Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים
September 9th, 2009
מוות מבוססי תא assay עבור PTI בצמחים ניקוטיאנה benthamiana מתואר.
היי, אני Suma TI מהמעבדה של גרג מרטין במכון Voice Thompson לחקר הצמחים. היום נראה לך נוהל לבדיקה מבוססת מוות תאי לחסינות המופעלת על ידי PAM או PTI. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחפש מעורבות של גן ב-PTI.
אז בואו נתחיל. התחל את ההליך על ידי גידול Nicotiana ANA עד גיל שבעה שבועות בערך. ארבעה עד חמישה ימים לפני ההתחלה.
ה-PAM הפעיל חסינות או בדיקת PTI. חתוך את הצמחים כדי להסיר את כל הענפים והפרחים בבית השחי. נסה להסיר את ענפי בית השחי זמן קצר לאחר שהם מופיעים כדי להפוך את הצמחים לקלים יותר לניהול.
לאחר הכנת הצמחים המשיכו לגדל את החיידקים. הליך זה משתמש בחיידקים לא פתוגניים לאינדוקציה של חסינות הצמח לפני חיסון שני עם חיידקי אתגר, ליזום צמיחה של כל החיידקים המשמשים בבדיקה. במקביל, השתמש בגבעולי גליצרול קפואים של חיידקי הפסאודומונס עבור כל גבעול חיידקי פסאודומונס.
מורחים כמות קטנה של חיידקים במרכז צלחת KBM המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה ודוגרים על הצלחת ב-30 מעלות צלזיוס למשך כ-18 עד 24 שעות. עבור האגרובקטריום, השתמש בצלחת טרייה שהוכנה בעבר כדי להתחיל תרבית נוזלית בשני מיליליטר של פאונד. גדל למשך הלילה בחום של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול למחרת.
הוסף 150 עד 200 מיקרוליטר של KBM נוזלי לצלחות של חיידקי הפסאודומונס. מורחים את החיידקים על כל הצלחת. באמצעות גרטר סטרילי.
החזירו את הצלחות לחממה למשך 20 עד 24 שעות נוספות. ארבעה אגרובקטריום. התחל תרבית משנית בכחמישה עד 10 מיליליטר של LB המכיל 20 אצטון מיקרו-מולרי.
גדל את התרבות בן לילה בחום של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול. לאחר הכנת החיידקים המשיכו להכין את הצמחים לבדיקה יום לפני ביצוע בדיקת ה-PTI. לאחר הכנת החיידקים, העבירו את הצמחים לחדר של 22 עד 24 מעלות צלזיוס עם כ-35 עד 40% לחות יחסית ואור קבוע.
לאחר מכן, השתמש בטוש שחור עבה כדי לסמן עיגולים על העלים. בחר עלים מורחבים היטב והימנע מעלים ישנים יותר או עלים קשים או עבים למגע. הימנע מסימון החלקים התחתונים של העלה.
קוטר העיגולים הוא לפחות 1.5 סנטימטרים וניתן לסמן שניים עד ארבעה עיגולים בכל עלה. העיגולים צריכים להיות מרווחים היטב ורצוי לא לחצות וריד גדול. התחל את בדיקת ה-PTI על ידי קצירת החיידקים המשמשים לאינדוקציה של PTI.
מיני הפסאודומונס המשמשים היו צריכים ליצור מדשאה חיידקית המעידה על צמיחה טובה. קצרו אותם מהצלחת על ידי גירוד בעזרת מקל עץ ארוך וסטרילי והשעו מחדש בכ -20 עד 25 מיליליטר של 10 מילימולר. תמיסת מגנזיום כלוריד לצנטריפוגה אגרובקטרית.
התרבית לאיסוף התאים וההחייאה מושעה בכ -20 עד 25 מיליליטר של מגנזיום כלוריד 10 מילימולר בתוספת 10 מילימולר. MES pH 5.6, חזור על הצנטריפוגה ושוב, השהה בכ-20 עד 25 מיליליטר של תמיסת מגנזיום כלוריד בתוספת MES. עכשיו כשחיידקי הפסאודומונס והאגרובקטריום המעוררים מושעים מחדש.
מדוד את הצפיפות האופטית של כל שלוש התרביות באורך גל של 600 ננומטר. התאם את ה-ODS על ידי דילול התאים במגנזיום כלוריד עבור הפסאודומונס ו-MES בתוספת מגנזיום כלוריד עבור האגרובקטריום. ערכי ה-OD הסופיים הנדרשים נמצאים בפרוטוקול הכתוב הנלווה.
נפח כולל של 25 מיליליטר של תרבית חיידקים מספיק כדי לחסן כ -40 עד 50 נקודות. כעת התחל את הבדיקה על ידי החדרת משפרי ה-PTI לתוך העיגולים המסומנים מראש על העלים באמצעות מזרק מיליליטר אחד ללא מחט. רשום את סדר חדירת הצמחים ואת השעה המדויקת שבה החלה החדירה לאחר האינדוקציה.
המשך לחיסון האתגר מספר שעות לאחר חיסון הזירוז. קצור את זני החיידקים הנדרשים לחיסון האתגר כפי שהודגם קודם לכן עבור זני הפסאודומונס המעוררים. שוב, מדוד את ה-OD והתאם את ריכוז התרביות בהתאם לפרוטוקול ה-GR הנלווה.
התחל את חיסון האתגר שבע שעות לאחר חדירת המשרה. השתמש בשילובי המאתגרים המשרה הבאים. בחר נקודה בשולי מעגל החיסון הראשון כמרכז מעגל החיסון השני.
בצע את חדירת האתגר באותו סדר של צמחים כמו זה של האינדוקציה. אם יש מספר כתמים על עלה, וודא שהחדירות אינן חופפות. לבסוף, דילול סדרתי של כל התרביות המשמשות בבדיקה על לוחות KBM או LB המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה.
יומיים לאחר חיסון האתגר ניתן להתחיל להעריך את תגובת ה-PTI יומיים לאחר האינדוקציה וחיסוני האתגר לחפש הופעת מוות תאי עקב חסינות מופעלת על ידי אפקטור או ETI בנקודות שאותגרו עם PST DC 3000 מוות תאי בתוך האזור החופף של ההסתננות מצביע על התמוטטות של PTI ויש לדרג אותו כפנוטיפ חיובי ארבעה עד חמישה ימים לאחר האינדוקציה והאתגר חיסונים מחפשים הופעה של מוות תאים עקב מחלה בנקודות שאותגרו עם מוטנט DC 3000 hop Q1 או PS בחזרה גבוהה. חפש פירוט של PTI המסומן על ידי מוות תאים עקב מחלה באזור החופף של ההסתננות. המשך להתבונן בצמחים עד שאלה שאינם נפגעים ל-PTI מתחילים להראות מוות תאים באזור החופף של ההסתננות.
צמחים שהושתקו עבור FLS 2 נפגעים עבור PTI יומיים לאחר החיסון בשילוב PFDC. מוות תאים נראה באזור החופף המעיד על פירוק של צמחי ביקורת PTI שלא הושתקו עבור גן כלשהו. חוסנו גם בשילוב PFDC ונבדקו יומיים לאחר ביצוע הבדיקה מוות תאי עקב האתגר נראה מחוץ לאזור החופף אך לא בתוך האזור החופף עקב תגובת PTI רגילה.
זה עתה הראינו לך כיצד לבצע בדיקה מבוססת מוות תאי עבור חסינות המופעלת על ידי מכנסיים או PTI תוך כדי ביצוע הליך זה. חשוב לזכור לשמור על הצמחים בתנאים הסביבתיים שאנו ממליצים עליהם. רמות לחות גבוהות יותר ישפיעו לרעה על הצמחים ויגרמו לבדיקה להתקדם מהר יותר.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
מאמר זה מתאר תיאור על בסיס מוות תאי לצורך הערכת חסינות PAM (PTI) בצמחי Nicotiana benthamiana. הנוהל כולל הכנת צמחים וחיידקים, ואחריה סדרת חיסונים להערכת תגובת ה-PTI.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- אימונולוגיה של צמחים
- תיאור מוות תאי
- אינטראקציות פתוגן-צמח
רקע
- חסינות PAM (PTI) היא מנגנון הגנה קריטי בצמחים.
- Nicotiana benthamiana משמשת בדרך כלל לחקר חסינות צמחים.
- הבנת PTI יכולה לסייע בפיתוח זנים עמידים למחלות של צמחים.
- תיאור מוות תאי חיוני להערכת תגובות חיסוניות.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה להערכת PTI ב-Nicotiana benthamiana.
- לחקור את התפקיד של גנים ספציפיים בתגובת ה-PTI.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים בתחום אימונולוגיה של צמחים.
שיטות ששימשו
- הכנת צמחי Nicotiana benthamiana על ידי חיתוך וסימון עלים.
- גידול חיידקים שאינם פתוגניים לצורך גירוי PTI.
- חדירת תרביות חיידקים לאזורי עלים מסומנים מראש.
- הערכת תגובות מוות תאי לאחר חיסונים מאתגרים.
תוצאות עיקריות
- גירוי מוצלח של PTI נצפה באמצעות תיאור מוות תאי.
- מוות תאי באזורים חופפים הצביע על התמוטטות של PTI.
- צמחים בקרה הפגינו תגובות PTI רגילות ללא מוות תאי באזורים החופפים.
- צמחים שהושתקו לגנים ספציפיים הראו תגובות PTI מוחלשות.
מסקנות
- התיאור המתואר מעריך ביעילות את ה-PTI ב-Nicotiana benthamiana.
- הבנת מנגנוני PTI יכולה לספק אסטרטגיות גידול צמחים.
- שיטה זו ניתנת להתאמה למחקרים שונים בתחום חסינות הצמחים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This assay enables mechanistic de-risking of plant immune pathways by quantitatively linking PAMP recognition to downstream defense outputs. It supports target validation in agrochemical discovery by providing a reproducible readout for compounds that modulate PTI. The method enhances predictive confidence in early-stage screening for molecules that enhance or suppress plant immunity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the FLS2-flg22 signaling axis to validate pattern recognition receptors as therapeutic targets.
- Operational Value: Uses a cell death phenotype to functionally confirm PTI competence or breakdown in genetic or chemical perturbation models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved outputs (overlapping vs. non-overlapping cell death) to distinguish PTI efficacy from ETI or disease susceptibility.
- Operational Value: Standardized in Nicotiana benthamiana, a scalable transient expression system amenable to high-throughput agroinfiltration workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular initiation (PAMP-PRR binding) to organismal outcomes (cell death containment), enabling pathway continuity assessment.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between molecular biologists and plant pathologists via a shared phenotypic endpoint.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target engagement (PAMP-PRR binding) to functional validation (immune output) and phenotypic screening (compound library screening for immunomodulators).
- Discovery Biology: Tests whether a gene, protein, or small molecule modulates the earliest detectable output of PRR signaling.
- Screening: Delivers a binary, imaging-compatible readout (cell death presence/absence in overlap zone) amenable to automated scoring.
- Analytics: Enables comparison of PTI strength across genotypes or treatments via spatial quantification of defense responses.
- Translational Research: Bridges lab-based immune assays to field-relevant outcomes by modeling how early signaling affects disease resistance.
- Enterprise Reuse: Establishes a plug-and-play platform for testing diverse PAMPs, effectors, or microbial strains in a common phenotypic format.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking receptor activation to a defined immunological consequence.
- Operational Value: Requires only basic infiltration and microscopy equipment, enabling broad adoption across discovery and translational teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in agrochemical lead optimization by predicting field-relevant immune priming capacity.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on mechanistic fidelity to native PTI.
Implementation Considerations
- Expertise in plant growth, bacterial culture, and leaf infiltration techniques.
- Access to controlled-environment growth chambers with precise humidity and lighting.
- Standardized bacterial strains and optical density adjustment protocols for reproducible PAMP delivery.
- Adaptation considerations for different plant species or PAMP-effectors beyond flg22-FLS2.
- Practical limitation: Assay sensitivity to environmental variables necessitates strict growth condition controls.
