אלקטרודה ייצור השרשה ב Aplysia californica עבור הקלטות רב ערוצי עצבית ושרירי ב, חיים שלמים חופשי מתנהג
June 4th, 2010
הטכניקה מתוארת עבור השתלה four In vivo אלקטרודות לפקח על השליטה neuromuscular התנהגות האכלה Aplysia californica.
כדי לבצע את מכלול האלקטרודות להקלטות רב-ערוציות in vivo, נוצרות ארבע אלקטרודות דיפרנציאליות ומסתובבות יחד עם האלקטרודות הדיפרנציאליות הבודדות המסתעפות זו מזו. בקצוות, החיה המורדמת מוצמדת החוצה ומבצעים חתך בצד נקודת העין. עצבי המטרה והשרירים ממוקמים ואלקטרודות מחוברות לטיפת דבק-העל בבסיס הקרס, ולאחר מכן מבודדות באיטום איטום מהיר.
היי, אני מירנדה קולינס מהמעבדה של ד"ר הלאל תיל מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קיס ווסטרן ריזרב. היום אראה לכם נוהל להרכבה והשתלה של אלקטרודות להקלטות in vivo ב-SIA, קליפורניה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הבקרה העצבית-שרירית של הזנה וסיה.
בואו נתחיל. כדי ליצור את האלקטרודה השתמש במספריים כדי לחתוך חתיכת חוט נירוסטה מצופה אמייל בקוטר 0.001 אינץ 'באורך של כשני מטרים. חבר כדור מרק קטן לכל קצה החוט.
קפלו את החוט לשניים וסובבו את הקצוות ליצירת זוג מעוות הנקרא אלקטרודה דיפרנציאלית. הדביקו את שני קצוות החוט כדי למנוע התפרקות. צור ארבע אלקטרודות דיפרנציאליות באמצעות צבע סרט שונה עבור כל אלקטרודה דיפרנציאלית.
למטרות זיהוי, סובב שתיים מהאלקטרודות הדיפרנציאליות יחד, והשאיר שני סנטימטרים לא מפותלים בקצה אחד וסנטימטר אחד בקצה השני. חזור על הפעולה עם זוג הג'ודים הדיפרנציאליים הנותרים. סובב את שתי הקבוצות של שתי אלקטרודות דיפרנציאליות יחד, וודא שהקצוות יישארו לא מפותלים.
החזק את מכלול האלקטרודות והחל דבק סיליקון ביתי בצומת ארבע האלקטרודות הדיפרנציאליות, והשאיר את הקצוות חופשיים. תלו והניחו לדבק להתייבש לפחות ארבע שעות. כדי לבודד את הענפים, הנח את מכלול האלקטרודות על משטח נע שטוח כגון חתיכת עץ.
השתמש בחתיכת פלסטיק קטנה כדי להרים את מכלול האלקטרודה ממש לפני שהוא מסתעף, ואבטח אותו עם סרט. אווררו את הקצוות ואבטחו אותם בעזרת סרט. במיקרוסקופ הניתוח, השתמש במלקחיים כדי לצפות את הענפים בדבק סיליקון.
הקצוות באורך סנטימטר אחד יהיו בתוך החיה, כך שהם צריכים להיות בעלי שכבת דבק דקה מאוד. הניחו לדבק להתייבש לפחות שלוש שעות. קצר את הקצה באורך סנטימטר אחד של אלקטרודה דיפרנציאלית אחת לשני סנטימטרים בכל קצה של האלקטרודה.
השתמש במלקחיים כדי לגרד סיליקון ואמייל משני החוטים. כדי לחשוף סנטימטר אחד של חוט חשוף, סלסל חוט חשוף אחד לוו להקלטה. ואז החוט השני למעלה והרחק מהוו כדי לשמש כחוט ההארקה בקצה באורך שני אינץ' הלחם סיכת מחבר זהב לכל חוט.
השתמש בפיסת סרט כדי לאבטח את הקצה ולשמור על מרווח בין הקרקע לפיני ההקלטה. חזור על שלבים אלה כך שיהיו ווים ומחברי זהב בכל ארבע האלקטרודות הדיפרנציאליות. חבר כדור של סנטימטר עד שניים של דבק הסיליקון לכבל כ -1.5 סנטימטר מקצה הקרס.
כדי לעגן את האלקטרודות בתוך החיה המותרת להתייבש למשך שעה לפחות, בחר בעל חיים בריא השוקל כ-350 עד 450 גרם בתגובה לחתיכות קטנות של אצות. החיה צריכה לייצר נשיכות במרווחים של בין שלוש לחמש שניות. הניתוח המלא עם השתלת אלקטרודות אמור להימשך כשעה.
הניחו את החיה המורדמת במגש דיסקציה כשרגלה כלפי מטה עם הפנים אל החיה חזיתית. העבר את אזור הזימים שמאלה כך שהחיה תהיה חלקית על צידה ונשענת הצידה, מוצמדת כלפי מטה את הזרועות הקדמיות. הניחו את המגש על הבמה של מיקרוסקופ מנתח.
העמידו את המגש בזווית של כ-20 מעלות כדי להרים את הראש ואספו את המולימפה בזנב הרחק מהחתך בעזרת מספריים לדיסקציה, התחילו חתך מעט מימין לנקודת העין והאריכו אותו סנטימטר עד 1.5 סנטימטר לכיוון הראש. השתמש בטרקטורים שלך. חבר לשולי המגש כדי להחזיק את החתך פתוח.
לחשוף את המסה הבוקאלית. השתמש במלקחיים כדי להרים את הממברנה השקופה מתחת לעור והשתמש במספריים כדי לחתוך פתח, התואם את החתך הראשי. תחוב את שולי הממברנה לתוך המחזירים.
הנח את מכלול האלקטרודה על מיקרו מניפולטור והעביר אותו מעל החתך של החיה. לכל אחת מארבע האלקטרודות ייקח כ-10 עד 15 דקות להתחבר גישה לעצבים תוצג תחילה, ואחריה חיבור לאלקטרודה לעצב הסופי. עם זאת, בפועל, יש לחבר כל עצב לאלקטרודה לפני חשיפת העצב הבא.
העצב האולרי הוא הקשה ביותר לגישה ויש לגשת אליו תחילה. ישנן שתי אפשרויות לגישה לעצב האולרי. האפשרות הראשונה, העדיפה, היא להסתכל מתחת לגנגליון הבוקאלי בין BN 1 ל-VN 2.
אם נראה ענף של העצב האולרי, השתמש במלקחיים עדינים מכופפים לתוך וו כדי להרים את הענף. אם ענף של העצב האולרי אינו נגיש מעל השריר, אפשרות שנייה היא לגשת אליו דרך חתך קטן ב-I 2 ליד רקמת החיבור בבסיס הגנגליון הבוקאלי. החתך ב-I two חייב לעבור דרך שתי שכבות של שריר I two כדי לחבר אלקטרודה ל-I two.
השתמש במלקחיים המחוברים כדי להרים ולהפריד שתי רצועות של העצב הבוקאלי השני של השריר I two. עצב בוקאלי שלוש נמצא כאן וישמש להדגמת חיבור אלקטרודות. כל האלקטרודות מחוברות באותו אופן כפי שמודגם כעת בעצב הבוקאלי שלוש.
לאחר שהעצב מחובר למלקחיים, השתמש בסט נוסף של מלקחיים כדי לתפעל וו אלקטרודה אחד על העצב באמצעות המניפולטור המיקרו. הרם את הקרס כך שהעצב יתרומם והתרחק מהמסה הבוקאלית. נקי מכל עצב או רקמה אחרת שהורם כמה שפחות, חצי סנטימטר או פחות.
כדי להימנע ממתיחת יתר של העצב, השתמש במגבון קים כדי לייבש את האלקטרודה ואת האזור הסמוך של העצב. סיכת חרקים משמשת למריחת הדבק, לאבטח את האלקטרודה בעזרת טפיחה קטנה של דבק-על במקום בו בסיס הקרס נמצא במגע עם תחתית העצב. מרחו טיפה של מי מלח אליסיה או לימפה המו כדי לקבע את דבק העל.
ואז אדום יבש את הקרס על תערובת שקיות קרח. דבק איטום מהיר. זה שומר על הדבק פעיל במשך כ-30 דקות.
ייתכן שיהיה צורך בערבובים נוספים במהלך הניתוח. השתמש בסיכת החרקים כדי לכסות לחלוטין כל חוט חשוף של הקרס בכמות קטנה של איטום מהיר. הימנעות מחוט האדמה.
הניחו לדבק להתייצב למשך חמש דקות. התאמת הדבק מחדש. אם הוא מתרחק מהוו, המתן עד שהדבק יתייבש לפני שתיגש לעצב הבא.
לאחר חיבור כל האלקטרודות, החלק את מכלול האלקטרודות לתוך החיה עד לעוגן הסיליקון. תפר את החתך הסגור סביב כבל האלקטרודה הבולט. שמירה על העוגן בתוך החיה מדביקים את התפרים כדי להבטיח אטימה טובה.
הכנס את קצות מחבר הזהב בקצה השני של האלקטרודה לתוך גוש קטן של קלקר. החזר את החיה למיכל הראשי במיכל בידוד מאוורר להתאוששות למשך הלילה. אקלום את בעל החיים במיכל מאוורר כשהוא מחובר לציוד ההקלטה למשך שעה וחצי לפחות.
עקוב אחר האות בזמן שהחיה מתאקלמת כדי לוודא שכל האלקטרודות פועלות ושרמות הרעש נמוכות. השתמש במצלמת וידאו כדי להקליט התנהגות האכלה תוך שימוש במחשב כדי להקליט אותות מהאלקטרודות העצביות והשריריות. סנכרן את הקלטות הווידאו והאלקטרודות באמצעות אות גל מרובע השולט במונה דיגיטלי בתצוגת המצלמה בזמן שהוא מוקלט בו זמנית כערוץ נוסף במחשב.
ב-aScope כאשר החיה ניזונה, יהיו פרצי פעילות על העצבים והשרירים. הנה דוגמה לדפוס בליעה עם פעילות EMG מ-I 2 ו-ENG מ-RN BN 2 ו-BN 3. זה עתה הראינו לכם כיצד לייצר ולהשתיל אלקטרודות רב-ערוציות כדי לתעד את הפעילות העצבית והשרירית במהלך התנהגות האכלה בהתנהגות חופשית.
בעת ביצוע הליך זה, הקפד לטפל בעצב בזהירות ולהקפיד לאטום לחלוטין את ווי ההקלטה כך שאף אחד מהחוטים לא ייחשף. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר טכניקה להשתלת ארבעה אלקטרודות in vivo כדי לנטר את השליטה הנוירומוסקולרית של התנהגות האכלה ב-Aplysia californica. הנוהל כולל יצירת מכלול אלקטרודות רב-ערוצי להקלטות in vivo.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה התנהגותית
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- Aplysia californica הוא אורגניזם מודלי לחקר השליטה הנוירומוסקולרית.
- הבנת התנהגות האכלה היא חיונית להבנה מנגנונים עצביים.
- הקלטות in vivo מספקות נתונים בזמן אמת על פעילות השרירים והעצבים.
- הטכניקה משפרת את היכולת לחקור התנהגויות מורכבות בסביבה מבוקרת.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה אמינה לנטר פעילות נוירומוסקולרית.
- לחקור את השליטה העצבית על האכלה ב-Aplysia californica.
- לשפר את ההבנה של הקשר בין אותות עצביים והתנהגות.
שיטות בשימוש
- יצירת מכלול אלקטרודות רב-ערוצי.
- השתלת אלקטרודות באפליסיה מורדמת.
- חיבור אלקטרודות לעצבים ושרירים ממוקדים.
- שימוש בדבק-על וחומר איטום לבידוד ויציבות.
תוצאות עיקריות
- השתלה מוצלחת של אלקטרודות מאפשרת ניטור יעיל.
- איסוף נתונים בזמן אמת על שליטה נוירומוסקולרית במהלך האכלה.
- הבנות שהושגו במנגנונים העצביים העומדים בבסיס התנהגות האכלה.
- הוכחת תועלת הטכניקה במחקרים התנהגותיים.
מסקנות
- הטכניקה מספקת כלי חשוב למחקר נוירומדעי.
- משפרת את ההבנה של השליטה הנוירומוסקולרית באפליסיה.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר בחקר התנהגויות אחרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This electrode fabrication and implantation method enables multi-channel neural and muscular recordings in freely behaving animals, addressing a key limitation in behavioral neuroscience where prior techniques required averaging across animals due to low-yield multi-electrode implants. By reducing electrode bulk and improving insulation reliability, the approach supports chronic recordings for up to a week, enhancing data quality for mechanistic studies of neuromuscular control. This advancement improves predictive confidence in target validation by enabling precise temporal correlation of neural activity with behavior in intact systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous recording from multiple nerves and muscles during natural behavior.
- Operational Value: Reduces variability from inter-animal differences by capturing longitudinal data from single animals.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by clarifying neural pathway involvement in feeding motor patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization by establishing reliable neuromuscular signal baselines.
- Operational Value: Facilitates assay reproducibility through stable electrode insulation that maintains signal integrity over extended recording periods.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements of neural and muscular activity timing and phasing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking neural signals to defined behavioral outputs in a tractable invertebrate model.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by allowing repeated behavioral testing under consistent recording conditions.
- Scientific Value: Enhances mechanistic de-risking through precise temporal resolution of neuromuscular coordination.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of neuromuscular control mechanisms through multi-site electrophysiological monitoring in behaving animals.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by allowing concurrent monitoring of functionally related nerves and muscles during behavior.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized electrode fabrication that yields consistent signal-to-noise ratios across recording sessions.
- Analytics: Generates synchronized neural and muscular readouts that enable cross-condition comparison of activation patterns.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by correlating electrophysiological signatures with specific motor programs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic neuromuscular monitoring applicable across behavioral paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural-behavioral relationships.
- Operational Value: Improves standardization and scalability through a fabrication process using accessible materials and tools.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decisions by providing high-fidelity, longitudinal neuromuscular data from single subjects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative neural activity profiles during ethologically relevant behaviors.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, electrode fabrication, and behavioral observation of invertebrate models.
- Depends on dissection microscopy, micro-manipulators, and biocompatible adhesives (superglue, silicone sealant) for chronic implantation.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, engineering, and animal care units for consistent electrode preparation and postoperative care.
- Involves adaptation considerations for different target tissues, as electrode attachment techniques vary by nerve and muscle accessibility.
- Includes practical limitations such as adhesion formation risk if electrode bulk is not minimized, which could impair natural behavior.
