Name: Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-22T17:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: למדו ניתוח ציטומטריית זרימה רב-צבעית של תגובות חיסוניות תאיות בקופי רזוס. השיטה מאפשרת אפיון תתי-אוכלוסיות של תאי T CD4+ ו-CD8+ לחקר מערכת החיסון ופיתוח חיסונים נגד HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד&quot;ר פרמוד Nehete וגברת Bharti Nehete דם מקוק דגימות PBMC; עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי כספים NIH מענק AI 46969, וכל תרבות התקשורת התא הופקו על ידי התקשורת המרכזית מעבדה, אשר ממומנת על ידי מענק NIH CA 16672.

הנהלים עבור ניתוחים פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון ותאי T ניתן לחלק לארבעה חלקים: 1) הכנה Cell וגירוי antigenic, 2) סמן Surface מכתים, 3) מכתים ציטוקינים תאיים ו 4) cytometry זרימה מנתח. 1. תא הכנה גירוי antigenic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שניהם מבודדים טרי וכן cryo-נשמר בתאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC) היו בשימוש בפרוטוקול זה. PBMC היו מבודדים heparinized או citrated דגימות דם ורידי של קופי רזוס ידי שקיעה צפיפות שיפוע באמצעות Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, סיגמא אולדריץ, ST. לואיס, מיזורי). Aliquots של PBMC אוחסנו קפוא FCS 90% ו 10% DMSO חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת שימוש cryo-נשמר PBMC, צלוחיות של PBMC קפוא הוסרו חנקן נוזלי מופשר במהירות באמבט מים C 37, מעורב בעדינות, לשטוף עם RPMI-1640 (HyClone מעבדות, לוגן, UT) להסיר את אמצעי מקפיא מחדש מושעה בתקשורת להשלים [CM; RPMI-1640 עם תוספת של 10% חום מומת FCS (HyClone מעבדות), 2mm L-גלוטמין (סיגמא אולדריץ '), 100U/ml פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen), תרבותי 6 - גם תרבות צלחות רקמת לילה בשעה 37 ° C באווירה CO humidified 5% 2. למחרת בבוקר, ספירת תאים קיימא נקבעו על ידי שיטת trypan כחול החרגה לצבוע מחדש תלויה CM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים טופלו בצורה שונה הלא ספציפית, לעומת גירוי אנטיגן ספציפי ואחריו מנתח ציטוקינים: (א) גירוי לא ספציפי עם phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) ו Ionomycin (אני) (סיגמא אולדריץ, רח' לואיס, מיזורי), aliquots של תאים בהיקף של 0.1ml (1.0 x 10 6 תאים / טוב) היו מצופה בבארות בודדים של 96-היטב בתרבות צלחות רקמות (BD Biosciences, פרנקלין האגם, NJ). PMA ו Ionomycin שימשו בריכוז הסופי של 50ng/ml ו 500ng/ml, בהתאמה. ההיקף הכולל הסופי 96-היטב צלחת רקמה תרבות 0.2ml/well: (ב) גירוי אנטיגן ספציפי, 1.0 x 10 6 תאים בנפח 1.0 מ"ל היו מצופה בבארות בודדים של 24 צלחות טוב בתרבית רקמה (BD Biosciences , אגם פרנקלין, ניו ג'רזי), שם היו בארות טרום טיפול כפי שתואר לעיל עם שינוי 9. בקצרה, 24 היטב את התרבות צלחות רקמה היו מצופים 2.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​/ גם אנטי עכבר עז IgG (H + L) (קירקגור ופרי מעבדה, Gaithersburg, MD) בתמיסה טריס 50mm (PH 8.6) עבור 4 ° C בן לילה. למחרת בבוקר צלחות נשטפו פעמיים עם PBS סטרילי ושיתוף גירוי MAB CD49d, לשבט 9F10 (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) נוספו על 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​/ ואחריו גם על ידי דוגרים במשך שעה אחת על 37 ° C. לאחר דגירה, צלחות נשטפו פעמיים בטמפרטורת החדר עם PBS סטרילית. אנטיגנים של עניין (כולל קוקטייל של שישה פפטידים HIV המעטפה 8 נוספו בריכוז הסופי של 10μg/ml של פפטיד זה. בארות נוספים עם תאים CM לבד הוכנו כביקורת שלילית. ההיקף הכולל הסופי גם כל אחד 24 , גם תרבות צלחת רקמות היה 1.0 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים היו בתרבית במשך 6 שעות 37 ° C באווירה CO humidified 5% 2. Brefeldin (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) נוספה לתרבות ב 10μg/ml עבור 4.5 השעות האחרונות של גירוי. כתוצאה מכך, התאים הועברו 5 צינורות פוליפרופילן מ"ל ורחץ עם קר (4 ° C) לשטוף חיץ זרימה (PBS Dulbecco של (DPBS, Ca 2 / Mg 2 ללא; טכנולוגיות החיים, Rockville, MD) עם 2% חום מומת FCS), ומעובד לאחר מכן על מכתים עם נוגדנים שונים שכותרתו פלואורסצנטי. </li></ol> 2. משטח סמנים immunofluorescence מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גירוי התאים היו מוכתמים הראשון עם 4 1ul צבע חי / מת אקווה ניתן לתקן תגובתי פלורסנט ° C בחושך במשך 30 דקות, לשטוף פעם אחת עם חוצץ זרם קר לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, בעקבות טיטרציה כראוי הקרינה שכותרתו נוגדנים חד שבטיים נוספו תאים: אנטי CD3 PE-Cy7 (SP34-2), אנטי CD8 Alexa700 (RPA-T8), CD28 אנטי PerCP-cy5.5 (L293) , אנטי CD95 APC (DX2) ואנטי CD4 פסיפיק בלו (OKT4), כולם מקבוצת BD Biosciences (פרנקלין האגם, ניו ג'רזי), למעט CD4 פסיפיק בלו (OKT4) מ eBioscience (סן דייגו, קליפורניה). התאים הודגרו במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי גם פיצוי בקרות הקרינה מינוס אחד (FMO) שולטת 10,11 נוצלו. שולטת פיצוי נוצלו כדי לקבוע את coeffecients גלישה של כל אדם כתם לתוך גלאי אחרים. במשך שולטת פיצוי, מערכת שלמה של צינורות המכיל השעיות תא מאחד קוף הוכתמו פלורסנט MAB מצומדות בנפרד כמו כתמי צבע יחיד. FMO הוא שילוב מכתים ססגוניות המכיל את כל ריאגנטים אבל זה עניין משמש כדי לקבוע את הגבול בין חיוביהאוכלוסייה nd שלילי על ידי שכפול אוטומטי פלואורסצנציה ברמה מוצגים נתונים במדגם מוכתם לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ויטראז נשטפו אז עם חיץ תזרים קר לשטוף, וכן קבוע פתרון קיבעון / permeabilization (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) במשך לפחות 10 דקות (בשלב זה התאים ניתן לאחסן לילה בשעה 4 ° C בחושך) לפני ביצוע מכתים ציטוקינים תאיים. </li></ol> 3. ציטוקינים תאיים מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים קבוע נשטפו עם חיץ לשטוף לזרום, ואז פרם / לשטוף חיץ (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) נוספה על פי ההוראות של היצרן. בקצרה, התאים הודגרו ב 0.1ml של פרם 1X / לשטוף חיץ במשך 10 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתוצאה מכך, התאים הודגרו עם טיטרציה בהתאם FITC שכותרתו אנטי IFN-γ (B27) ו-PE שכותרתו נגד IL-2 (MQ1-17H12) במשך 60 דקות 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז התאים נשטפו פעמיים נוספות עם פתרון permeabilization </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, התאים היו מחדש תלויה paraformaldehyde 1% ו DPBS נתון ניתוח cytometry זרימה בתוך 24 שעות. </li></ol> 4. Cytometry ניתוח תזרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מוכתם נרכשו על השנייה LSR זרימה cytometer (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) או ציאן ADP (Dako, Carpinteria, CA). נתונים FACS נותחו באמצעות תוכנה FlowJo (עץ הכוכבים, Ashland, OR). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איור. 1 מציג את תכנית gating מנוצל עבור ניתוחים של תא T תת שונים מן החי נציג. לימפוציטים היו מגודרת first באמצעות פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC), ולאחר מכן לימפוציטים לחיות זוהו מבוסס על SSC ו אקווה שלילי באוכלוסייה. בתאי T ואז היו מזוהים באופן חיובי על ידי ביטוי CD3 ואחריו זיהוי של CD4 + CD8-(תאים מסוג CD4 + T) CD4 ו-CD8 + (+ CD8 ותאי T) אוכלוסיות בתוך CD3 + T האוכלוסייה התא. CD4 + ו - CD8 + T תאים הובחנו נוספת על בסיס של CD28 ו CD95 ביטוי כמו נאיבי (Tn, CD28 + CD95-), הזיכרון המרכזי (TCM, + CD95 + CD28) וזיכרון מפעיל (TEM, CD28-CD95 +) התאים לתוך תת שונים המתואר בספרות 5, 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איור. 2 מראה כיצד קבוצות משנה שונות של CD4 + ו - CD8 + T תאים הוערכו על יכולת תפקודית במונחים של ייצור ציטוקינים (INF-γ ו / או IL-2) בתגובה לגירוי עם PMA ו ionomycin (PMA + I). </li></ol> 5. נציג FACS נתונים הרכב PBMC ב קופי רזוס נקבע באמצעות ניתוח FACS. איור 1 מציג את ערכת gating מנוצל עבור ניתוחים של תא T תת שונים מן החי נציג. לימפוציטים היו מגודרת first באמצעות פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC), ולאחר מכן לימפוציטים לחיות זוהו מבוסס על SSC ו אקווה שלילי באוכלוסייה. בתאי ה-T זוהו לאחר מכן על ידי ביטוי CD3. CD4 + CD8-(תאים מסוג CD4 + T) CD4 ו-CD8 + (+ CD8 ותאי T) אוכלוסיות בתוך CD3 + T האוכלוסייה תא נקבעו גם. כפי שניתן לראות בתרשים 2, CD4 + ו - CD8 + T תאים הובחנו נוספת על בסיס של CD28 ו CD95 ביטוי כמו (CD28 TN, + CD95-) נאיבי, הזיכרון המרכזי (TCM, CD28 + CD95 +) וזיכרון מפעיל (TEM לתוך תת שונים, CD28-CD95 +) תאים. 2A איור מראה INF-γ ו - IL-2 ייצור CD4 unstimulated ו PMA / ionomycin מגורה + בתאי T, ו - תת, ו -2 איור מראה INF-γ ו - IL-2 ייצור unstimulated ו PMA / ionomycin מגורה CD8 + בתאי T, וכן תת הערה הפרופילים ציטוקינים שונים שהושרו על ידי גירוי בתוך כל קבוצת משנה. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0"> באיור 1. אסטרטגיה gating המשמש ניתוח תזרים cytometric הרכב PBMC ב רזוס macqaues. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2atmb.jpg" alt="איור 2a" border="0"> <img src="/files/ftp_upload/1743/1743fig2btmb.jpg" alt="איור 2b" border="0"> איור 2. (א) ייצור ציטוקינים פרופיל של CD4 + הכולל בתאי T תת. (ב) ייצור ציטוקינים פרופיל בסך הכל התאים CD8 + T ו - תת. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2a.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של 2a, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1743/1743fig2b.jpg">או כאן</a> לגרסה גדולה יותר של 2b דמות.

<ol><li>Ogg, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+HIV-1-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+and+plasma+load+of+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA.</a> Science. 279, 2103-2106 (1998).</li>
<li>Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+CD8%2B+cytotoxic+T-lymphocyte+activity+associated+with+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection.</a> J Virol. 68, 6103-6110 (1994).</li>
<li>Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+cellular+immune+responses+with+the+initial+control+of+viremia+in+primary+human+immunodeficiency+virus+type+1+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome.</a> J Virol. 68, 4650-4655 (1994).</li>
<li>Walker, J. M., Maecker, H. T., Maino, V. C., Picker, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+flow+cytometric+analysis+in+SIV-infected+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor flow cytometric analysis in SIV-infected rhesus macaque.</a> Methods Cell Biol. 75, 535-557 (2004).</li>
<li>Pitcher, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+T+cell+memory+in+rhesus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of T cell memory in rhesus macaque.</a> J Immunol. 168, 29-43 (2002).</li>
<li>Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 159, 197-207 (1993).</li>
<li>Keeney, T. S., Nomura, L. E., Maecker, H. T., Sastry, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+macaque+whole+blood+for+antigen-specific+intracellular+cytokine+production+by+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Primatol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of macaque whole blood for antigen-specific intracellular cytokine production by T lymphocytes.</a> J Med Primatol. 32, 23-30 (2003).</li>
<li>Gauduin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intracellular+cytokine+staining+for+the+quantitation+of+antigen-specific+CD4%2B+T+cell+responses+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of intracellular cytokine staining for the quantitation of antigen-specific CD4+ T cell responses in rhesus macaques.</a> J Immunol Methods. 288, 61-79 (2004).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> J Immunol Methods. 243, 77-97 (2000).</li>
<li>De Rosa, S. C., Herzenberg, L. A., Roederer, M. 11-color <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13-parameter+flow+cytometry%3A+identification+of+human+naive+T+cells+by+phenotype%2C+function%2C+and+T-cell+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">13-parameter flow cytometry: identification of human naive T cells by phenotype, function, and T-cell receptor diversity.</a> Nat Med. 7, 245-248 (2001).</li>
<li>Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+fluorescence+compensation+and+visualization+of+FACS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data.</a> Clin Immunol. 110, 277-283 (2004).</li>
</ol>

פתרון Buffers <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ficoll-Hypaque (Histopaquen-1077, סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> RPMI-1640 בינוני (HyClone מעבדות, לוגן, UT) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרום שור עוברית (FBS), (HyClone מעבדות, לוגן, UT) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L-גלוטמין (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פניצילין / סטרפטומיצין (Invitrogen; בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypan כחול מגיב (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 מ&quot;מ טריס, PH 8.6, מסוננים ולאחסן ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dulbecco של PBS (DPBS, Ca2/Mg2-free; החיים טכנולוגיות, Rockville, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חיץ זרימה: תוספת DPBS עם 2% FBS, לאחסן ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BD Cytofix / Cytoperm קיבוע / Permeabilization פתרון Kit (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li></ul> הפעלת סוכנים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phorbol 12-13-myristate אצטט (PMA) (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ionomycin (סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Costimulatory MAB CD49d, לשבט 9F10 (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיקה מטוהרים נוגדן F (ab) 2 שברי אנטי עכבר עיזים IgG (H + L) (קירקגור ופרי מעבדה, Gaithersburg, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת סוכנים ספציפיים עשויים לכלול בריכות פפטיד, פפטידים אחד, או חלבון שלם </li></ul> הפרשת ציטוקינים מעכבי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Brefedin (BFA, סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס Golgi ניתן להשתמש לחילופין (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li></ul> נוגדנים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חי / מת ערכת ניתן לתקן אקווה כתם ניאון (Invitrogen; בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD3 PE-Cy7 (SP34-2), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD4 פסיפיק בלו (OKT4), (eBiosciences (סן דייגו, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD8 Alexa700 (RPA-T8), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD28 PerCP-cy5.5 (L293), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD95 APC (DX2), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IFN-FITC (B27), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-2 PE (MQ1-17H12), (BD Biosciences; בסן חוזה, קליפורניה) </li></ul>

cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

המודל מקוק רזוס היא כיום מודל זמין הטוב ביותר עבור איידס ביחס להבנת הפתוגנזה, כמו גם לפיתוח חיסונים ותרופות<sup&gt; 1,2,3</sup&gt;. כאן אנו מתארים שיטה מנתח פנוטיפי ופונקציונלי מפורט של התגובה החיסונית התאית, ייצור ציטוקינים תאיים במיוחד על ידי CD4 + ו - CD8 + T תאים, כמו גם את תת זיכרון הפרט. השגנו באמצעים כמותיים ואיכותיים מדויק לייצור אינטרפרון גאמא (INF-) ו - interleukin (IL) -2 מסוג CD4 + ו שניהם CD8 + T תאים PBMC מקוק רזוס מגורה עם PMA פלוס ionomycin (PMA + I). פרופילים ציטוקינים היו שונים תת שונים של תאים בזיכרון. יתר על כן, פרוטוקול זה סיפק לנו את הרגישות להפגין אפילו שברים קטנים של אנטיגן ספציפי CD4 + ו - CD8 + T תת תא בתוך דגימות PBMC מ קופי רזוס לחסן עם חיסון פפטידי קוקטייל איידס המעטפה שפותחו במעבדה שלנו. הטכניקה cytometry ססגוניות זרימה הוא כלי רב עוצמה לזהות במדויק אוכלוסיות שונות של תאים T<sup&gt; 4,5</sup&gt; עם יכולת ייצור ציטוקינים<sup&gt; 6</sup&gt; בעקבות הגירוי הלא ספציפית או אנטיגן ספציפי<sup&gt; 5,7</sup&gt;.

אנו מדגימים את השירות של זרימת cytometry ססגוניות אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מפורט הכולל, כמו גם תת זיכרון מסוג CD4 + ו - CD8 + T תאים של קופי רזוס, המודל האידיאלי עבור HIV / איידס מחקרים החיסון.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

מודל מקאק הרזוס הוא כיום המודל הטוב ביותר הזמין עבור HIV-AIDS בכל הנוגע להבנת הפתוגנזה וכן לפיתוח...

סרטון זה מדגים פרוצדורה לעיבור וצביעה של תאי מונונוקלאריים מדם פריפרי (pbmc). לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה רב-צבעית, תאי pbmc שבודדו מדם מלא מוחדרים לצלחות תרבית רקמה. התאים מעובדים באופן כימי או ביולוגי כדי להשרות תגובה חיסונית.בעקבות הגירוי, מוסיפים תערובת של נוגדנים כדי לזהות סוגי תאים על בסיס סמני שטח מובעים. לאחר מכן מבצעים פרמיאציה לתאים ומוסיפים תערובת אחרת של נוגדנים כדי לזהות ביטוי של ציטוקינים תוך-תאיים, ולאחר מכן התאים מנותחים באמצעות זרימה כדי לקבוע את פרופילי הציטוקינים עבור תתי-אוכלוסיות ספציפיות של pbmc. שלום, אני איימי קורטני מהמעבדה של ד"ר Jagan SAS במחלקה לאימונולוגיה במרכז הסרטן MD Anderson של אוניברסיטת טקסס.שלום, אני Hong, גם אני מהמעבדה. היום נדגים לכם ניתוח ציטומטריה רב-צבעית של תגובות תאי T. אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור תגובות חיסוניות תאיות ב-Rhesus Macaque.אם כן, נתחיל. התחילו פרוטוקול זה באמצעות שימוש ב-hemo cytometer כדי לקבוע את מספר התאים החיוניים של pbmc מ-Reuss Maca בשיטת exclusion של צבע Trian Blue. עבדו תחת מ 빠르게 למינאר (laminar flow hood) reus.השעה את התאים במצע מלא בריכוז של 10 מיליון תאים למליליטר עבור גירוי לא ספציפי, על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באער של פלטת תרבית רקמות בעלת 96 באערים. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מצע המכיל PMA ו-CIN כדי להגיע לנפח כולל של 0.2 מליליטר, בריכוז סופי של 50 ננוגרם למליליטר PMA ו-500 ננוגרם למליליטר CIN; עבור באערי ביקורת שלילית, הוסף 100 מיקרוליטר של מצע מלא בלבד לכל באער. דגרי את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה מלחחית של 5% פחמן דו-חמצני למשך 1.5 שעות.הוסיפו felden A לתרבית בריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter והדגירו למשך 4.5 שעות נוספות. ה-felden A מוסף כדי ללכוד cytokines במכשיר gold G להגברת הנראות בצביעה אימונית. לאחר הגירוי, סבבו בצנטריפוגה להסרת המצע ולאחר מכן שטפו על ידי הוספת 200 microliters של flow wash buffer קר וסבבו בצנטריפוגה במהירות נמוכה. חזרו על שטיפה זו, ולאחר מכן השאיבו ל-50 microliters של flow wash buffer.התאים מוכנים כעת לצביעה עבור ביטוי של סמני שטח בכל באער של התאים שהושעו. הוסף 1 µL של צבע פלואורסצנטי תגובתי aqua fixable live dead שהוכן בהתאם להוראות היצרן. הדגר בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך 30 דקות בזמן שהתאים עוברים הדגרה.הכינו במיקרו-טובות את תמיסאות הצביעה שישמשו לצביעה. ראשית, הכינו תערובת צביעה הכוללת את הרכיבים הבאים במינון המתאים: נוגדנים מונוקלונאליים המסומנים פלואורסצנטית לאחר תיחור, anti CD three PE SCI seven, anti CD eight Alexa 700, anti CD 28 per CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC ו-anti CD four Pacific Blue, בתוך Inflow Wash Buffer.בשלב הבא, הכינו בקרים לפיצוי, אשר ישמשו לקביעת מקדמי הדילילה (spillover) של כל צבע בודד לגלאים אחרים, וזאת על ידי הכנת מבחנה של כל נוגדן מצומד פלואורסצנטית כצבע בודד. לבסוף, הכינו צביעות של פלואורסצנציה פחות אחד, או FMO, על ידי שילוב כל הרכיבים למעט הרכיב הנבדק. אלו ישמשו לקביעת הגבול בין אוכלוסייה חיובית לשלילית, על ידי שכפול רמות האוטופלואורסצנציה והנתונים הקיימים בדגימות צבועות באופן מלא.לאחר דגירת התאים בצבעיות חיות/מתים (live dead stain), שטפו אותם פעם אחת עם בופר שטיפה קר לזרימה (flow wash buffer) כדי להסיר עודפי צבע, ושאבו את בופר השטיפה. לאחר מכן, הוסיפו את תמיסות הצביעה שהוכנו. דגרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C בחשכה למשך 30 דקות.שטפו את התאים הצבועים בבופר שטיפה קר לזרימה (flow wash buffer) כדי להסיר נוגדנים עודפים. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת קיבוע וחדירה (fixation permeation solution) של BD למשך 10 דקות לפחות. שמרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C בחושך למשך עד 24 שעות עד לשימוש בהם, או המשיכו לשלב סימון הציטוקינים התאיים כדי לסמן ציטוקינים תאיים.ראשית, בצעו פרמיאציה לתאים ב-100 µL של 1X perm wash buffer. דגרו למשך 10 דקות ב-4 °C בחושך בזמן שהתאים עוברים דגירה. הכינו את הנוגדנים לצביעה, את בקרות הפיצוי (compensation controls) ואת בקרות ה-FMO ב-1X perm wash buffer כפי שנעשה קודם לכן.לאחר דגירה של התאים למשך 10 דקות, סובב במצנטריפוגה והסר את ה-one x perm wash buffer. הוסף את הנוגדנים המתאימים לצביעה. לאחר מכן, דגור את התאים והנוגדנים למשך 60 דקות בטמפרטורה של four degrees Celsius בחושך.שטפו את התאים פעמיים בתמיסת החדירה. לאחר השטיפה האחרונה, השעו את התאים ב-1% Paraformaldehyde ב-DPBS כדי לקבע אותם. אחסנו את התאים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימושם, למשך תקופה של עד 24 שעות.לאחר צביעת התאים, השתמשו בציטומטר זרימה LSR II או בציטומטר זרימה CytoFLEX כדי לבצע FACS. לאחר מכן, נתחו את הנתונים באמצעות FlowJo או תוכנה דומה. הרכב ה-PBMC ב-rhesus maca נקבע באמצעות אנליזת FACS.איור זה מציג את סכימת ה-gating ששימשה לניתוח תת-אוכלוסיות שונות של תאי T מבעל נסויי מייצג. תחילה בוצע gating ללימפוציטים באמצעות פיזור קדמי FSC לעומת פיזור צדי SSC, ולאחר מכן זוהו לימפוציטים חיים על בסיס SSC ואוכלוסייה שלילית ל-AQUA. תאי ה-T זוהו על ידי ביטוי של CD3; כמו כן, נקבעו אוכלוסיות של CD4 חיובי ו-CD8 שלילי, וכן CD4 שלילי ו-CD8 חיובי בתוך אוכלוסיית תאי ה-T החיוביים ל-CD3.תאי T חיוביים ל-CD4 וחיוביים ל-CD8 הובחנו בהמשך לתתי-אוכלוסיות שונות על בסיס ביטוי של CD28 ו-CD95, כתאים נאיביים, תאי זיכרון מרכזיים ותאי זיכרון אפקטוריים. איור זה מציג ייצור של interferon gamma ו-IL-2 בתאי T חיוביים ל-CD4 ובתתי-אוכלוסיות שלהם, במצב לא מעורר ובמעוררי pma ו-CIN.שימו לב לפרופילי הציטוקינים המובחנים שהופעלו בעקבות הגירוי. בכל תת-אוכלוסייה. נדגים לכם כיצד לבצע אנליזת ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית (multi flow cytometry) של pbmc.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין הן בקרות פיצוי של צבע בודד והן בקרות Fluorescent Minus One (FMO). שתי הבקרות הללו נחוצות לצורך ניתוח תקין של נתוני ציטומטריה זרימה. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב שלנו למידע נוסף על בחירת בקרות פיצוי.כמו כן, אנא זכרו כי בעת שימוש בנוגדן מסומן פלואורסצנטית, חשוב לכסות את הדגימות כדי להגן עליהן מחשיפה לאור. זהו כל הסיפור. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

multicolor-flow-cytometry-analyses-cellular-immune-response-rhesus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

הדור של מודל עכברים orthotopic של מזותליומה pleural הממארת על ידי השתלה של תאי II-45 מזותליומה לתוך חלל pleural של חולדות המוסמכות חיסוניים מוצג. שיטת cytometric זרימה לנתח שבע תת תא חיסון בבעלי החיים אלה מדגימת דם 25 μl גם מתוארת.

ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור ספירת ואפיון מקוק רזוס CD8 + T תאים נגד נגיף האיידס. מאמר זה הוא שימושי לא רק בתחום האימונולוגיה HIV, אלא גם לאזורים אחרים של המחקר הביו-רפואי שבו התגובות תא CD8 + T ידועים בהשפעתם התוצאה המחלה.

ניתוח של CD8 וירוס ספציפי החיסוני Simian + T-התאים קופי רזוס ידי פפטיד-MHC-I tetramer מכתים

פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

תיאר מתודולוגיה quantitate את הביטוי של גנים 96, 18 פני שטח חלבונים על ידי תאים בודדים לשעבר vivo, המאפשרות הזיהוי באופן שונה באה לידי ביטוי גנים, חלבונים בתאים הנגועים בנגיף ביחס תאים נגוע. אנו מיישמים את הגישה ללימוד CD4 הנגועים סיב+ T תאים מבודד קופי מקוק רזוס.

תא בודד כימות של mRNA וביטוי חלבונים השטח ב- CD4 הנגועים בנגיף+ T תאים מבודדים מן קופי מקוק רזוס

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ציטומיטרי זרימה מפורט ושחזור כדי לזהות מונוציט / מקרופאג ותת-תאים T-ערכות באמצעות שניהם אקסטרה-ותוך תאי כתמים כתמים בתוך הטחול murine, מח עצם, בלוטות הלימפה ורקמות synovial, ניצול מודל כירורגי מבוסס של דלקת מפרקים ניוונית מורין.

ניתוח ציתום זרימה של תת-סטים של תאים חיסוניים בתוך הטחול מורין, מח העצם, בלוטות הלימפה ורקמות Synovial במודל דלקת מפרקים ניוונית

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

למדו ניתוח ציטומטריית זרימה רב-צבעית של תגובות חיסוניות תאיות בקופי רזוס. השיטה מאפשרת אפיון תתי-אוכלוסיות של תאי T CD4+ ו-CD8+ לחקר מערכת החיסון ופיתוח חיסונים נגד HIV.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

גלה סרטונים נוספים