Assay עבור תבנית הפתוגן-Associated מולקולרית (PAMP)-שהופעלו חסינות (PTI) בצמחים

שלום, אני Suma TI מהמעבדה של Greg Martin במכון Voice Thompson למחקר צמחים. היום נדגים לכם פרוצדורה לבדיקה המבוססת על מוות תאי עבור חסינות המופעלת על ידי PAM, או PTI. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לבחון מעורבות של גן ב-PTI.

אם כן, בואו נתחיל. התחילו את הפרוצדורה בגידול של Nicotiana ANA עד שיגיעו לגיל של כשבעה שבועות. ארבעה עד חמישה ימים לפני התחלת התהליך.

בדיקת החסינות המופעלת על ידי PAM או PTI. יש לגזום את הצמחים כדי להסיר את כל הענפים הצמיגיים והפרחים. נסו להסיר את הענפים הצמיגיים זמן קצר לאחר הופעתם כדי להקל על הטיפול בצמחים.

לאחר הכנת הצמחים, עברו לגידול החיידקים. הליך זה משתמש בחיידקים שאינם פתוגניים להשראת חסינות הצמח לפני הזרקה שנייה של חיידקי אתגר; התחילו את גידול כל החיידקים המשמשים במערך הבדיקה. במקביל, השתמשו במקלות גליצרין קפואים של חיידקי ה-pseudomonas עבור כל מקל חיידקי pseudomonas.

מרחו כמות קטנה של חיידקים במרכז צלחת KBM המכילה את האנטיביוטיקה המתאימה, והדגירו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C למשך כ-18 עד 24 שעות. עבור ה-agrobacterium, השתמשו בצלחת טרייה שהוכנה מראש כדי להתחיל תרבית נוזלית בשני milliliters של lb. גדלו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור, וביצעו את השלבים הבאים למחרת.

הוסיפו 150 עד 200 microliters של KBM נוזלי לצלחות עם חיידשאי ה-pseudomonas. פזרו את החיידקים על פני כל הצלחת, באמצעות גורר (spreader) סטרילי.

החזירו את הפתחים לאינקובטור ל-20 עד 24 שעות נוספות. ארבעה agrobacterium. התחילו תרבית משנית בכ-5 עד 10 milliliters של LB המכיל 20 micromolar אצטון.

גדלו את התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius תחת ניעור. לאחר הכנת החיידקים, עברו להכין את הצמחים לבדיקה ביום שלפני ביצוע בדיקת ה-PTI. לאחר הכנת החיידקים, העבירו את הצמחים לחדר בטמפרטורה של 22 to 24 degrees Celsius עם לחות יחסית של כ-35 to 40% ותאורה קבועה.

בשלב הבא, השתמשו בטוש שחור עבה כדי לסמן עיגולים על העלים. בחרו עלים שהתרחבו היטב והימנעו מעלים זקנים או עלים שהם קשיחים או עבים למגע. הימנעו מסימון החלקים התחתונים של העלה.

העיגולים הם בקוטר של לפחות 1.5 סנטימטרים, וניתן לסמן בין שניים לארבעה עיגולים לכל עלה. על העיגולים להיות מרוחקים זה מזה ורצוי שלא יחצו וריד גדול. התחילו את בדיקת ה-PTI על ידי קציר החיידקים ששימשו להשראת ה-PTI.

מיני ה-pseudomonas שבהם נעשה שימוש צריכים להיות בעלי מסף חיידקי המעיד על גדילה טובה. יש לאסוף אותם מהצלחת על ידי גירוד באמצעות מקל עץ ארוך וסטרילי, ולסבסב אותם בערך ב-20 עד 25 milliliters של תמיסת Magnesium chloride בריכוז 10 millimolar עבור סבוב של agrobacterium בצנטריפוגה.

יש לאסוף את התאים מהתרבית ולסספנד (resuspend) בכ-20 עד 25 מיליליטר של 10 millimolar magnesium chloride בתוספת 10 millimolar MES pH 5.6, לחזור על הסבב של הסריפוגציה ושוב לסספנד בכ-20 עד 25 מיליליטר של תמיסת ה-magnesium chloride וה-MES. כעת, כאשר חיידקי ה-pseudomonas וה-agrobacterium המעוררים נמצאים בסספנד.

מדוד את הצפיפות האופטית של כל שלושת התרביות באורך גל של 600 ננומטר. התאם את ה-OD על ידי דילול התאים עם מגנזיום כלוריד עבור ה-pseudomonas ועם MES בתוספת מגנזיום כלוריד עבור ה-agrobacterium. ערכי ה-OD הסופיים הנדרשים מופיעים בפרוטוקול הכתוב המצורף.

נפח כולל של 25 מיליליטר של תרבית חיידקים מספיק להדבקת כ-40 עד 50 נקודות. כעת התחילו את הבדיקה על ידי הזרקה של משרהי PTI לתוך העיגולים שסומנו מראש על העלים, באמצעות מזרק של מיליליטר אחד ללא מחט. רשמו את הסדר שבו בוצעה ההזרקה לצמחים ואת השעה המדויקת שבה התחילה ההזרקה לאחר ההשראה.

בצעו את ההזרקה של אתגר הזיהום מספר שעות לאחר ההזרקה להשראה. קצרו את זני החיידקים הדרושים להזרקת האתגר כפי שהודגם בעבר עבור זני הפסאודומונאס המשרים. שוב, מדדו את ה-OD וכווןו את ריכוז התרביות בהתאם לפרוטוקול ה-GR המצורף.

התחילו את ההחדרה של גורם האתגר שבע שעות לאחר החדרת המשרה. השתמשו בשילובי המשרה והאתגר הבאים. בחרו נקודה על ההיקף של מעגל ההחדרה הראשון כמרכז של מעגל ההחדרה השני.

בצעו את חדירת האתגר באותו סדר של הצמחים שבו בוצע ההשראה. אם ישנן מספר נקודות על עלה, וודאו שהחדירות אינן חופפות. לבסוף, פזרו דילול סדרתי של כל התרביות ששימשו במדידה על מצעי KBM או LB המכילים את האנטיביוטיקה המתאימה.

יומיים לאחר ההזרקה המאתגרת, ניתן להתחיל להעריך את תגובת ה-PTI. יומיים לאחר ההשראה וההזרקות המאתגרות, חפשו הופעה של מוות תאי עקב חסינות המופעלת על ידי אפקטורים (ETI) בנקודות שנחשפו ל-PST DC 3000. מוות תאי בתוך אזור החפיפה של ההסניפה מעיד על קריסת ה-PTI ויש לדרגו כפנוטיפ חיובי. ארבעה עד חמישה ימים לאחר ההשראה וההזרקות המאתגרות, חפשו הופעה של מוות תאי עקב מחלה בנקודות שנחשפו למוטנט DC 3000 hop Q1 או ל-PS back high שוב. חפשו קריסת PTI המתבטאת במוות תאי עקב מחלה באזור החפיפה של ההסניפה. המשיכו לעקוב אחר הצמחים עד שגם אלו שאינם פגועים ב-PTI יחלו להראות מוות תאי באזור החפיפה של ההסניפה.

צמחים שבהם השתיקה של FLS two בוצעה סובלים מפגיעה ב-PTI יומיים לאחר החדרת שילוב ה-PFDC. מוות של תאים נראה באזור החפיפה, מה שמעיד על קריסה של ה-PTI. צמחי ביקורת שלא עברו השתקה של אף גן הוחדרו גם הם עם שילוב ה-PFDC ונבחנו יומיים לאחר ביצוע הבדיקה; מוות של תאים עקב האתגר נראה מחוץ לאזור החפיפה אך לא בתוכו, וזאת בשל תגובת PTI תקינה.

הדגמנו כעת כיצד לבצע בדיקה המבוססת על מוות של תאים עבור חסינות המופעלת על ידי פתוגנים או PTI. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על הצמחים בתנאים הסביבתיים שאנו ממליצים עליהם. רמות לחות גבוהות יותר ישפיעו לרעה על הצמחים ויגרמו לבדיקה להתקדם במהירות רבה יותר.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.