דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

דילול משלימה (Complement depletion) היא שיטה מהירה, יעילה וזולה לניקוי אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון. דילול משלימה מתחיל כאשר נוגדני IGM או IgG מונוקלונליים מתווספים לאוכלוסיית תאים, ובכך הם מטרגים סוג תא ספציפי. בדוגמה זו, נטרג תאי T לצורך דילול.

לאחר מכן מוסיפים את מערכת המשלב (complement system) העוברית קסקדת פרוטאוליטית, המובילה למות תאי T. אוכלוסיית התאים עוברת שטיפה באמצעות סנטריפוגה וסינון כדי להסיר תאים מתים ושיירי תאים. שיטה זו של דילול משלב מובילה בדרך כלל להסרה של 95 עד 100% מאוכלוסיית התאים המיועדת.

שלום, אני בוני דיטל. אני חוקרת במכון למחקרי דם של מרכז הדם של ויסקונסין הממוקם במילוואקי. היום אראה לכם את טכניקת דילול במשלים (complement depletion), שיטה מהירה וזולה לדילול של אוכלוסיות תאים ספציפיות.

אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלי כדי להעשיר באופן משמעותי אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון, המשמשות אותנו לאחר מכן למספר מבחנים ביולוגיים, כולל כאלו העוסקים בהפעלת תאים ובניתוח ביטוי חלבונים. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הניסוי, הכינו אליקוטים של 0.5 או 1 milliliter של משלים של ארנבת ואחסרו אותם במקפיא של 20- או 80- מעלות צלזיוס.

יש לוודא שביצעתם טיטרציה של המשלים כדי להגיע לדילול אופטימלי שבין 1:10 ל-1:20. מקור מסחרי מצוין למשלים שאנו משתמשים בו באופן שגרתי להליך זה הוא Pereze biologicals; נוגדנים מונוקלונליים של עכבר ונחש הם בדרך כלל יעילים להפעלה של המשלים, אך לא כל הנוגדנים יהיו מתאימים. נוגדני IgM הם בדרך כלל היעילים ביותר עבור ליזיס של תאים המושרה על ידי המשלים.

נוגדני IgG הם השניים ביעילותם ובדרך כלל נעשה בהם שימוש מכיוון שרוב הנוגדנים המונוקלונליים הם IgG; יש לבצע תיתור (titration) לכל נוגדן כדי להגיע לשימוש אופטימלי בצפיפות תאים של 10⁷ תאים למילליליטר, הנקבעת באופן אמפירי. רוב הנוגדנים נמצאים בשימוש בטווח של 0.1 עד 10 מיקרוגרם למילליליטר. לצורך דילול (depletion) של תאי T מהטחול, אנו משתמשים בנוגדן מונוקלונלי ספציפי ל-TH1.

כדי להתחיל בתהליך של דלל משלים (complement depletion), יש לדלל את התאים במצע גידול תאים המכיל 5% סרום של עגל עובר שעבר אינאקטיבציה תרמית, כך שאוכלוסיית התאים ההתחלתית תהיה 2×10⁷ תאים למיליליטר. לדוגמה, יש לדלל 5×10⁷ תאים ב-2.5 מיליליטר של מצע. נפח תאים זה מהווה מחצית מהנפח הסופי, ולפיכך הוא כפול מריכוז התאים המשמש במהלך הדלל, אשר יהיה 1×10⁷ תאים למיליליטר.

בשלב זה, שמרו עד 10⁶ תאים כדי שניתן יהיה לכמת את הדלדול בסוף הניסוי. בנוסף, הפשיתו את כמות המשלים (complement) הדרושה בטמפרטורת החדר. מצאנו שדילול של 1:15 הוא מתאים בעת שימוש ב-Pereze Biologicals rabbit complement עבור 5×10⁷ תאים; 1.5 milliliters של Eloqua קפוא מספיקים.

כעת הוסיפו את כמות הנוגדן המתאימה לתשסוף התאים וערבבו. כדי לעקר את המשליש, השתמשו במסנן קצה למזרק בעל קישור חלבון נמוך. מלאו את המזרק בשני עד שני מיליליטר של מדיום.

לפני הוספת המשלים עבור 5×10⁷ תאים, נזדקק ל-340 מיליליטר של משלים בדילול של 1:15. לאחר מכן, סננו את המשלים ישירות אל המבחנה המכילה את התאים והנוגדן. כעת, התאימו את הנפח הסופי במבחנה כך שהתאים יהיו בריכוז של 1×10⁷ תאים למיליליטר.

לאחר מכן, יש להקרין את התאים ב-37 degrees Celsius באמבט מים למשך שעה אחת. זכרו לערבב את התאים בכל 15 דקות באמצעות היפוך עדין. לאחר האינקובציה, סבב את התאים בצנטריפוגה במהירות שלא תפגע בחיוניותם.

לאחר מכן, חזרו למנדף והסילו את הנוזל העליון (supernatant). לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם 10 milliliters של מצע גידול. שימו לב כיצד שיירי התאים נאספים, כאשר חלקם נדבקים לדפנות של מבחנות הפוליסטירן.

לאחר השטיפה האחרונה, סננו את התאים באמצעות מסנן תאים סטרילי מניילון של 70 micron. לבסוף, בדקו את טוהר התאים על ידי השוואת אוכלוסיית התאים הרלוונטית לפני ואחרי ה-depletion flow.

ציטומטריה ואימונוהיסטוכימיה הן השיטות המועדפות לקביעת טוהר התאים לפני הניסוי. כאשר משתמשים בנוגדן מונוקלונאלי בעל יעילות גבוהה בהפעלת משלימה, הסבב הראשון של דילול המשלימה יסלק יותר מ-95% מהתאים. כדוגמה, בשימוש בציטומטריה של זרימה למדידת אחוז תאי alpha beta T בהכנה של תאי ple cyte מעכבר, מצאנו כי הם הכילו 32.2% תאי alpha beta T לאחר דילול משלימה עם anti five one, המובע על ידי כל תאי ה-T, אך לא על ידי לוקוציטים אחרים. אוכלוסיית TCR beta הופחתה ב-95% לריכוז סופי של 1.56%.

הרגע הצגתי בפניכם שיטה מהירה ויעילה לדילול אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בדילול באמצעות מחמאה. בעת ביצוע הליך זה, זכרו לבחון את היעילות של כל נוגדן ולבצע תיתוּר של המחמאה בניסוי חלוצי לפני שתתחילו. זהו הכל.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.