הנדסה Cell-חדיר חלבון
December 28th, 2009
התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.
ניתן להשיג את המניפולציה של תפקוד התא באמצעות הגישות הקלאסיות של טרנספקציה של DNA או התמרה ויראלית במהלך 15 השנים האחרונות. שיטה אחרת התפתחה. ניתן להעביר את החלבון הפעיל הביולוגי של העברת החלבון ישירות לתאי יונקים באמצעות פפטידים קטנים המאוחים לחלבון המבוקש, מה שמקדם ספיגת תאים.
מכיוון שלא נעשה שימוש ב-DNA, נמנע הסיכון לאגנזה במאמץ. בניגוד לשיטות הקלאסיות שהוזכרו לעיל. התמרת החלבון מאפשרת העברת חלבונים באופן הניתן לטיטרציה.
יתר על כן, ניתן לווסת אוכלוסיות תאים קטנות כמו גם תאים שאינם מתחלקים, כגון נוירונים פוסט-מיטוטיים. כדי לבטא חלבון רקומביננטי בצורה יעילה, אנו ממליצים להשתמש במערכת וקטור Paciz. זוהי מערכת וקטורית מודולרית המורכבת ממסוף קצה וגרסה מסוף C.
שני הווקטורים מאפשרים החדרה קלה של הגן המעניין שלך לאמצעי הטיהור. משולב תג היסטידין כמו גם תחום התמרת חלבון. במקרה שלנו, מגע מנגיף ה- HI המקדם ספיגה תאית להפצה תאית.
אות לוקליזציה גרעינית משלים את הווקטור מסיבות בקרה ניתן פשוט להסיר תגי היתוך. מלבד זאת, לסידור התגים הללו יכולה להיות השפעה רבה על תכונות חלבוני ההיתוך. ההשפעה על היבול והטוהר, כמו גם על יכולת המכירה והתפקוד הביולוגי אינה ניתנת לחיזוי.
היי, שמי ברנרד מוס ואני עובד בקבוצת הנדסת תאי גזע במכון לנוירוביולוגיה משחזרת בבונד, גרמניה. היי, שמי כריסטוף פ ואני גם חבר במעבדת הובר. קבוצת העבודה שלנו מנצלת באופן אינטנסיבי את טכניקת התמרת החלבון כדי להעביר ישירות חלבון פעיל ביולוגי לתאי יונקים שונים, והיום אנו רוצים להדריך אתכם בתהליך הביטוי והטיהור באי קולי וממנו.
לאחר מכן, ברצוננו להראות לך כיצד ליישם חלבון היתוך קבוע של תאים בתרבית תאים כדי להדגים את כל הביטוי, הטיהור והיישום של ההליך. אנו עושים שימוש ברקומבינציה הספציפית לאתר Cree כדי לשנות גנטית תאי גזע אוניק של עכברים. אוקיי. אוקיי. בואו נתחיל.
כדי לחסן את תרבית הלילה, אנו משתמשים בחיידקים שכבר עברו טרנספורמציה המאוחסנים במאגר גליצרול בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. חיידקים אלה כבר מכילים את קידוד הווקטור לרקומבינציה. בעזרת קצה פייפר, אנו מגרדים כמות קטנה של החיידקים על קצה הפייפר ומפילים אותה לתוך הכוס המכילה את תרבית הלילה.
תרבית הלילה מורכבת ממדיית LB בתוספת גלוקוז בריכוז סופי של 0.5% ו-50 מיקרוגרם אינסולין פחמני למ"ל. לאחר מכן מכניסים את הכוס לאינקובטור הפועל ב-37 מעלות צלזיוס לביטוי של Recombinate Cree הספציפי לאתר. אנו משתמשים במדיה של שחפת לפני המלחמה לתרבות הביטוי בקנה מידה גדול שלנו.
כדי להאיץ את הביטוי, אנו ממליצים להשתמש בחומר שחפת המחומם עד 37 מעלות צלזיוס, המייצג את הטמפרטורה במהלך ביטוי החלבון הרקומביננטי. לאחר מכן, אנו מוסיפים גלוקוז לתקשורת השחפת בריכוז סופי של oh 0.5%הגלוקוז מונע ביטוי בסיסי מוגבר של חלבון ההיתוך במהלך צמיחת תרבית הביטוי לפני האינדוקציה. לבסוף, אמפיצילין מתווסף לתרבית הביטוי בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למ"ל כדי להבטיח תרבית טהורה המכילה רק את החיידקים שעדיין מכילים את קידוד הפלסמיד לחלבון גזירה.
עכשיו אנחנו יכולים לקבל את תרבות הלילה שלנו ולחסן את תרבות הביטוי ביחס של 1 ל-50. לאחר מכן הכוסות מועברות לאינקובטור הפועל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. עליך לקחת דגימות כדי למדוד את הצפיפות האופטית על בסיס קבוע לאורך הביטוי.
ברגע שהתרבית הגיעה לצפיפות אופטית של 1.5, החיידקים מושרים בריכוז סופי של oh 0.5 מילי-מולרי של IPTG. לאחר שעה אחת של אינדוקציה, תרבית הביטוי מועברת לצינורות ולאחר מכן נקצרת באמצעות צנטריפוגה. לשם כך אנו משתמשים ברוטור SLA 3000.
הצנטריפוגה פועלת במהירות של 5,000 כדורים לדקה למשך 10 דקות בארבע מעלות לפני הדרך. לאחר מכן מושלכת החטיפה וניתן לאחסן את כדור החיידקים ללא הגבלת זמן במינוס 20 מעלות צלזיוס. הכדורים הקפואים מושעים מחדש במאגר ליזה, ערעור המתאים לליטר אחד של תרבות ביטוי.
אנו משתמשים ב -10 מ"ל של מאגר ליזה ממתינים כ -15 דקות עד שהתמיסה תהיה הומוגנית. לאחר מכן מתווסף מיליגרם אחד של ליזוזים לכל ML של מתלה. התמיסה מעורבבת במשך 20 דקות כדי לאפשר לאנזים לפתוח את החיידקים.
לאחר מכן, Benson Nase מתווסף בדילול של 1 עד 1000 למשך 15 דקות נוספות, מה שיחתוך את ה-DNA וכתוצאה מכך תמיסה לא צמיגה. לבסוף, נעשה שימוש בבן אטור כדי להבטיח ליזה של התאים. התוכנית פועלת במשך דקה וחצי בהספק של 45% לאחר סיום ההסמכה.
זכור לקחת דגימה של כל שלב כאן, הליזאט הגולמי או ניתוח דף SDS של הטיהור. כעת חשוב מאוד להוסיף מ"ל אחד של מאגר TSB קר כקרח לכל מ"ל של תרחיף מכיוון שחלבון צו נוטה לשקע בתוך מלאי הגליצרול. אם אתה מתכוון לדלג על שלב זה, הפתרון מתערבב תוך זמן קצר והגס מוכן כעת לצנטריפוגה.
לשם כך אנו משתמשים ברוטור SS 34. הצנטריפוגה פועלת במהירות של 17,000 סל"ד למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסיום, צנטריפוגה בע"מ העבירה בזהירות את הסופרנטנט S לתוך שפופרות פלקון טריות של 50 מ"ל.
כעת הוסף תמיסת ניקל אנטי A לניקל הסופרנטנט. אנטי A הוא מגיב חיוני לטיהור נכון של חלבוני ההיתוך הטכנולוגיים של היסטידין. ההיסטידין יוצר קומפלקס עם יוני הניקל המאפשרים טיהור זיקה כעת מנערים בעדינות את צינורות החניה למשך 60 דקות ב-40 מעלות צלזיוס.
לאחר שעה, כעת תוכל למרוח את המתלה על עמודות של 20 מ"ל ולאפשר לתמיסה לעבור דרך זרימת כוח הכבידה. עבור הפקות בקנה מידה גדול, ניתן לפצל את המתלה למספר עמודים. לאחר מכן אנו שוטפים את העמוד פעמיים עם מאגר המכיל 15 מילימולר של אינרסולה.
כמות החיץ המופעלת תלויה בנפח השרף. שני MLS של ניקל NTA תואמים למ"ל אחד של שרף לאמצעי כביסה. הנחנו חמישה נפחי שרף של מאגר כביסה על העמוד לאחר הכביסה, כעת אנו מוכנים להתחמק מהחלבון שלנו.
לכן, אנו משתמשים במאגר פליטה בריכוז של 250 מילי-מולרי של חיסון. אז שימו לב כיצד צבע השרף משתנה לכיוון ירוק. בשל הריכוזים הגבוהים של חלבון CRE, חלק ה-OID לפעמים מתערער.
כדי למנוע זאת, ערבבו את התמיסה והוסיפו מאגר ליס נוסף, כל השברים נאספים כעת ומועברים לאחר מכן לצינורות ליזה. ליזה תסיר את שלב הדיאליזה הראשון מבוצע כנגד המאגר המכיל ריכוז גבוה של מלח. לאחר שעה, מאגר המלח הגבוה מוחלף והליך הדיאליזה מוחל בן לילה.
למחרת, צינורות הדיאליזה מוציאים ממאגר המלח הגבוה ומועברים למאגר גליצרול. לאחר שלוש עד חמש שעות, מאגר הגליצרול מוחלף ודיאליזה מבוצעת שוב בן לילה. ליזה כנגד מאגר גליצרול תביא לתמיסת מלאי מרוכזת פי שלושה לפחות.
כעת ניתן לאחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך מספר שנים ללא אובדן פעילות לצורך אבטחת איכות, אתה יכול לטעון את דגימות דפי ה-SDS שנאספו על ג'ל ולהכתים אותו לאחר מכן. עבור קמאסי, ניתן לזהות את חלבון ההיתוך של Cree כרצועה בולטת במקטע ה-OID. על מנת להשתמש בריכוז המתאים של רקומבינציה של צוות, עליך לקבוע את הריכוז באמצעות בדיקת רדפורד.
כיצד ליישם חלבונים קבועים כל כך בתאי יונקים. קודם כל, הכינו את תאי המטרה שלכם על מנת להשיג את יעילות העברת החלבון הגבוהה ביותר. ראה תאים חד-שכבתיים בצפיפות וכתוצאה מכך שכבת תאי המפגש של 80 עד 90% למחרת למקרה שתאי המטרה שלך הם תאי כן, הגדלים במושבות קומפקטיות.
הפרד את התאים ובאופן סומטי וראה אותם בתרחיף תא בודד חמש שעות מראש. חשוב לבצע תרחיף תא בודד לפני העברת חלבון מכיוון שאחרת ניתן להעביר רק תאי אוויר על פני המושבה. שאפו את המדיה והתבוננו בתאי האוויר לזמן קצר עם PPS לפני ניסיון הטיפול.
הסירו את החומר הנותר כן, חומר גולמי המכיל סרום. לאחר שאיפת ה- PPS מכסה תאים בטפטוף ותן להם לדגור שלוש עד חמש דקות. כעת בדוק במיקרוסקופ אם כל המושבה מגיעה מומסת לתאים בודדים.
הסיבות שהוזכרו זה עתה, זהו שלב מכריע להתמרת חלבון לתאי כן. העבר תאים מנותקים לצינור. הנח את הצינור בשולחן, צנטריפוגה וסובב תאים כלפי מטה, שאב את סוכן העל והשהה מחדש את התא.
P במצע גידול מדלל תאים למספר תאים מתאים. זה כמובן תלוי בגודל תרבית הרקמות. צלחת דוגרת על תאי האוויר למשך חמש שעות נוספות.
זה ייתן לתאי האוויר מספיק זמן להיצמד לתחתית ולצמוח דבקים. ניתן לאחסן מלאי של שלוש שורות מחלקה במינוס 20 מעלות למשך יותר משנתיים. כאשר עובדים עם חלבון היתוך קבוע של תאים רקומביננטיים, כדאי מאוד שיהיה פתרון מלאי כזה שניתן להשתמש בו לפי דרישה.
בזמן ההמתנה שהתאים יתחברו למנה, אפשר להכין את אמצעי התמרת C פשוט לדלל נפח מתאים של חלבון זחילה קבוע של תאים ממלאי הכולסטרול לתוך עצמך. מדיה. מכיוון שתמיסת המניות של קלייר עדיין אינה סטרילית, יש לסנן את המדיה הטרנסית לפני היישום שלה. אנו ממליצים להשתמש במזרק שניתן להבריג על מסנן קשירת חלבון אונה.
ריכוז הנחל הסופי תלוי בסוג התא או בתוספי המדיה. לדוגמא, לסרום יש השפעה שלילית חזקה על יעילות ההעברה. ניתן להתגבר על כך על ידי שימוש במדיה נטולת סרום או על ידי ריכוז נחל מוגבר.
אנו מוצאים את המצב האופטימלי המאפשר יעילות רקומבינציה גבוהה ביותר. ריכוז גזירה הידראטי החל מ -0.5 עד 10 מיקרומולר. אנו ממליצים לבדוק זמני דגירה שונים בין שש ל-18 שעות.
לאחר חמש שעות של דגירה, הוצא את תאי המטרה שלך ושאף מדיה צולבת. לאחר מכן, אנו מחליפים אותו באמצעי העברת חלבונים, מחזירים את תאי האוויר לחממה לאחר דגירה של לילה. שטף לזמן קצר תאי D עם PPS ושינה את אמצעי העברת החלבון למדיה ES רגילה.
48 שעות לאחר הדגירה של התא ניתן לזהות ביטוי גן Cree vent קבוע באמצעות xul. תאי צביעה עם פנוטיפ בגה חיובי הונדסו גנטית בהצלחה על ידי רקומבינציה ספציפית לאתר. קרי הדו"ח.
התאים מכילים CRE משתמשים במבנה Lae על רקומבינציה מתווכת מראש. רצף עצירת אגף P נעול נכרת וגן מדווח יוקרתי מופעל מונע על ידי מקדם הצוות. על מנת להעריך את יעילות הרקומבינציה בתאי אוויר מדווחים שטופלו מראש, יש לתקן תאי אוויר.
שאיבה של תאי שטיפת מדיה פעמיים עם תאי שכבת PBS עם 4% PFA ודגירה של תאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף תאים שוב שלוש פעמים עם PBS. לאחר שאיבת ה-PBS משלב הכביסה האחרון בתמיסת Xal Stain לבארות, דגרו תאים למשך הלילה ב-37 מעלות באינקובטור.
למחרת, ניתן לנטר את פעילות ביל על ידי תאי צווארון כחול. ניתן לקבוע את יעילות הרקומבינציה לפי מספר המושבות הכחולות. בתנאים אופטימליים, אתה אמור להיות מסוגל להשיג יעילות רקומבינציה גבוהה מ-90%בסדר, היום הראינו לך כיצד לבטא ולטהר רקומבינציה של שאילתה ספציפית לאתר מ-e coli.
במחקר הוכחה עקרוני זה, הצלחנו לגרום לרקומבינציה ברוב המלחים. אוקיי, זהו זה. בהצלחה עם הניסויים שלך.
סקירה
מאמר זה דן בטרנסדוקציה של חלבונים כשיטה להעברת חלבונים פעילים ביולוגית ישירות לתאים של יונקים. בניגוד לשיטות מסורתיות כמו טרנספקציה של DNA, טרנסדוקציה של חלבונים היא לא פולשנית ומאפשרת מניפולציה תאית יעילה ללא הסיכונים הקשורים בשינויים גנטיים קבועים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של תאים
- הנדסת חלבונים
רקע
- שיטות קלאסיות למניפולציה תאית כוללות טרנספקציה של DNA וטרנסדוקציה ויראלית.
- טרנסדוקציה של חלבונים משתמשת בפפטידים קטנים כדי לשפר את הספיגה התאית של חלבונים.
- שיטה זו מועילה במיוחד לתאים שאינם מתחלקים, כמו נוירונים פוסט-מיטוטיים.
- מערכת וקטור הפאציז מומלצת להבעה יעילה של חלבונים רקומביננטיים.
מטרת המחקר
- להדגים את תהליך ההבעה והטיהור של חלבונים ב-E. coli.
- להמחיש את היישום של חלבוני פיוז'ן תאיים קבועים בתרבית תאים.
- לחקור את השימוש בשילוב מחדש ספציפי לאתר לשינוי גנטי של תאי גזע.
שיטות בשימוש
- חיסון של תרבויות ליליות מחיידקים שעברו טרנספורמציה.
- שימוש במדיום LB ומדיום TB להבעה של חלבונים.
- גירוי של הבעת חלבון באמצעות IPTG.
- טיהור של חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה לניקל.
תוצאות עיקריות
- הבעה מוצלחת של חלבונים רקומביננטיים ב-E. coli.
- טיהור יעיל של חלבוני פיוז'ן מסומני היסטידין.
- הדגמה של טרנסדוקציה של חלבונים בתאים של יונקים.
- תובנות לגבי השפעת תגי הפיוז'ן על מאפייני החלבון.
מסקנות
- טרנסדוקציה של חלבונים היא אלטרנטיבה קבילה לשיטות שינוי גנטי מסורתיות.
- מערכת וקטור הפאציז מאפשרת הבעה וטיהור יעילים של חלבונים.
- יש צורך במחקר נוסף כדי לייעל את מאפייני חלבוני הפיוז'ן ליישומים ספציפיים.
