. לבסוף, פזרו דילול סדרתי של כל התרביות ששימשו במדידה על מצעי KBM או LB המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה.יומיים לאחר ההזרקה המאתגרת, ניתן להתחיל להעריך את תגובת ה-PTI. יומיים לאחר ההשראה וההזרקות המאתגרות, חפשו הופעה של מוות תאי עקב חסינות המופעלת על ידי אפקטורים (ETI) בנקודות שנחשפו ל-PST DC 3000. מוות תאי בתוך אזור החפיפה של ההסניפה מעיד על קריסת ה-PTI ויש לדרגו כפנוטיפ חיובי. ארבעה עד חמישה ימים לאחר ההשראה וההזרקות המאתגרות, חפשו הופעה של מוות תאי עקב מחלה בנקודות שנחשפו למוטנט DC 3000 hop Q1 או ל-PS back high שוב. חפשו קריסת PTI המתבטאת במוות תאי עקב מחלה באזור החפיפה של ההסניפה. המשיכו לעקוב אחר הצמחים עד שגם אלו שאינם פגועים ב-PTI יחלו להראות מוות תאי באזור החפיפה של ההסניפה.צמחים שבהם השתיקה של FLS two בוצעה סובלים מפגיעה ב-PTI יומיים לאחר החדרת שילוב ה-PFDC. מוות של תאים נראה באזור החפיפה, מה שמעיד על קריסה של ה-PTI. צמחי ביקורת שלא עברו השתקה של אף גן הוחדרו גם הם עם שילוב ה-PFDC ונבחנו יומיים לאחר ביצוע הבדיקה; מוות של תאים עקב האתגר נראה מחוץ לאזור החפיפה אך לא בתוכו, וזאת בשל תגובת PTI תקינה.הדגמנו כעת כיצד לבצע בדיקה המבוססת על מוות של תאים עבור חסינות המופעלת על ידי פתוגנים או PTI. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הצמחים בתנאים הסביבתיים שאנו ממליצים עליהם. רמות לחות גבוהות יותר ישפיעו לרעה על הצמחים ויגרמו לבדיקה להתקדם במהירות רבה יותר.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

assay-for-pathogen-associated-molecular-pattern-pamp-triggered

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

אנו מתארים כאן פרוטוקול לטיהור והאפיון של קומפלקסי חלבוני צמח. אנו מראים כי על ידי immunoprecipitating חלבון יחיד בתוך מתחם, כדי שנוכל לזהות לאחר translational השינויים שלה והשותפים באינטראקציה שלה.

זיהוי לאחר translational השינויים של קומפלקסי חלבוני צמח

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

כתב יד זה מתאר תהליך ניסוי קלה ומהירה לקביעת אינטראקציות חלבון-חלבון מבוסס על מדידת פעילות לוציפראז.

לוציפראז קומפלמנטציה הדמיה Assay העלים טבק benthamiana עבור Transiently קביעת חלבון אינטראקציה דינמיקה

נייר זה מתאר שתי שיטות לכמת את התגובות ההגנה באריידאופזיס thaliana בעקבות החשיפה elicitors החיסונית: פרץ חמצוני חולף, ואת עיכוב צמיחת שתיל.

תבנית-המופעל חמצוני ושתיל עיכוב הצמיחה שתילה Assays באריידרופסיס thaliana

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

השטף שתיל המבול מאפשר הקרנה מהירה של הקלה עגבניות בר עבור התנגדות פסבדו החיידק syringae bacterium. מעשה זה, המשמש בשילוב עם השימוש בקביעת הצמיחה החיידקית של הנבט, יכול לסייע עוד יותר באפיון ההתנגדות הבסיסית לחיידק, וניתן להשתמש בו כדי לקבוע את הבסיס לאוכלוסיות מיפוי כדי לברר את היסוד הגנטי של ההתנגדות.

זיהוי תפוקה גבוהה של עמידות לפסאודומונס syringae pv. עגבניה בעגבניה באמצעות שתיל שיטפון שיטת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב לביצוע ניסוי סימון קרבה (PL) במלפפון (Cucumis sativus L.) באמצעות חלבון AT4G18020 (APRR2)-AirID כמודל. השיטה מתארת בניית וקטור, טרנספורמציה של מבנה באמצעות חדירת אגרו-אין, חדירת ביוטין, מיצוי חלבונים וטיהור חלבונים המסומנים בביוטין באמצעות טכניקת טיהור זיקה.

תיוג קרבה מבוסס AirID לאינטראקציה חלבון-חלבון בצמחים

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

למדו שיטת מוות תאים להערכת חסינות מופעלת על ידי PAMP ב-Nicotiana benthamiana. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לחקור מנגנוני הגנה צמחיים ולזהות גנים מעורבים בתגובת החסינות.

Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

גלה סרטונים נוספים