Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

סרטון זה מדגים הליך לגירוי וצביעה של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי או pbmc. לניתוח ציטומטריית זרימה צבעונית, אלק וואטס של pbmc מבודד מדם מלא מונחים בצלחות תרבית רקמות. תאים מגורים כימית או ביולוגית לייצר תגובה חיסונית.

לאחר הגירוי, מתווסף קוקטייל של נוגדנים לזיהוי סוגי תאים על סמך סמני פני השטח. לאחר מכן מחדירים את התאים ומוסיפים קוקטייל אחר של נוגדנים כדי לזהות את הביטוי של ציטוקינים תוך-תאיים, לאחר מכן התאים מנותחים על ידי עובדות כדי לקבוע את פרופילי הציטוקינים עבור תת-קבוצות ספציפיות של pbmc. היי, אני איימי קורטני מהמעבדה של ד"ר ג'גן SAS במחלקה לאימונולוגיה במרכז הסרטן MB אנדרסון באוניברסיטת טקסס.

היי, אני הונג גם היא מהמעבדה. היום נראה לכם ניתוח רב-ציטומטרי של תגובות תאי T. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור תגובות חיסוניות תאיות בראוס מאקה.

אז בואו נתחיל. התחל פרוטוקול זה באמצעות ציטומטר המו כדי לקבוע את ספירת התאים הקיימא של pbmc מרויס מאקה בשיטת אי הכללת Trian Blue Dye. עבודה במכסה מנוע זרימה למינארי ראוס.

השעו את התאים בתווך שלם בריכוז של 10 מיליון תאים למיליליטר לגירוי לא ספציפי ב-100 מיקרוליטר של תרחיף התאים לכל באר של צלחת תרבית רקמה של 96 בארות. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום המכיל PMA ו-CIN כדי להביא את הנפח הכולל ל-0.2 מיליליטר עם ריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר PMA ו-500 ננוגרם למיליליטר CIN עבור בארות בקרה שליליות, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום שלם בלבד לכל אחד. ובכן דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני לאחר 1.5 שעות.

פלדן A לתרבית בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ודגירה למשך 4.5 שעות נוספות. הפלדן A מתווסף לציטוקינים של טראפ במנגנון הזהב G כדי להגביר את הנראות עם צביעה חיסונית, לאחר צנטריפוגת גירוי להסרת מדיום ולאחר מכן שטיפה על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של שטיפה בזרימה קרה, חיץ וצנטריפוגה במהירות נמוכה. חזור על כביסה זו ולאחר מכן שלח שוב 50 מיקרוליטר של מאגר שטיפת זרימה.

התאים מוכנים כעת לצביעה לביטוי סמני פני השטח לכל באר של התאים המרחפים. הוסף מיקרוליטר אחד של צבע פלואורסצנטי אקווה פלואורסצנטי חי מת, שהוכן על פי הוראות היצרנים ו-S. דגירה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות בזמן שהתאים דוגרים.

הכן את תמיסות הצביעה שישמשו לעובדות בצינורות מיקרו. ראשית, הכינו קוקטייל עומד שיכלול את הדברים הבאים בהתאם. נוגדנים חד שבטיים עם תווית פלואורסצנטית, אנטי CD שלוש PE SCI שבעה, אנטי CD שמונה Alexa 700 אנטי CD 28 לכל CCP SCI 5.5, אנטי CD 95 A PC ואנטי CD ארבע מאגר שטיפה פסיפי כחול

לאחר מכן, הכינו בקרות פיצוי, שישמשו לקביעת מקדמי הזליגה של כל כתם בודד לגלאים אחרים על ידי הכנת שפופרת של כל נוגדן מצומד פלואורסצנטי בנפרד ככתם בצבע יחיד. לבסוף, הכינו פלואורסצנטי מינוס כתמים אחד או FMO על ידי שילוב כל הריאגנטים מלבד זה המעניין. זה ישמש לקביעת הגבול בין אוכלוסייה חיובית לשלילית על ידי שכפול רמות האוטופלואורסצנטיות והנתונים הקיימים בדגימות מוכתמות במלואן.

לאחר שהתאים דגרו בכתם המת החי, שטפו אותם פעם אחת עם מאגר כביסה בזרימה קרה כדי להסיר עודפי צבע, שאפו את מאגר הכביסה. לאחר מכן מוסיפים את תמיסות הצביעה המוכנות. דגרו על התאים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 30 דקות.

שטפו את התאים המוכתמים עם מאגר שטיפה בזרימה קרה כדי להסיר עודפי נוגדנים. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת חדירת קיבוע BD למשך 10 דקות לפחות. אחסן את התאים בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד 24 שעות עד לשימוש בהם או המשך לתייג את הציטוקינים התוך-תאיים כדי לסמן ציטוקינים תוך-תאיים.

ראשית חלחל את התאים ב-100 מיקרוליטר של סלסול X אחד. יש לשטוף את המאגר למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס בחושך בזמן שהתאים דוגרים. הכן את נוגדני הצביעה, בקרות הפיצוי ובקרות ה-FMO במאגר כביסה אחד כמו קודם.

לאחר הדגירה של התאים למשך 10 דקות, סובב והסר את מאגר הכביסה האחד x סלסול. הוסף את נוגדני הצביעה המתאימים. לאחר מכן דגרו על התאים והנוגדנים למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס בחושך לאחר הדגירה.

שוטפים את התאים פעמיים בתמיסת החלחול. לאחר השטיפה הסופית, החייאת התאים משהה את התאים ב-1% אלדהיד פרפורם ב-DPBS כדי לתקן את התאים. אחסן את התאים בארבע מעלות צלזיוס בחושך עד לשימוש עד 24 שעות.

לאחר שהתאים הוכתמו, השתמש בציטומטר זרימה LSR שתי זרימה או ציאן ציטומטר זרימה DP כדי לבצע עובדות. לאחר מכן נתח את הנתונים באמצעות FlowJo או תוכנה דומה. הרכב PBMC ברויס מאקה נקבע באמצעות ניתוח פקס.

איור זה מציג את סכימת השער המשמשת לניתוח תת-קבוצות תאי T שונות מבעל חיים מייצג. הלימפוציטים גודרו תחילה באמצעות FSC פיזור קדימה לעומת SSC פיזור צד ולאחר מכן זוהו לימפוציטים חיים על סמך אוכלוסייה שלילית SSC ו-AQUA. לאחר מכן זוהו תאי ה-T על ידי CD שלושה ביטויים, CD ארבעה חיוביים, CD שמונה שלילי ו-CD ארבע שלילי, שמונה אוכלוסיות חיוביות בתוך אוכלוסיית CD שלוש חיוביות.

תאי ה-T החיוביים CD 4 ותאי ה-CD 8 החיוביים הובחנו עוד יותר לתת-קבוצות שונות על בסיס ביטוי CD 28 ו-CD 95 כתאי זיכרון מרכזי ותאי זיכרון אפקטור. איור זה מציג ייצור של אינטרפרון גמא ו-IL שני ב-Unstimulated ו-pma. CIN עורר CD ארבעה תאי T חיוביים ותתי קבוצות.

שימו לב לפרופילי הציטוקינים המובהקים שנוצרים על ידי גירוי. בכל תת-קבוצה. עלינו להראות לך כיצד לבצע ניתוח ציטומטריה מרובה זרימה של pbmc.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגדיר גם בקרות פיצוי בצבע יחיד וגם בקרות פלואורסצנטיות מינוס אחד. שני הבקרות הללו נחוצים לניתוח נכון של נתוני ציטומטריית זרימה. אנא עיין בפרוטוקול הכתוב שלנו למידע נוסף על בחירת בקרות פיצוי.

כמו כן, אנא זכור כי בעת שימוש בנוגדנים עם תווית פלורסנט, חשוב לכסות את הדגימות כדי להגן מפני חשיפה לאור. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.