לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

סרטון זה מדגים את הפרוצדורה להמרה פוטוכימית של Styro Dye FM 1 43. כדי לחקור מאגרי שלפוחיות סינפטיות ב-drosophila melanogaster, ראשית מבצעים דיסקציה לזחלי דרוזופילה כדי לחשוף את השרירים הגחוניים המהווים את צומת העצב-שריר או את הכנת ה-NMJ. ההכנות מדגרות בבופר המכיל FM D, המוצג כאן באפור, המסמן את ממברנת התא.

לאחר מכן הם מעוררים חשמלית או כימית כדי להשרות היתוך פיזי של ממברנת הוויסיקולה שמופנמת בעקבות זאת. אקסוציטוזה מעוררת תיצבעה ב-FM D. לאחר מכן שוטפים את צבע ה-FM החוץ-תאי, ובכך מסירים אותו מממברנת הפלזמה, והרקמה מקובעת תחת תאורה רציפה בעוצמה גבוהה. הצבע עובר הבהרה מלאה, והצבע השחור מופיע עקב שיקוע של di amino Ben.

ניתן להדמיה של משקע זה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים חודרת (TEM). שלום, אני פליפ אופסו מהמעבדה של סילביה אולי במכון למדעי העצבים האירופי בגבון, גרמניה. היום נראה לכם פרוצדורה להמרת פוטונים של FM בחיבור עצבי-שרירי.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור מיחזור של שלפוחיות סינפטיות. אשרי, בואו נתחיל. בעבודה תחת מיקרוסקופ דיסקסיקציה, התחילו בהצמדה של פשפש דרוזופילה (drosophila larvae) כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, בתוך צלחת מצופה ב-so guard.

כסו את הדגימה בתמיסת מלח לדרוזופילה (drosophila saline) באמצעות מחט של מזרק, ובאמצעות מספרי ניתוח בצעו חתך אורך בצד הגבי (dorsal side). לאחר מכן, הסירו את האיברים הפנימיים. בשלב הבא, מתחו את הדגימה והדביקו אותה שוב בסיכות לצלוחית פטרי.

ניתן להשתמש במספר שרירים בטניים כדי להגן על צבעי ה-FM המשמשים בהליך זה מפני הבהרה. יש לבצע הליך זה בתנאי תאורה נמוכים. כסו את דגימת ה-drosophila המקובעת בתמיסת סליין עבור drosophila המכילה 90 millimolar potassium chloride ו-10 micromolar FM.1 43 כדי לגרות את העצבים באופן כימי.

דגרו למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לאחר הגירוי. הסירו את תמיסת הגירוי וטבלו את הצלחת עם ה-drosophila המקובעת בתוך כוס כימית המכילה 100 milliliters של סלין עבור drosophila פעמיים, כדי להסיר את צבע ה-FM 1 43 החוץ-תאי, תוך עבודה תחת מנדף בטיחות כימי.

קבע את דגימת המפגש העצבי-שרירי ב-2.5% glutaraldehyde בתוך תמיסת saline buffered phosphate או PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שטוף את הדגימה פעם אחת ב-PBS, לאחר מכן הוצא אותה מכלי הזכוכית ושקע אותה ב-100 millimolar ammonium chloride למשך 15 דקות, כדי לנטרל את קבוצות האלדהיד החופשיות של מקבע ה-glutaraldehyde שנותר.

שטפו את תמיסת האמוניום כלוריד ב-PBS רגיל, העבירו את תpreparate של המפגש העצבי-שרירי לצלוחית סיגאר חדשה והטביעו אותה ב-Diamine benzine או DAB מסונן בריכוז 1.5 milligram per milliliter ב-PBS, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. מקמו את הדגימה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במקור אור של נורת כספית עם בית נורה המכיל מראה אחורית, באמצעות עדשה יבשה בהגדלה נמוכה יחסית.

אתר את הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קוביית מסננים רגילה לעירור כחול ופלואורסצנציה ירוקה, הבא את האות הפלואורסצנטי לפוקוס. החיבורים העצביים-שריריים יופיעו כנקודות בהירות על השרירים.

בשלב הבא, באמצעות אותה מערכת מסנני פלואורסצנציה, האירו את הדגימה בעוצמה מרבית עד להלבנה מלאה של ה-FM D. בשימוש בעדשה אובייקטיבית של 20x, זמן של 30 עד 45 דקות אמור להספיק. עם זאת, משך זמן ההמרה הפוטוכימית משתנה בהתאם לעוצמת ההארה, לעומק חדירות ה-DAB אל התחליל ולסוג העדשה האובייקטיבית שבה נעשה שימוש.

לאחר ההארה, בחנו את הדגימה תחת אור תמסורה. אם התרחשה המרה פוטוכימית, אמור להיראות משקוף חום כהה. חזרו למיקרוסקופ הדיסקציה, ולאחר מכן השתמשו במספריים כדי לגזור מהזחל את הנקודה שעברה המרה פוטוכימית.

חזרו למיקרוסקופ הדיסקציה. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לגזור את הנקודה שהומרה לתמונה מהזחלים. כעת, העבירו את הדגימה לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה המכילה PBS, תוך עבודה תחת מנדף בטיחות כימי ובשימוש בציוד בטיחות מתאים, כולל כפפות והגנה על העיניים.

הכינו 300 µL של osmium tetroxide בריכוז 1% עבור כל דגימה. כעת, הניחו את הדגימה בתוך בקבוק זכוכית בעל פקק פלסטיק והוסיפו את תמיסת ה-osmium tetroxide שהוכנה לצורך קיבוע משני (postfix) של הדגימה. בזמן דגירת הדגימה, הכינו תמיסות נפרדות המכילות ethanol בריכוזים של 30%, 50%, 70%, 90%, 95% ו-100%.

שטפו את הדגימה ארבע עד חמש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר כל שטיפה, השתמשו ב-PEs פלסטיק עבור הפיפטה שלכם כדי להעביר את הדגימה לבקבוק חדש. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הדגימה לבקבוק זכוכית נקי.

בשלב הבא, יש לבצע דהידרטציה לדגימה על ידי הנחתה בסדרת תמיסות אתנול. התחל בהדגרה ב-1 mL של 30% ethanol. לאחר חמש דקות, הסר את האתנול באמצעות פיפטת פסטור והחלף אותו ב-1 mL של 50% ethanol.

המשיכו בתהליך ההתייבשות, תוך דגירה של דגימת המפגש העצבי-שרירי בתמיסות של 70, 90 ולאחר מכן 95%. לאחר מכן, יש לדגיר את הדגימה בתמיסת ethanol בריכוז 95% מספר פעמים, ולאחר ההתייבשות, לדגיר אותה שלוש פעמים ב-100% Ethanol. הוסיפו שני מיליליטר של שרף EIN ביחס של one-to-one ל-ethanol והניחו את הדגימה באינקובטור מסתובב.

שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר לאחר סיבוב ב-100% ein, והנח את הדגימה בבבקרא פתוחה כדי לאפשר לאתנול שנותר להתאדות במשך ארבע עד שש שעות. מזוג EIN טרי לתבנית. הוסף את התכשירי ההכנה והדגר ב-60 degrees Celsius למשך 36 שעות.

כאשר תכשירים המוטמעים ב-EIN מוכנים, השתמש במיקרוטום אולטרה (ultra microtome) להכנת חתכים דקים בעובי 50 עד 80 ננומטר באמצעות סכין יהלום. הדגימות נחתכות לחתכים דקים. החתכים צפים על אמבט המים של הסכין וניתן לאחר מכן לאסוף אותם על גבי רשתות EM סטנדרטיות.

הדגימות מוכנות כעת לדימוג באמצעות פרוצדורות EM קונבנציונליות. צומת עצב-שריר מבודד מ-Drosophila Melan gaster עבר גרייה באמצעות ריכוז גבוה של אשלגן, וממברנות שהופנמו נצבעו באמצעות FM 1 43 כפי שמוצג כאן.

ניתן לצפות בفلואורסצנציה של סוף עצב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי קונבנציונלי. תחת הארה רציפה, הצבע עובר הלבנה מלאה, וכאשר ההארה נמשכת, מופיע צבע שחור עקב שיקוע של dino benzine. סוף עצב זה מכיל שלפוחיות סינפטיות, אך אף אחת מהן אינה עוברת המרה פוטו-כימית.

דבר זה עלול להיגרם מחוסר בתאורה או מחדירה לקויה של DIA amino benzine לרקמה. לעומת זאת, תאורה מרובה מדי תביא למסוף כהה באופן כללי שבו לא ניתן להבחין בvesicles או באב organelles; עם כמות התאורה המתאימה ניתן לראות photo conversion. מיקרוגרפ זה מראה synaptic bhuton שבו נראה מאגר של vesicles כהות, המעיד על FM photo conversion.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע המרה פוטוכימית של שלפוחיות סינפטיות המסומנות ב-fem die. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור תמיד לכייל בקפידה את זמני ההארה עבור שלב ההמרה. וזהו זה.

תודה לצפייה. בהצלחה בניסוייכם.