בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל
28 בינואר 2010
חלל הצפק ביונקים מכילה אוכלוסיות תאים שונות החיסונית חיוני תגובות חיסוניות מולדות. שיטת בידוד יעיל נדרש ניתוח ביוכימי ותפקודי של תאים אלה. כאן אנו מספקים שיטה מקיפה עבור בידוד של תאים חלל הצפק בתוך העכבר.
בידוד תאים מחלל הפריטונאום מתחיל בהנחתו של עכבר שעבר הריגה על גבו. העור החיצוני של הפריטונאום נחתך ומוסת בעדינות כדי לחשוף את העור הפנימי. PBS עם 3% FBS מוזרק לחלל הפריטונאום, ולאחר מכן מעסים בעדינות את הפריטונאום. הנוזל המכיל את תאי הפריטונאום נאסף ומונח בשפור של 15 מיליליטר על קרח.
את התאים שוטפים פעם אחת וסופרים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). היי, אני אוג'י מהמעבדה של ד"ר בון במכון למחקרי דם של מרכז הדם של ויסקונסין. היום נראה לכם פרוצדורה לבידוד תאים מחלל הפריטונאום של עכבר.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי להשיג תאים עבור בדיקות פנוטיפיות, ביוכימיות ואימונולוגיות שונות. בעיקר, אנו מעוניינים באוכלוסיות של תאי B פריטוניאליים. אז בואו נתחיל.
לפני תחילת בידוד תאי מערכת החיסון מחלל הפריטונאום, הכינו את כל החומרים הדרושים. התחילו באיסוף דלי קרח, מזרק של 5 ml עם מחט בכיול 27G, מזרק של 5 ml עם מחט בכיול 25G, בלוק קלקר וסיכות לקיבוע העכבר. הכינו מגש להחזקת בלוק הקיבוע, מספריים, פינצטה ומבחנות איסוף לפני תחילת הניתוח.
קררו מראש PBS המכיל 3% fetal calf serum. שמרו את התמיסות הללו ואת מבחנות האיסוף על קרח לאורך כל הניסוי. לאחר מתן חומר הרדמה והמתנסה מתאימה, רססו את העכבר ב-70% ethanol והניחו אותו על גבו מעל בלוק styrofoam או משטח ניתוח. באמצעות פינצטה ומספריים, חתכו את העור החיצוני של הפריתונאום.
משכו בעדינות את העור לאחור כדי לחשוף את העור הפנימי המצפה את חלל הפריטונאום. תוך הקפדה לא לנקב איברים כלשהם, דחפו לאט מחט בנחיר 27 לתוך הפריטונאום. הזריקו חמישה milliliters של PBS קר מאוד לתוך חלל הפריטונאום.
כעת עסו בעדינות את הפריטונאום (peritoneum) כדי לעודד את התאים להיפרד מדופן הפריטונאום וליפול לתוך תמיסת ה-PBS. לאחר מכן, הרכיבו על מזרק של 5 mL מחט בכיול (gauge) 25 כאשר צד השפית פונה כלפי מעלה, והחדירו את המחט אל הפריטונאום. אספו כמה שיותר נוזל כדי להגדיל את תנובת התאים.
בזמן ביצוע פעולה זו, הזיזו בעדינות את הקצה כדי למנוע מרקמת שומן או מאיברים אחרים לחסום את המחט. הוציאו את המחט ורוקנו את תרחיף התאים לתוך מבחנות איסוף מפוליפרופילן. אספו את שארית הנוזל מהחלל על ידי ביצוע חתך בעור הפנימי של הפריטונאום.
השתמשו בפינצטה כדי להפריד את העור בזמן שאתם משתמשים בפיפטה פלסטית אחורית לאיסוף כל נוזל שנותר. לבסוף, סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה למשך שמונה דקות במהירות של 1500 RPM, השליכו את הסופרנאטנט והשעיקו מחדש את התאים ב-5 milliliters של PBS. ספירה של התאים באמצעות המוציטומטר.
שימוש בשיטת הדחת trypan blue יאפשר את קביעת מספר התאים. בדרך כלל ניתן לבודד בין 5 ל-10 מיליון תאים מהחלל הפריטונאלי של עכבר שלא עבר מניפולציה. 50 עד 60% מכלל אוכלוסיית התאים יהיו תאי B.
כ-40% יהיו מקפגים ותאים גרנולוציטיים, וחמישה עד 10% יהיו תאי T. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבודד תאים מחלל הפריטונאום של עכבר. בעת שימוש בפרוצדורה זו, חשוב להגביל את כמות הדם באוכלוסיית התאים של חלל הפריטונאום על ידי ביצוע דה-יוטנזיה זהירה לעכברים והימנעות מניקור של איברים כלשהם בחלל הפריטונאום.
הקפידו להשליך כל דגימה שזוהמה בדם. זהו כל הפרוטוקול. תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מפורטת לבידוד תאים מחלל הפריטונאום של עכברים, דבר החיוני לחקר תגובות חיסוניות. הפרוצדורה תוכננה כדי להבטיח את שלמותן של אוכלוסיות התאים לצורך ניתוחים עוקבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביוכימיה
רקע
- חלל הפריטונאום מכיל סוגים שונים של תאי מערכת החיסון.
- תאים אלו ממלאים תפקיד חיוני בתגובות חיסוניות מולדות.
- שיטות בידוד הן קריטיות למחקרים תפקודיים וביוכימיים.
- הבנת תאים אלו יכולה לסייע במחקר אימונולוגי.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה לבידוד תאים מחלל הפריטונאום.
- הקל על חקר אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בעכברים.
- שיפור הדיוק של בדיקות אימונולוגיות עוקבות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדרה של העכבר והכנה לניתוח.
- הזרקת PBS עם 3% FBS לחלל הפריטונאום.
- איסוף הנוזל המכיל תאי פריטונאום.
- צנטריפוגציה וספירה של התאים המבודדים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של 5 עד 10 מיליון תאים מחלל הפריטונאום.
- זיהוי של 50-60% מהתאים כתאי B.
- כ-40% הם מקרופאגים וגרנולוציטים.
- 5 עד 10% מהתאים הם תאי T.
מסקנות
- השיטה יעילה לבידוד תאים חיסוניים מחלל הפריטונאום.
- המתנזיה וניתוח זהירים הם קריטיים כדי למנוע זיהום בדם.
- ניתן להחיל הליך זה על מחקרים אימונולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
בידוד תאי חיסון מחלל הפריטונאום מאפשר תיקוף של מטרות בשלב מוקדם על ידי מתן גישה לתתי-אוכלוסיות מוגדרות פנוטיפית של תאי B ומקרופאגים. הדבר תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליכי הגילוי באמצעות אספקת תשומות של תאים ראשוניים הניתנים לשחזור עבור בדיקות תפקודיות. השיטה מגבירה את רמת הביטחון החזוית בזיהוי מובילים (leads) באמצעות התאוששות סטנדרטית של אוכלוסיות חיסוניות הרלוונטיות לסריקת תרופות אימונומודולטוריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תתי-אוכלוסיות של תאים מסוג B1a ו-B1b לצורך בדיקה של היפותזות טיפוליות במודלים של אוטו-אימוניות וזיהומים.
- ערך מדעי: מספק מקרופאגים נאיביים תלויי-רקמה לצורך הבהרת מסלולים במחקרי תגובה חיסונית מולדת.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות בידוד עקבי של אוכלוסיות תאי חיסון לצורך סריקת מעורבות מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לניתוח פנוטיפי באמצעות ציטומטריה של זרימה ובדיקות ביוכימיות.
- ערך תפעולי: הבטחת סטנדרטיזציה של הבדיקה והדירותה באמצעות תנובה מבוקרת של תאים (5–10 מיליון תאים לעכבר).
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה אמינה של תרכובות באמצעות התאוששות כמותית של B cells (50–60%), מקרופאגים (40%) ו-T cells (5–10%).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטי למחלה על ידי בידוד תאי B1 אוטוראקטיביים ותתי-אוכלוסיות רגולטוריות המייצרות IL-10.
- ערך תפעולי: מקל על התאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים באמצעות בידוד תאי B1 המפרישים IgM טבעי.
- ערך תפעולי: מאפשר המשכיות פרה-קלינית על ידי אספקת תאי חיסון ראשוניים למעקב מכניסטי במודלים של מחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת תאי חיסון ראשוניים לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות ומחקרים מכניסטיים פרה-קליניים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים באמצעות בידוד של תתי-אוכלוסיות מוגדרות של תאי B ומקרופאגים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות בידוד תאים סטנדרטי והשגה של אוכלוסיות חיסוניות חיות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של תתי-אוכלוסיות תאים באמצעות ספירה בהמוציטומטר ושיטות החרגת חיוניות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות בידוד של תאי B1 הקשורים לחסינות טבעית ולרגולציה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת ניתנת לשימוש חוזר להשגת תאי מערכת החיסון בתוכניות גילוי בתחומי האימונולוגיה והאונקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באישור מטרה באמצעות גישה לתתי-אוכלוסיות חיסוניות המאופיינות פנוטיפית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות תבואת תאים והתפלגות תתי-אוכלוסיות מוגדרות.
- ערך אסטרטגי: שיפור קבלת החלטות מסוג go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בסריקת אימונומודולטורים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון באמצעות תשומות אמינות של תאים ראשוניים עבור פאנלים של בדיקות תפקודיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בנתיחה של עכברים ובטכניקה אסיפטית כדי למנוע פגיעה באיברים וזיהום בדם.
- תלוי בציוד הכולל מזרקים, מחטים, צנטריפוגה והמוציטומטר לצורך עיבוד וספירת תאים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להכנת PBS/FBS וטיפול בשרשרת קירור כדי להבטיח עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום במודלים של מחלות המשנים את תכולת התאים בחלל הפריטונאום.
- מוגבל על ידי הצורך בהמתסיה ונתיחה זהירות כדי למנוע זיהום בדם, הפוגע בשלמות הדגימה.
