Name: הנדסה Cell-חדיר חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 8 s
Description: למדו הנדסת חלבונים חדירי-תאים לתפעול תאים יונקים ללא שינוי גנטי קבוע. השיטה מאפשרת מסירה ישירה של חלבונים פעילים לתאים שאינם מתחלקים כמו נוירונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אוליבר Brüstle וכל חברי קבוצת תא גזע להנדסה, אוניברסיטת בון, לתמיכה ודיונים יקר. אנו מודים סבין שנק להכנת SDS-PAGE ותמיכה מתמשכת לאורך הפרויקט. ניקול ראס ואנה Magerhans סיפק תמיכה טכנית מעולה. יתר על כן, אנו רוצים להודות אנדריאס בר שילה Mertens להפקת הסרט. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן פולקסווגן (Az I/77864) ומשרד הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF, 01 GN 0813).

בנייה של וקטור הביטוי הביטוי: וקטור pSESAME-Cre ביטוי נבנה על ידי הוספת קטע Cre קידוד לתוך pSESAME דרך אתרי AvrII ו NheI הגבלה באמצעות שיטות שיבוט סטנדרטיות. pSESAME מקודד חלבון איחוי המורכב תג-היסטידין, TAT-תחום, רצף NLS ו Cre, מקוצר HTNCre. עבור ביטוי HTNCre pSESAME-Cre הפך (DE3) TUNER pLacI ומשומשים להכין מלאי גליצרול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות על הלילה היה מחוסן באמצעות קצה pipet מצופה חיידקים הפך ממלאי גליצרול. תרבות הלילה מעל כללה התקשורת LB בתוספת גלוקוז 0.5% [v / v] ו carbenicillin בריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו הורשה לגדול ב 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת גדל בצפיפות יתר לילה תרבות שימש לחסן את התרבות ביטוי ביחס של 1 עד 40 ו הושם באינקובטור ב 37 ° C. תרבות הביטוי כללה התקשורת TB בתוספת גלוקוז 0.5% [v / v] ו אמפיצילין בריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב OD 595 של 1.5 תרבות הביטוי היה מושרה עם IPTG 0.5 מ"מ 1 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך חיידקים נאספו על ידי צנטריפוגה בסל"ד 5000 למשך 10 דקות בתוך הרוטור SLA3000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורי חיידקים היו מאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לטיהור. </li></ol> טיהור של חלבון התא חדיר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקים קפואים כדורי היו resuspended במאגר מ"ל 10 תמוגה לכל תרבות בקבוק ליטר במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה הודגר אז עם ליזוזים מ"ג / מ"ל ​​1 במשך 15 דקות נוספות תוך ערבוב בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25 U / mL benzonase נוספה לאחר מכן מודגרות תוך ערבוב במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר sonification על קרח דק 1.5 עם פולסים של 0.5 ב 45% של הכוח, 1 מ"ל מלח קר חיץ טרטרית (TSB) לכל מ"ל ההשעיה נוספה בקפידה תוך ערבוב במשך 5 דקות מודגרות על הקרח. SDS-PAGE מדגם של חלק lysate (L) נלקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysate פינה הושג על ידי צנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 30,000 g. SDS-PAGE דוגמאות של שברים מסיסים (S) מסיסים (אני) נלקחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant הועבר לתוך צינורות טרי 50 מ"ל בז והיה מעורב אז בעדינות במשך שעות 1 על 4 ° C עם 2 מ"ל של 50% Ni-נ.ת. ע slurry לליטר של תרבות הביטוי הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היה דחוס לתוך טור זרימת הכבידה EconoPac (SDS-PAGE מדגם של זרימה דרך שבריר (FT) נלקח) ורחץ פעמיים עם 5 למיטה כרכים של חיץ כביסה. SDS-PAGE דגימות של שני שברים כביסה (W1 &amp; W2) נאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HTNCre המכילים שברים היו eluted עם 3 המיטה כרכים של חיץ elution מדגם של חלק eluate (ה) לצורך ניתוח SDS-PAGE נלקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Imidazole הוסר על ידי dialyzing חלק elution נגד המאגר מלח גבוה פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון חלבון היה מרוכז יותר על ידי dialyzing נגד המאגר גליצרול פעמיים. בכל השלבים דיאליזה יחס חיץ המדגם היה לפחות 50. הליך זה הביא לפתרון גליצרול המכיל מניות HTNCre בריכוז הרגיל בין 200 ל 450 מיקרומטר, כלומר, 1 ליטר של תרבות הביטוי תגרום ~ 12 מ"ג של חלבון. דוגמאות של מניות גליצרול (GS) לניתוח SDS-PAGE נאסף. פתרון HTNCre המניות יכולים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של מינוס 20 ° C. </li></ol><img border="0" src="/files/ftp_upload/1627/1627fig1tmb.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: SDS-PAGE ניתוח של דגימות שנאספו במהלך תהליך טיהור Cre recombinase. אינדוקציה של ביטוי Cre הוא הצביע על ידי הלהקה הדומיננטי חלק lysate. אמנם חלק של החלבון היא חלבון מסיס Cre ניתן להעשיר עוד יותר כפי שניתן לראות eluate ומלאי שברים גליצרול. L: lysate, אני: מסיסים, S: Supernatant, FT: זרימה דרך, W:, E כביסה: Eluate, GS: במלאי Gylcerol. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1627/1627fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. חלבון התמרה לתוך Murine גזע עובריים (ES) התאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ES נושא מותנה β-Galactosidase 5 לבנות הכתב היו זורעים כמו תאים בודדים באמצעות TrypLE ™ Express עבור ניתוק של תאים חסיד. לאחר 4 עד 6 שעות התאים לו מחדש מצורף המדיום הוסר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך תאים ES הודגרו עם המדיום HTNCre המכילים במשך 16 שעות. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות נאותה של חלבון HTNCre (המקביל ל 10 מיקרומטר) מתוך המלאי גליצרול היה מדולל לתוך מדיום ES ו filtrated סטרילי לאחר מכן (0.22 מיקרומטר). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמרה בינוני חלבון שונה בחזרה בינוני צמיחה נורמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שני תאים ימים נשטפו עם PBS וקבוע עם Paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני addiצעדים כביסה tional עם PBS הוצאו להורג לפני X-Gal מכתים בוצעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קבוע היו מכוסים בשכבה של פתרון ה-X גל מכתים 6 וטופחו על הלילה 37 ° C. </li></ol> נציג תוצאות: למחרת X-Gal פתרון מכתים היה שאף והתאים היו מכוסים בשכבה של PBS לניתוח במיקרוסקופ. 8-10% של תאים recombined יכול להיבחן בתוך תאים ES Murine להישפט על ידי פעילות β-Galactosidase.

<ol><li>Gump, J. M., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT+transduction%3A+the+molecular+mechanism+and+therapeutic+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">TAT transduction: the molecular mechanism and therapeutic prospects.</a> Trends Mol Med. 13 (10), 443-448 (2007).</li>
<li>Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+revisited%3A+novel+insights+into+the+mechanism+underlying+intracellular+delivery+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Protein transduction revisited: novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins.</a> Curr Pharm Des. 14 (34), 3628-3636 (2008).</li>
<li>Branda, C. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Talking+about+a+revolution%3A+The+impact+of+site-specific+recombinases+on+genetic+analyses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Talking about a revolution: The impact of site-specific recombinases on genetic analyses in mice.</a> Dev Cell. 6 (1), 7-28 (2004).</li>
<li>Nolden, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+in+human+embryonic+stem+cells+induced+by+cell-permeant+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination in human embryonic stem cells induced by cell-permeant Cre recombinase.</a> Nat Methods. 3 (6), 461-467 (2006).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+site-directed+recombination+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible site-directed recombination in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 24 (4), 543-548 (1996).</li>
<li>Peitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+cell-permeant+Cre+and+germline+transmission+after+transduction+into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of cell-permeant Cre and germline transmission after transduction into mouse embryonic stem cells.</a> Genesis. 45 (8), 508-517 (2007).</li>
<li>Bosnali, M., Edenhofer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transducible+versions+of+transcription+factors+Oct4+and+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Generation of transducible versions of transcription factors Oct4 and Sox2.</a> Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).</li>
<li>Landry, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx+genes+are+direct+targets+of+Scl%2FTal1+in+the+yolk+sac+and+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Runx genes are direct targets of Scl/Tal1 in the yolk sac and fetal liver.</a> Blood. 111 (6), 3005-3014 (2008).</li>
</ol>

במהלך תהליך טיהור של החלבון היתוך Cre חשוב לא להשמיט את התוספת של חיץ קרח כפות קר לפני צנטריפוגה. אחרת Cre recombinase נוטה לשקוע בתוך למאגר גליצרול. אם חלק eluate מופיע להיות עכורים בשל ריכוז גבוה של חלבון חיץ היתוך elution נוספים יש להוסיף עד לפתרון פינתה שוב. היישום של 10 מיקרומטר של חלבון היתוך Cre בדרך כלל התוצאות יעילות רקומבינציה של 80% עד 100. עוברית עגל סרום (FCS) להיות מרכיב מרכזי של המדיום הסלולרי ES מאוד מעכב חלבון התמרה. לכן ריכוז גבוה של Cre recombinase היה לשמש. כאשר עובדים בסרום ללא תנאים פחות חלבון (0.5-2 מיקרומטר) ניתן להשתמש כדי להשיג יעילות רקומבינציה דומה. עם מערכת וקטור pSESAME ב מצד אחד יכול ליישם את הטכניקה של התמרה החלבון לחלבונים אחרים, כולל גורמי שעתוק כגון Oct4 ו Sox2 7 ו - 8 Scl/Tal1.

<table><tbody><tr><td>TUNER (DE3) pLacI</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70625</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3783.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>T876.1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>4625.1</td><td></td></tr><tr><td>אימידזול</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X998.4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>2363.4</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון/פפטון</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>8952.4</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; </td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>אמפיסילין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>קרבניסילין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ליזוזיים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>בנזונז</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-טרטרית, מלח נתרן דו-ערכי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% Ni-NTA slurry</td><td>Invitrogen</td><td>R901-15</td><td></td></tr><tr><td>עמודי EconoPac</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>מסנן סטרילי 0,22&amp;mu;m</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פראפורמלדהיד (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תווך LB</td><td></td><td></td><td>תמצית שמרים, טריפטון/פפטון, NaCl</td></tr><tr><td>תווך TB</td><td></td><td></td><td>תמצית שמרים, טריפטון/פפטון, גליצרול, K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>בופר ליזיס</td><td></td><td></td><td>50 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 mM tris, pH 7.8</td></tr><tr><td>בופר מלח טרטרי (TSB)</td><td></td><td></td><td>PTB המכיל 2 M חומצה L-טרטרית, מלח נתרן דו-ערכי, ו-20 mM אימידזול</td></tr><tr><td>בופר שטיפה</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 15 mM אימידזול</td></tr><tr><td>בופר אלוציה</td><td></td><td></td><td>PTB, 500 mM NaCl, 250 mM אימידזול</td></tr><tr><td>בופר מלח גבוה</td><td></td><td></td><td>600 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>בופר גליצרול</td><td></td><td></td><td>50% גליצרול, 500 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>TrypLE&amp;#8482; Express</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESGRO (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-מרקפט&amp;#8211;תנול</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת צביעה של X-Gal:</td><td></td><td></td><td>4 mM K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;), 4 mM K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;),&lt;br/&gt;2mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 0.4 mg/mL X-Gal מומס ב-PBS</td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;(FeIII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3367</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (FeII(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-9387</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr></tbody></table>

הנדסה cell-חדיר חלבון

Engineering Cell-permeable Protein

הטכניקה התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של החומר הפעיל מבחינה ביולוגית לתוך בתאי יונקים [לבדיקה לראות 1,2]. עבור אחד זה יכול לעשות שימוש ביכולת translocating של המכונים פפטידים בתא החודר (CPPs), המיועד גם התמרה תחומים חלבון (PTDs). TAT-CPP נגזר סוג נגיף הכשל החיסוני האנושי 1 (HIV-1) תאת (טרנס activator של שעתוק) חלבון כבר בשימוש נרחב. תאת חיובי ומקדם חדירות התא ובכך להתגבר על מחסומים של קרום התא על ידי אנדוציטוזה ו / או חדירה קרום ישיר 2. בשילוב עם אות לוקליזציה גרעיני (NLS) חלבונים היתוך מסוגלים להיכנס פונקציונליות גרעין בתערוכה. מצגת וידאו שלנו מוכיח, כמו הדגמה של הנדסה של התא חדיר חלבונים, הבנייה, ייצור ויישום של גרסת התא חדיר של שינוי ה-DNA אנזים Cre. Cre הוא recombinase אתר ספציפי כי הוא מסוגל לזהות recombine 34 זוג בסיס אתרי loxP בתאי יונקים במבחנה in vivo. לכן מערכת Cre / loxP נעשה שימוש נרחב על תנאי להשרות מוטציות בגנום של תאים חיים 3,4. מסירת פעיל Cre recombinase לתאים, לעומת זאת, מהווה מגבלה. אנו מתארים את מערכת וקטור pSESAME, המאפשר החדרה ישירה של הריבית גנים של מספק פלטפורמה במהירות שיבוט תחומים שונים ותגי בשימוש בתוך וקטור בצורה נוחה סטנדרטית. סידור מחדש של תגים שונים הוכח כדי לשנות את המאפיינים הביוכימיים של חלבונים היתוך מתן אפשרות להשיג תשואה גבוהה יותר מסיסות טובה יותר. אנו מדגימים כיצד לבטא ולטהר רקומביננטי התא permeant חלבונים מ החיידק. הפונקציונליות של החלבון Cre רקומביננטי הוא תוקף בסופו של דבר על ידי הערכת הפעילות recombinase תאיים בתרבות התא.

התמרה חלבון ומאפשרת העברה ישירה של חלבונים פעילים ביולוגית לתוך התאים. בניגוד לשיטות קונבנציונליות כגון transfection DNA נגיפי או התמרה זו פרדיגמה פולשנית מאפשרת מניפולציה הסלולר היעילה ביותר באופן titratable עקיפת רעילות הסלולר את הסיכון של שינוי בשעור על ידי הנדסה גנטית קבע.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

טכניקת התעתוק של חלבונים (protein transduction) מאפשרת החדרה ישירה של חומר בעל פעילות ביולוגית לתאי יונקים [לסקירה ראו 1,2]. לשם כך ניתן...

במהלך 15 השנים האחרונות ניתן היה להשיג מניפולציה של תפקוד תאי באמצעות הגישות הקלאסיות של טרנספקציית DNA או טרנסדוקציה ויראלית. שיטה נוספת התפתחה: בטרנסדוקציית חלבונים, ניתן להחדיר חלבון פעיל ביולוגית ישירות לתאי יונקים באמצעות פפטידים קטנים המחוברים לחלבון המדובר, דבר המקדם את הספיגה התאית.מכיוון שאין שימוש ב-DNA, נמנע הסיכון להיווצרות אגנזיס. בניגוד לשיטות הקלאסיות שהוזכרו לעיל, טרנסדוקציית חלבונים מאפשרת הובלה של חלבונים באופן שניתן לתיתור (titratable).יתרה מכך, ניתן לבצע מודולציה לאוכלוסיות תאים קטנות וכן לתאים שאינם מתחלקים, כגון נוירונים פוסט-מיטוטיים. כדי לבטא חלבון רקומביננטי בצורה יעילה, אנו ממליצים להשתמש במערכת הווקטורים Paciz. זוהי מערכת וקטורים מודולרית המורכבת מווריאנט של קצה N ווריאנט של קצה C.שני הווקטורים מאפשרים הכנסה קלה של הגן המבוקש לצורך טהרה. תג היסטידין שולב יחד עם דומיין טרנסדוקציה של חלבון. במקרה שלנו, זהו רכיב מנגיח מנגיף HI המקדם ספיגה תאית לצורך הפצה תאית.אות למיקום גרעיני משלים את הווקטור; מסיבות של בקרה, ניתן להסיר את תגי ההיתוך בפשטות. בנוסף, לסידור של תגים אלו עשוי להיות השפעה משמעותית על תכונותיהם של חלבוני ההיתוך. ההשפעה על היבול והטוהר, כמו גם על היכולת למכור ותפקוד ביולוגי, אינה ניתנת לחיזוי.שלום, שמי ברנארד מוס ואני עובד בקבוצת הנדסת תאי הגזע במכון לנוירוביולוגיה רקונוסטרוקטיבית בבונד, גרמניה. שלום, שמי כריסטוף פ' וגם אני חבר במעבדת הובר. קבוצת העבודה שלנו עושה שימוש אינטנסיבי בטכניקת טרנסדוקציית חלבונים להחדרה ישירה של חלבון פעיל ביולוגית לתאים פטורים שונים, והיום אנו רוצים להדריך אתכם בתהליך הביטוי והטיהור בתוך ומתוך e coli.לאחר מכן, נרצה להראות לכם כיצד ליישם חלבון היתוך קבוע בתרבית תאים כדי להדגים את התהליך השלם של ביטוי, ניקוי ויישום. אנו משתמשים ברקומינציה ספציפית לאתר באמצעות Cre כדי לבצע שינוי גנטי בתאי גזע של עכבר. אוקיי. אוקיי. בואו נתחיל.כדי להחדיר את התרבית לגידול למשך לילה, אנו משתמשים בחיידקים שעברו טרנספורמציה וכבר מאוחסנים במאגר גליצרין בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. חיידקים אלו מכילים כבר את הווקטור המקודד לרקומינציה של decre. בעזרת טיפ של פיפט, גורדים כמות קטנה של חיידקים אל תוך הטיפ ומעבירים אותם אל תוך הכלי המכיל את התרבית לגידול למשך לילה.התרבית של הלילה מורכבת ממצע LB שנוסף לו גלוקוז בריכוז סופי של 0.5% ו-50 מיקרוגרם של carbonic insulin ל-ml. לאחר מכן, הכלי מוכנס למדגרה הפועלת בטמפרטורה של 37 °C לצורך ביטוי של ה-Recombinate Cree הספציפי לאתר. עבור תרבית הביטוי בקנה מידה גדול, אנו משתמשים במצע TB שחומם מראש.כדי להאיץ את הביטוי, אנו ממליצים להשתמש במצע TB המחומם ל-37 °C, המייצג את הטמפרטורה בזמן הביטוי של החלבון הרקומביננטי. לאחר מכן, אנו מוסיפים גלוקוז למצע ה-TB בריכוז סופי של 0.5%. הגלוקוז מונע ביטוי בסיסי מוגבר של חלבון היתוך במהלך צמיחת תרבית הביטוי לפני ההשראה. לבסוף, מוסיפים אמפיסילין לתרבית הביטוי בריכוז סופי של 100 µg/ml כדי להבטיח תרבית טהורה המכילה רק את החיידקים שעדיין נושאים את הפלסמיד המקודד עבור חלבון ה-decree.כעת ניתן לקחת את התרבית מהגידול הלילי ולהחדיר אותה לתרבית הביטוי ביחס של 1 ל-50. לאחר מכן, מעבירים את הכוסים למדגרה המופעלת בטמפרטורה של 37 °C. יש לדגום את התרבית כדי למדוד את הצפיפות האופטית באופן קבוע לאורך תהליך הביטוי.ברגע שהתרבית הגיעה לצפיפות אופטית של 1.5, משרים את החיידקים בריכוז סופי של 0.5 millimolar של IPTG. לאחר שעה אחת של השראה, מעבירים את תרבית הביטוי למבחנות ולאחר מכן קוצרים אותה באמצעות סנטריפוגציה. לצורך כך, אנו משתמשים ברוטור SLA 3000.הצנטריפוגה פועלת במהירות של 5,000 סל"ד למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. לאחר מכן נשפך העל-נוסח (supernatant) ואת משקע הבקטריות ניתן לאחסן ללא הגבלה בטמפרטורה של 20°C- . את המשקעים הקפואים מרחיפים מחדש בבופר Lysis, בכמות התואמת לליטר אחד של תרבית ביטוי.אנו משתמשים ב-10 mls של בופר lizza וממתינים כ-15 דקות עד שהתמיסה תהיה הומוגנית. לאחר מכן, מוסיפים מיליגרם אחד של lysozyme לכל ML של תרחף. התמיסה מומסת למשך 20 דקות כדי לאפשר לאנזים לפרק את החיידקים.בשלב הבא, מוסיפים Benzonase בדילול של 1 ל-1000 למשך 15 דקות נוספות, דבר שיגרום לחיתוך של ה-DNA ולהיווצרות תמיסה שאינה צמיגית. לבסוף, משתמשים בסוניקטור כדי להבטיח ליזיס של התאים. התוכנית פועלת במשך דקה וחצי בהספק של 45% לאחר השלמת התהליך.זכרו לדגום כל שלב כאן, את הליזט הגולמי או את ניתוח ה-SDS page של הטיהור. כעת חשוב מאוד להוסיף 1 ml של תמיפת TSB קרה מהקרח לכל ML של תרחיף, שכן חלבון שאינו מטוהר נוטה לשקוע בתוך מלאי הגליקרול. אם בכוונתכם לדלג על שלב זה, ערבבו את התמיסה לזמן קצר והליזט הגולמי מוכן כעת לסנטריפוגציה.לצורך כך, אנו משתמשים ברוטור SS 34. הצנטריפוגה פועלת במהירות של 17,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. עם סיום התהליך, הועבר בזהירות supernatant מהצנטריפוגה למבחנות פלקון (Falcon tubes) נקיות בנפח 50 ml.כעת הוסיפו את תמיחת הניקל-anti A לנוזל העליון. Anti A הוא ריאגנט חיוני לניקוי נכון של חלבוני היתוך עם תג היסטידין. ההיסטידין יוצר קומפלקס עם יוני הניקל המאפשר ניקוי באמצעות זיקה (affinity purification). כעת נערנער בעדינות את מבחנות הפארקינג למשך 60 דקות בטמפרטורה של 40 °C.לאחר שעה, ניתן כעת להעביר את התרחיף לעמודות של 20 ML ולאפשר לתמיסה לזרום דרכן בכוח הכבידה. עבור ייצור בקנה מידה גדול, ניתן לפצל את התרחיף למספר עמודות. לאחר מכן, נשטוף את העמודה פעמיים עם באפר המכיל 15 millimolar של innersole.כמות הבאפר המיושמת תלויה בנפח השרף. שני מיליליטרים של nickel NTA תואמים למיליליטר אחד של שרף לצורך שטיפה. אנו מוסיפים לעמודה נפח של חמישה נפחי שרף של באפר שטיפה לאחר השטיפה, וכעת אנו מוכנים לבצע אלוציה לחלבון שלנו.לפיכך, אנו משתמשים בבופר אלוציה בריכוז של 250 millimolar של immuno. שימו לב כיצד צבע הסף (resin) משתנה לכיוון ירוק. בשל הריכוזים הגבוהים של חלבון ה-CRE, פראקציית ה-OID הופכת לעיתים לעכורה.כדי למנוע זאת, ערבבו את התמיסה והוסיפו lys buffer נוסף; כעת כל הפראקציות מאוחדות ומועברות לאחר מכן לתוך tubing לליזיס. הליזיס יסיר את השומנים; שלב הדיאליזה הראשון מבוצע אל מול בופר המכיל ריכוז גבוה של מלח. לאחר שעה, מחליפים את בופר המלח הריכוזי ותהליך הדיאליזה מיושם למשך הלילה.ביום למחרת, מוציאים את נשוא הדיאליזה מהבופר בעל המליחות הגבוהה ומעבירים אותו לבופר גליצרין. לאחר שלוש עד חמש שעות, מחליפים את בופר הגליצרין ומבצעים שוב דיאליזה במהלך הלילה. ליזיס כנגד בופר גליצרין יביא לתמיסת מלאי מרוכזת פי שלושה לפחות.ניתן כעת לאחסן את תמיסת המקור בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך מספר שנים ללא אובדן פעילות. לצורכי בקרת איכות, ניתן להעמיס את דגימות ה-SDS page שאספתם על ג'ל ולצבוע אותו לאחר מכן. עבור Kamasi, חלבון היתוך ה-Cree ניתן לזיהוי כפס בולט בפרקציית ה-OID. כדי להשתמש בריכוז המתאים של recombination crew, עליכם לקבוע את הריכוז באמצעות בדיקת Redford.כיצד להחדיר חלבונים קבועים לתאי יונקים. ראשית, הכינו את תאי המטרה כדי להשיג את יעילות ההחדרה הגבוהה ביותר של החלבון. במקרה שתאי המטרה שלכם הם תאי YES, הגדלים במושבות דחוסות, השגיו תאים בשכבה אחת בצפיפות שתביא לשכבת תאים בעלת 80 עד 90% התמזגות (confluence) למחרת.הפרידו את התאים והפכו אותם לסספנסיות תאים בודדים חמש שעות מראש. חשוב להכין סספנסיות תאים בודדים לפני טרנסדוקציה של חלבונים, מכיוון שאלמלא כן, רק תאים הנמצאים על פני השטח של מושבה יוכלו לעבור טרנסדוקציה. שאבו את המדיום ובחנו בקצרה את התאים באמצעות PBS לפני הטיפול בתריpsin.הסר את שאריות המצע העשיר המכיל סרום. לאחר שאיבת שכבת ה-PPS, שטוף את התאים והשאר אותם לדגירה למשך שלוש עד חמש דקות. כעת, בדוק תחת המיקרוסקופ אם כל המושבות התפרקו לתאים בודדים.מהסיבות שהוזכרו לעיל, זהו שלב קריטי עבור טרנסדוקציה של חלבונים לתאי שמרים. העבירו תאים נפרדים לשפופרת. הניחו את השפופרת במכשיר צנטריפוגה, סובבו את התאים למטה, שאבו את הנוזל העליון ושחזרו את התאים בתמיסה.במדיום גידול, דללו את התאים למספר התאים המתאים. הדבר תלוי, כמובן, בגודל של תרבית הרקמה. דגרו את התאים בצלחת למשך חמש שעות נוספות.פעולה זו תעניק לתאי האוויר זמן מספיק להיצמד לתחתית ולגדול כבצמיחה נצמדת. ניתן לאחסן מלאי של שלוש שורות מחלקות במינוס 20 מעלות למשך יותר משנתיים. בעבודה עם חלבון היתוך קבוע של תאים רקומביננטיים, ישנו יתרון רב בקיומו של תמיס מלאי כזה שניתן להשתמש בו לפי דרישה.בזמן ההמתנה להיצמדות התאים לכלי, ניתן להכין את מדיום ההדבקה של ה-C על ידי דילול פשוט של נפח מתאים של חלבון cell permanent creep מתוך מלאי כולסטרול לתוך מדיום עצמי. מכיוון שהתמיסה מהמלאי של Clare אינה סטרילית עדיין, יש לסנן את מדיום ההדבקה בסינון סטרילי לפני השימוש. אנו ממליצים להשתמש במזרק שניתן להבריג למסנן קושר חלבון של lobe.ריכוז ה-creek הסופי תלוי בסוג התא או בתוספי המדיום. לדוגמה, לסרום יש השפעה שלילית חזקה על יעילות ההעברה (transduction). ניתן להתגבר על כך באמצעות שימוש במדיום נטול סרום או על ידי הגדלת ריכוז ה-creek.מצאנו את התנאי האופטימלי המאפשר את יעילות הרקומבינציה הגבוהה ביותר. השתמשו בריכוזי הידרט החל מ-0.5 ועד 10 µM. אנו ממליצים לבחון זמני אינקובציה שונים שבין שש ל-18 שעות.לאחר חמש שעות של דגירה, הוציאו את תאי המטרה ושאבו את המצע המקשר (cross media). לאחר מכן, החליפו אותו במצע להעברת חלבונים (protein transduction media), והחזירו את התאים למדגרה לדגירה למשך הלילה. שטפו בקצרה את תאי ה-D באמצעות PPS והחליפו את מצע העברת החלבונים במצע ES רגיל.48 שעות לאחר דגירת התאים, ניתן לזהות ביטוי קבוע של הגן Cre באמצעות צביעת X-gal. תאים עם פנוטיפ בטא חיובי הונדסו גנטית בהצלחה על ידי רקומבינציה ספציפית לאתר. Cre הדיווח.התאים נושאים את מערכת ה-CRE המשתמשת במבנה Lae לאחר רקומבינציה מתווכת. רצף עצירה המוקף ב-lock P מוסר, וגן דשיין (reporter gene) מסוג luxe מופעל תחת מקדם (promoter) של team. כדי להעריך את יעילות הרקומבינציה בתאי דשיין שעברו טיפול מקדם, יש לקבע את התאים.שאבו את מדיום הגידול, שטפו את התאים פעמיים ב-PBS, כסו את התאים ב-4% PFA והדגירו את התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את התאים שוב שלוש פעמים ב-PBS. לאחר שאיבת ה-PBS משלב השטיפה האחרון, הוסיפו את תמיסת הצביעה Xal לבארות והדגירו את התאים למשך לילה ב-37 degrees באינקובטור.ביום למחרת, ניתן לנטר את פעילות Beal באמצעות תאים בעלי צווארון כחול. ניתן לקבוע את יעילות הרקומינציה על פי מספר המושבות הכחולות. בתנאים אופטימליים, ניתן להשיג יעילות רקומינציה הגבוהה מ-90%. ובכן, היום הראינו לכם כיצד לבטא ולטהר רקומינציה ספציפית לאתר מ-e coli.במחקר הוכחת-ההיתכנות זה, הצלחנו להשרות רקומבינציה ברוב המלחים. אוקיי, זהו זה. בהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה דן בבדיקת דליפת פלואורסצנטיות כדי לחקור את האינטראקציות של פפטידים חודרי תאים עם קרום התא באמצעות חיקויים של קרום התא – שלפוחיות חד-למלריות גדולות, או LUVs, עטופות בצבע פלואורסצנטי ומרווה (quencher).

בדיקת דליפת פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה פפטידית חודרת תאים עם ממברנה

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני משולב עם תאי חיים ומשמש לניטור שטף יונים על פני מחסום האפיתל במערכת העיכול. במחקר זה, עלייה בשטף יונים, הקשורים להפרעה בצומת הדוקים, הנגרמת על ידי הנוכחות של EGTA chelator סידן (גליקול-BIS אתילן (אתר בטא aminoethyl)-N, N, N ', אצטית N'-טטרה חומצה), הוא נמדדה.

חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני

מצגת זו מדגימה שיטה לפיה אלקטרופורציה של תאים דבקים ומתורבתים משמשת לחקר תקשורת בין-תאית, צומתית, בעוד התאים גדלים על שקופית המצופה בתחמוצת אינדיום-בדיל מוליכה ושקופה.

Assay פונקציונלי לגאפ junctional בחינה; Electroporation של תאים חסידים על אינדיום הבדיל-אוקסיד

אלקטרופורציה שימשה להחדרת חלבוני אפקטור אלימות חיידקים מטוהרים ישירות לתאים אוקריוטיים חיים. לוקליזציה של חלבונים נוטרה על ידי מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקלית. שיטה זו מאפשרת מחקרים על סחר, תפקוד ואינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חלבונים אקסוגניים פעילים, ומונעת את הצורך בביטוי הטרולוגי בתאים אוקריוטיים.

Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הכיוון והטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים. פרוטוקול פשוט זה מסתמך על רגישות סלקטיבית לפרוטאז של כימרות בין החלבון המעניין ל-GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות המיקרו-פבריקציה הנדרשות לבניית התקן אלקטרופורציה מיקרופלואידי במעבדה על שבב. מערך הניסוי מבצע טרנספקציות מבוקרות ברמת תא בודד בזרימה רציפה וניתן להרחיב אותן לתפוקות גבוהות יותר עם בקרה מבוססת אוכלוסייה. ניתן ניתוח המציג את היכולת לעקוב באופן חשמלי אחר מידת החדירה של קרום התא בזמן אמת.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) משלבת אספקה עקבית בתפוקה גבוהה עם כדאיות תאים גבוהה. הכנסת מדידות עכבה חשמלית טרנסאפיתל (TEEI) מספקת תובנה לגבי תהליכי הביניים של PSEP ומאפשרת אספקה ללא תוויות. מאמר זה דן בשיטה לביצוע ניסויי העברת PSEP וניתוח מדידת TEEI בו-זמנית.

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

למדו הנדסת חלבונים חדירי-תאים לתפעול תאים יונקים ללא שינוי גנטי קבוע. השיטה מאפשרת מסירה ישירה של חלבונים פעילים לתאים שאינם מתחלקים כמו נוירונים.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

גלה סרטונים נוספים