לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl
15 בפברואר 2010
צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.
סרטון זה מדגים את הליך המרת התמונות של Styro Dye FM 1 43. כדי לחקור בריכות שלפוחית סינפטיות בדרוזופילה מלנוגסטר מנותחים תחילה זחלי דרוזופילה כדי לחשוף את שרירי הגחון המהווים את הצומת העצבי-שרירי או הכנת NMJ. התכשירים מודגרים במאגר המכיל FM D המוצג כאן בקרום סלולרי עם תיוג אפור.
לאחר מכן הם מגורים חשמלית או כימית כדי לגרום לקרום שלפוחית היתוך פיזי מופנם לאחר מכן. אקסוציטוזיס מגורה יוכתם ב- FM D.לאחר מכן נשטף צבע ה- FM החוץ-תאי, מסיר אותו מקרום הפלזמה, והרקמה מקובעת בתאורה מתמשכת בעוצמה גבוהה. הצבע מולבן לחלוטין והצבע השחור מופיע עקב האמינו בן והמשקעים.
לאחר מכן ניתן לדמיין את המשקעים הללו על ידי שידור em. היי, אני פיליפ או פאסו מהמעבדה של סילביה אולי במכון האירופי למדעי המוח בגאון, גרמניה. היום נראה לך נוהל להמרת תמונות FM צומת עצב שרירי.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור מיחזור שלפוחית סינפטית. אוקיי, אז בואו נתחיל לעבוד תחת מיקרוסקופ מנתח. התחל בהצמדת צד גב של זחלי דרוזופילה כלפי מעלה בצלחת מצופה כל כך שומר.
כסו אותו במי מלח דרוזופילה בעזרת מחט מזרק ומצאו מספריים לדיסקציה חתכו את הצד הגבי לאורך. ואז הסר את האיברים הפנימיים. לאחר מכן, מותחים את התכשיר ושוב, מצמידים אותו לכלי הסיגר.
לאחר מכן ניתן להשתמש במספר שרירי גחון כדי להגן על צבעי FM המשמשים בהליך זה מפני הלבנה. יש לבצע הליך זה בתנאי תאורה חלשים. מכסים את תכשיר הדרוזופילה הצבוט בתמיסת מלח דרוזופילה המכילה 90 מילי-מולרית אשלגן כלורי, ו-10 מיקרו-מולרי FM.1 43 מתים כדי לעורר כימית את העצבים.
יש לדגור למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר לאחר הגירוי. הסר את התמיסה המגרה וטבל את המנה עם הדרוזופילה המוצמדת. הכנה בכוס מלאה ב -100 מיליליטר מי מלח דרוזופילה פעמיים להסרת תבנית FM 1 43 החוץ-תאית הפועלת מתחת למכסה מנוע בטיחות כימי.
תקן את תכשיר הצומת העצבי-שרירי ב-2.5% גלוטראלדהיד במי מלח חוצץ פוספט או PBS למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את התכשיר פעם אחת עם PBS, ואז מוציאים אותו מכלי הסיגר וטובלים אותו ב-100 מילי-מולרי אמוניום כלוריד למשך 15 דקות. כדי להרוות את קבוצות האלדהיד החופשיות של קיבוע אלדהיד העכוז הנותר.
בעזרת PBS רגיל שטפו את תמיסת האמוניום כלוריד, הניחו את תכשיר הצומת העצבי-שרירי בצלחת סיגר חדשה וטבלו אותה ב-1.5 מיליגרם למיליליטר מסוננים. דיאמין בנזין או DAB ב-PBS ודגירה במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מקם את הדגימה מתחת למיקרוסקופ פלורסנט המצויד במקור אור מנורת כספית עם בית מנורה המכיל מראה אחורית באמצעות מטרה יבשה בהגדלה נמוכה יחסית.
מצא את הדוגמה. לאחר מכן באמצעות קוביית מסנן פלואורסצנטי ירוקה עירור כחול רגיל, הבא את האות הפלואורסצנטי למיקוד. הצמתים העצביים-שריריים מופיעים כנקודות בהירות על השרירים.
לאחר מכן, באמצעות אותה ערכת מסנני פלואורסצנטיות, האירו את הדגימה בעוצמה מקסימלית עד שה-FM D מולבן לחלוטין. באמצעות עדשה אובייקטיבית של פי 20, 30 עד 45 דקות אמורות להספיק. עם זאת, זמן המרת התמונות משתנה בהתאם לעוצמת התאורה, חוזק חדירת ה-DAB לתכשיר ועדשת האובייקט המשמשת.
לאחר ההארה, בדוק את הדגימה תחת נורית שידור. אם התרחשה המרת תמונה, יש לראות משקע חום כהה. חזור לטווח החיתוך ולאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את הנקודה שהומרת מהתמונה מהזחל.
חזור לטווח החיתוך. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לחתוך את נקודת ההמרה של התמונה מהזחלים. כעת הנח את הדגימה בצינור מיקרו פוגה המכיל PBS הפועל מתחת למכסה בטיחות כימי ולובש ציוד בטיחות מתאים, כולל כפפות והגנה על העיניים.
הכן 300 מיקרוליטר של 1% טטרוקסיד אוסמיום לדגימה. כעת הניחו את הדגימה בבקבוק זכוכית מצופה פלסטיק והוסיפו את תמיסת האוסמיום טטרוקסיד המוכנה כדי לתקן את ההכנה. בזמן שהדגימה דגירה, הכינו תמיסות נפרדות המכילות 30, 50, 70, 90, 95 ו-100% אתנול.
שטפו את הדגימה ארבע עד חמש פעמים עם PBS למשך חמש דקות כל אחת. לאחר כל שטיפה, השתמש ב-PEs מפלסטיק לפיפטה שלך כדי להעביר את הדגימה לבקבוק חדש. לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את הדגימה לבקבוק זכוכית נקי.
לאחר מכן, יבש את הדגימה על ידי הנחתה בסדרת תמיסות האתנול. התחל בדגירה במיליליטר אחד של 30% אתנול. לאחר חמש דקות, הסר את האתנול באמצעות פיפטת מרעה והחלף אותו במיליליטר אחד של 50% אתנול.
המשיכו עם ההתייבשות, דגרו על הכנת הצומת העצבי-שרירי בתמיסות של 70, 90 ולאחר מכן 95%. לאחר מכן הדגימה תודגר בתמיסת אתנול 95% יותר פעמים מאשר מודגרת ב-100% אתנול שלוש פעמים לאחר התייבשות. הוסף שני מיליליטר של שרף EIN אחד לאחד לאתנול והנח את הדגימה על דגירה מסובבת.
שעתיים עד ארבע שעות בטמפרטורת החדר לאחר סיבוב ב-100% ein והנח את הדגימה בבקבוק פתוח כדי לאפשר לאתנול הנותר להתאדות במשך ארבע עד שש שעות. יוצקים EIN טרי לתבנית. מוסיפים את התכשירים ודוגרים בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 36 שעות.
כאשר התכשירים המוטמעים ב-EIN מוכנים, השתמשו במיקרוטום אולטרה להכנת חלקים דקים של 50 עד 80 ננומטר בעזרת סכין יהלום. הדגימות נחתכות בחלקים דקים. החלקים זורמים על אמבט המים של הסכין וניתן לאסוף אותם לאחר מכן על רשתות EM רגילות.
ההכנות מוכנות כעת להדמיה באמצעות הליכי EM קונבנציונליים. צמתים עצביים-שריריים מבודדים מגסטר דרוזופילה מלאן עוררו באמצעות אשלגן גבוה וממברנות מופנמות. הוכתמו באמצעות FM 1 43 כפי שמוצג כאן.
ניתן לצפות בקרינה של מסוף עצב באמצעות מיקרוסקופ אפי פלואורסצנטי קונבנציונאלי. בתאורה רציפה, הצבע מולבן לחלוטין וכאשר התאורה נמשכת, מופיע צבע שחור עקב משקעי דינו בנזין. מסוף עצב זה מכיל שלפוחיות סינפטיות, אך אף אחת מהן אינה מומרת לתמונות.
זה יכול להיגרם מחוסר תאורה או חדירה לקויה של אמינו בנזין DIA לרקמה. לעומת זאת, תאורה רבה מדי מביאה למסוף חשוך כללי שבו לא ניתן להבחין בין שלפוחיות או אברונים עם הכמות המתאימה של המרת תמונות תאורה. מיקרוגרף זה מציג בוטון סינפטי שבו נראית בריכה של שלפוחיות כהות המצביעות על המרת תמונות FM.
זה עתה הראינו לך כיצד להמיר שלפוחיות סינפטיות המסומנות במות נקבה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור תמיד לכייל בקפידה את זמני ההארה עבור שלב ההמרה. אז זהו.
תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
הסרטון הזה מדגים את הנוהל להמרה פוטוכימית של צבע ה-Styro Dye FM 1-43 לחקר מאגרי שלפוחיות סינפטיות ב-Drosophila melanogaster. השיטה כוללת ניתוח זחלים כדי לחשוף את הצומת הנוירו-שרירית, השריה בצבע FM, ושימוש בתאורה בעוצמה גבוהה לצורך ויזואליזציה.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה תאית
- דינמיקה סינפטית
רקע
- צבעי FM חיוניים להבנת הדינמיקה הסינפטית.
- הם מאפשרים ויזואליזציה של מאגרי שלפוחיות סינפטיות.
- שילוב צבעי FM עם מיקרוסקופיה אלקטרונית משפר את התובנות המבניות.
- טכניקות ההמרה הפוטוכימית חושפות אוכלוסיות שלפוחית שונות.
מטרת המחקר
- לחזות מאגרי שלפוחיות סינפטיות ב-Drosophila.
- להדגים את תהליך ההמרה הפוטוכימית של צבעי FM.
- לשפר את ההבנה של מנגנונים סינפטיים.
שיטות בשימוש
- ניתוח של זחלי Drosophila כדי לגשת לצמתים הנוירו-שריריים.
- השריה של הכנות בתמיסת צבע FM.
- גירוי חשמלי או כימי כדי לגרום לבליעה תאית.
- תאורה בעוצמה גבוהה להלבנת הצבע ולויזואליזציה.
תוצאות עיקריות
- סימון מוצלח של ממברנות תאים עם צבע FM.
- ויזואליזציה של אירועי היתוך שלפוחיות לאחר גירוי.
- זיהוי ברור של מאגרי שלפוחיות סינפטיות שונים.
- הדגמה של יעילות ההמרה הפוטוכימית במיקרוסקופיה.
מסקנות
- צבעי FM הם כלים יעילים לחקר דינמיקה סינפטית.
- ההמרה הפוטוכימית משפרת את הוויזואליזציה של מבנים סינפטיים.
- שיטה זו יכולה לשמש למחקרים סינפטיים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Precise mapping of synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes enables high-resolution analysis of vesicle recycling dynamics, a critical step in understanding neurotransmitter release mechanisms. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in early neuroscience drug discovery, informing portfolio decisions where synaptic function is a therapeutic focus. Integration of optical and ultrastructural readouts enhances predictive confidence for translational research in neuropharmacology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vesicle recycling, clarifying synaptic pathway mechanisms.
- Supports functional target validation by linking vesicle dynamics to neuronal activity.
- Facilitates mechanistic de-risking for synaptic targets in neurodegenerative and psychiatric disorders.
- Provides structural context for hypothesis-driven interrogation of synaptic function.
Screening & Assay Development
- Establishes validated neuromuscular junction preparations for downstream compound screening.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of vesicle pool dynamics via fluorescence and EM.
- Enables assay standardization for cross-study and cross-site comparability.
- Supports scalability for screening synaptic modulators in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vesicle pool measurements with disease-relevant synaptic dysfunction models.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of synaptic targets.
- Informs risk-adjusted advancement of candidates affecting neurotransmitter release pathways.
- Enhances predictive value for translational biomarker development in CNS disorders.
Pipeline & Workflow Integration
This photoconversion method bridges early discovery and preclinical research by enabling direct, quantitative analysis of synaptic vesicle dynamics in model systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for synaptic targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative vesicle pool measurements for assay development.
- Analytics: Delivers high-resolution structural and functional readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for synaptic vesicle analysis across multiple programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in synaptic target validation.
- Operational Value: Standardizes vesicle pool analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation for CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of synaptic target programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, electron microscopy, and neuroanatomical dissection.
- Demands access to high-intensity illumination sources and EM infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of stimulation and photoconversion parameters.
- Adaptation may be needed for different model organisms or synaptic systems.
- Photoconversion efficiency is sensitive to illumination calibration and tissue penetration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:57
Introduction
1:24
Preparation of Drosophila melanogaster Neuronal Muscular Junction (NMJ)
2:05
Stimulation and FM Staining
2:43
Fixing Neuromuscular Junction Preparations
4:49
Processing the Sample for Electron Microscopy
7:29
Representative Results
3:19
Photoconversion of FM1-43
8:19
Conclusion
