Name: ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-02T17:57:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: למדו לתעד תגובות חשמליות של נוירונים חוש ריח בעכברים באמצעות שיטת האלקטרואולפקטוגרם. פרוטוקול זה מספק כלי אמין לחקר תפקוד הריח ברמת האפיתל הריחני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר שיר Yijun, וחברי Kuruvilla Hattar זאו תלת במעבדה של המחלקה לביולוגיה, אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס עצה ועזרה. נתמך על ידי NIH מענקים DC007395 ו DC009946.

חלק 1. הגדרת הקלטה EOG מנגנון הקלטה מורכב אלקטרודה הקלטה, אלקטרודה השוואתית, משלוח צינור אוויר, שלב הדגימה, ואת מיקרוסקופ לנתח, כל מעוגן על שולחן האוויר בתוך כלוב פאראדיי. Micromanipulators משמשים מיקום האלקטרודות ואת צינור אספקת האוויר. זרם אוויר רציפה הוא מבעבע דרך מים מזוקקים כדי להוסיף לחות לפני עובר דרך צינור אספקת האוויר על הדגימה. צלחת תרבות 60 מ"מ מלא Sylgard עד לעומק של 6-8 מ"מ משמש כמשטח הרכבה הדגימה. גם ותעלה הם חלולים מתוך Sylgard בצלחת גובר לספק אמצעי לחבר את אלקטרודה חשמלית התייחסות הדגימה באמצעות פתרון שונה רינגר. אלקטרודה הקלטה האלקטרודה התייחסות מחוברים למגבר. אותות מן המגבר נשלחים digitizer, ולאחר מכן למחשב. תוכנות כגון Axograph או pClamp יכול לשמש כדי לשלוט על פרוטוקול גירוי, כדי להקליט את האות, עבור ניתוח בדיעבד של התגובות. אוסצילוסקופ מחובר אחרי המגבר יכול להיות נוח עבור ניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי תוך הצבת אלקטרודה הקלטה במהלך ההקלטות EOG. מסירה של גירויים odorant נשלטת על ידי Picospritzer, אשר מחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת אות. לחץ האוויר בכל Picospritzer מוגדר 10 psi. טנק באוויר הרגולטור יחיד יכול לשמש כדי לספק אוויר לשולחן הן האוויר Picospritzer. טנק באוויר הרגולטור השני משמש כדי לספק אוויר זרם האוויר humidified, כמו זה דורש לחץ נמוך כמות גדולה של זרימת האוויר. רק לפני מתן תמריץ odorant, הפלט Picospritzer מחובר בקבוק odorant. הבקבוק odorant מחובר אז צינור אספקת האוויר. חלק 2: הכנת אלקטרודות אלקטרודה ההקלטה חוט כסף chlorided בכוס משך נימי מלאים פתרון שונה של רינגר (135 mM NaCl, KCl 5 mM, 1 mM CaCl 2, 1.5 מ"מ MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.4, מסנן מעוקרים). אלקטרודה השוואתית הוא חוט כסף chlorided. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן חוט כסף לתוך מחזיק האלקטרודה. עבור האלקטרודה הקלטה, 1-2 ס"מ של חוט צריך לבלוט מהקצה של מחזיק האלקטרודה. חוט נוסף ניתן עזב האלקטרודה התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להוסיף את המעיל AgCl על חוט כסף, מקם את חוט 0.1 M NaCl ולחבר את מחזיק האלקטרודה להדק החיובי של מקור מתח DC 1.5-9 וולט. הטרמינל השלילי של מקור הכוח צריך להיות מחובר חשמלית של פתרון 0.1 M NaCl. אפשר התגובה chloriding להמשיך במשך 10 דקות. כדי להשוות כל מטען סטטי בין ההקלטה לבין אלקטרודה השוואתית, לגעת בקצרה את האלקטרודות יחד לפני להתקין אותם במכשיר ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך זכוכית נימי באמצעות חולץ micropipette. פתיחת בקצה של נימי צריך להיות סביב 5-10 מיקרון קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עיפרון יהלום להבקיע ולשבור את הקצה הקהה של נימי כך ~ 2 ס"מ יותר מאשר חוט כסף. Fire-ללטש את הקצוות עם הלפיד בוטאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים agarose 0.5% בפתרון שונה רינגר. משוך כמות קטנה של פתרון agarose מותכת לתוך קצה האלקטרודה בעזרת פיפטה ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את נימי משך כ 1 / 2 הדרך עם פתרון שונה של רינגר (מזרק כי כבר מחומם ומשך יש סוף דק וארוך הוא שימושי לצורך זה). בעדינות קפיצי נימי כדי לסלק בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה מלא בצנצנת אחסון עם כמות קטנה של פתרון שונה רינגר בתחתית עד שהם מוכנים לשמש. לאחר דגימת רקמה ערוכה ומוכנה הקלטה, להתקין נימי מלא על חוט האלקטרודה ההקלטה. </li></ol> חלק 3: פתרונות odorant הכנת אצטט odorants amyl ו heptaldehyde לעורר תגובות גדולים הם בחירה טובה וכך גם ממריצים EOG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב צינורות microcentrifuge, להכין סדרה של דילולים של odorant ב sulfoxide דימתיל (DMSO). כנקודת התחלה עבור עקומת מנה תגובה, להכין פי 10 דילולים מ M 5-5 x 10 -6 מ ' הפוך את דילולים טרי בכל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל את odorants של פי 50 על ידי ערבוב מים 100 מניות בדילול μL ב DMSO עם מים MLS 4.9 ב 2 בקבוקים עם פקקים לאונקיה סיליקון. בואו הפתרונות לאזן בבקבוקים למשך 30 דקות לפחות. שים לב כי ריכוז אדי של odorants בבקבוק אחד אינו ידוע, אך עשוי להשתנות כפונקציה של ריכוז odorants בשלב נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף שני 18-מד מחטים באמצעות פקק סיליקון provide קלט פלט יציאות. יציאות צריך להיות מחובר לחשמל כאשר הבקבוק לא בשימוש. </li></ol> חלק 4: הקלטה וניתוח נתונים EOG <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורבן עכבר ידי המתת חסד CO 2 או הרדמה יתר בעקבות עריפת ראש. הסר את העור שמעל הגולגולת sagittally לחצות את הראש לאורך קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר מחצית הראש, בצד המדיאלי למעלה, על צלחת גובר. הסר בזהירות את מחצה לחשוף את turbinates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת עם רקמה רכוב על הבמה את ההקלטה. יישר את הבמה כל כך את המיקום ההקלטה turbinates הוא מרוכז תחת המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הטנק באוויר כדי לספק אוויר humidified אל פני השטח חלזוני. מיקום צינור אספקת האוויר, כך הוא כ 10 מ"מ מן המיקום ההקלטה. קצב הזרימה הוא ~ 600 mL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המגבר על מצב DC (הגברה AC יניעו חפצים האות EOG) עם פילטר נמוך לעבור על kHz 1, ולהשיג על 100x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הקלטה אלקטרודות התייחסות על micromanipulators. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את האלקטרודה התייחסות אל תוך הבאר על צלחת הרכבה ומכסים פתרון כזה הוא מחובר חשמלית לרקמה שונה רינגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוריד את האלקטרודה הקלטה על פני השטח של חלזוני IIb או השלישי. האלקטרודה צריכה כמעט לגעת במשטח של אפיתל הריח! כאשר האלקטרודה בא במגע עם האפיתל (כלומר משלים מעגל חשמלי) בסיסית ישר יופיע האוסילוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף בקבוק odorant לנמל בצד על צינור אספקת האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחשב, ליזום פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה לרכישת נתונים צריך להיות 2 קילוהרץ ומעלה. התוכנה תפעיל את הדופק ריח להתחיל את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול גירוי אופייני יכול להיות דופק 100 msec משך אחת, יחד 100 msec פולסים מופרדים על ידי רווח 1 שניות, או 10 שניות הדופק מתמשכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר קצת זמן בין פרוטוקולי כך את רקמת מותאם מינימלית. רגע אחד הוא די ריכוזי נוזלי של אצטט amyl ו heptaldehyde עד 10 מ -3: בריכוזים גבוהים לאפשר 5 דקות. לאחר מתן ריח בריכוזים גבוהים (כמו בסוף של עקומת מנה תגובה) ריח שיורית עשויים להישאר בצינור. לשטוף את צינור האוויר עם אתנול 95% ויבש לפני שתמשיך עם דגימות רקמה נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Axograph התוכנה מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של האות EOG. פרמטרים אלה כוללים את המשרעת בתגובה, חביון, זמן שיא, וקבועים זמן של סיום. זה יכול להיות רצוי דיגיטלית לסנן עקבות ב 25 הרץ לפני ניתוח נוסף. </li></ol> נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="דמות 1"> באיור 1. פרמטרים עבור EOG ניתוח. פרמטרים כמה EOG הם שימושיים במיוחד עבור השוואה של תגובות בין עכברים, לרבות משרעת בתגובה, חביון (הזמן בין הגירוי כאשר ניתנת ותגובה מתחיל), עלייה (הזמן בין תחילת התגובה ואת שיא), זמן שיא (הזמן מתחילת הגירוי לשיא של התגובה), וזמן קבוע סיום (τ, נקבע על ידי התאמת שלב הדעיכה של התגובה משוואה מעריכית יחיד ). לשם השוואה של פרמטרים קינטיים כגון חביון, זמן העלייה, זמן קבוע של סיום, רצוי לנרמל את המשרעת שיא של תגובות לפני ניתוח. <img src="/files/ftp_upload/1850/1850fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="דמות 2"> איור 2. נציג EOG אותות תחת פרוטוקולים גירוי שונים. (א) דוגמאות EOGs מתוך עכבר בתגובה לגירוי עם ריכוז גדל והולך של אצטט amyl. קו שחור בחלק העליון של הלוח מציין את העיתוי וזמן הגירוי odorant. הריכוזים במקרא הם ריכוזים של הפתרון נוזלי. (ב) ביחס מנה תגובה ממוצע של חמישה עכברים. ברים שגיאה הם רווחי סמך 95%. ירידה משרעת השיא הוא נצפה לעיתים קרובות ריח בריכוזים גבוהים מאוד. (ג) דוגמה EOG בתגובה לגירוי לזווג-דופק. הדופק קצר אחד של odorant מעורר הסתגלות שנמשך כמה שניות. (ד) דוגמה EOG בתגובה 10-sec גירוי מתמשך odorant. EOG מראה הפחתת רגישות במהלך המצגת odorant רציפה.

<ol><li>Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+electrical+activity+of+the+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).</li>
<li>Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroolfactogram%3A+a+review+of+its+history+and+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">The electroolfactogram: a review of its history and uses.</a> Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).</li>
<li>Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+anosmia+caused+by+a+targeted+disruption+of+the+mouse+olfactory+cyclic+nucleotide-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel.</a> Neuron. 17, 681-693 (1996).</li>
<li>Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+in+G%28olf%29+are+anosmic%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mice deficient in G(olf) are anosmic.</a> Neuron. 20, 69-81 (1998).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279, 237-242 (1998).</li>
<li>Wong, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+type+III+adenylyl+cyclase+gene+leads+to+peripheral+and+behavioral+anosmia+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice.</a> Neuron. 27, 487-497 (2000).</li>
<li>Munger, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+the+CNGA4+channel+subunit+in+Ca2%2B-calmodulin-dependent+odor+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation.</a> Science. 294, 2172-2175 (2001).</li>
<li>Michalakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CNGB1+protein+leads+to+olfactory+dysfunction+and+subciliary+cyclic+nucleotide-gated+channel+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping.</a> J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).</li>
<li>Buiakova, O. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+marker+protein+%28OMP%29+gene+deletion+causes+altered+physiological+activity+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).</li>
<li>Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+chloride+accumulation+in+olfactory+epithelium+of+mice+lacking+NKCC1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1.</a> J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).</li>
<li>Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+CNG+channel+desensitization+by+Ca2%2B%2FCaM+via+the+B1b+subunit+affects+response+termination+but+not+sensitivity+to+recurring+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation.</a> Neuron. 58, 374-386 (2008).</li>
<li>Cygnar, K. D., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+1C+is+dispensable+for+rapid+response+termination+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+%22IP%283%29-odors%22%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors".</a> J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).</li>
<li>Pinato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroolfactogram+responses+from+organotypic+cultures+of+the+olfactory+epithelium+from+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice.</a> Chem Senses. 33, 397-404 (2008).</li>
<li>Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+distribution+of+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Regional distribution of rat electroolfactogram.</a> J Neurophysiol. 73, 2207-2220 (1995).</li>
<li>Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+flow+on+rat+electroolfactogram%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Effects of air flow on rat electroolfactogram.</a> Chem Senses. 25, 761-768 (2000).</li>
</ol>

העכברים טופלו ו מורדמים עם שיטות טיפול אושרה על ידי בעלי חיים ועדות השימוש של אוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס.

עם ההתקנה המתואר בפרוטוקול זה, גירויים odorant על פני השטח של האפיתל הריח יהיה עקבי בין ההכנות רקמות, המאפשרות השוואה בין סוג בר עכברים שעברו מוטציה, למרות ריכוז odorant המדויק ואת הדינמיקה אינם ידועים. מספר גורמים, במיוחד את המיקום להקליט את קצב הזרימה של האוויר humidified, לגרום לשינויים EOG. יש להקפיד לרשום מעמדות דומה על חלזוני אותו כדי למזער וריאציה. זה יכול בקלות להיות מושגת על ידי בעקביות הקלטה מאותו צד של הראש ולשמור את טביעת הרגל של המיקרוסקופ, משלוח צינור ריח, ואת micromanipulators על שולחן האוויר ללא שינוי בין דגימות רקמה. בנוסף, דגימות רקמה יש להציב מיד לתוך זרם אוויר humidified לאחר לנתיחה כדי למנוע ייבוש יתר של הרקמה. הקלטות EOG על עכברים יכולים גם להתבצע עם מנגנון זלוף נוזלי על העכבר מוכן turbinates 7, 14, 15, או על ידי השארת ראש שלם החדרת אלקטרודה לתוך קדח חור קטן מעל turbinates 16, 17. כל וריאציה של הקלטה EOG יש עוצמות משלה: אוויר שלב ההקלטות על ההכנות רקמות כמתואר בפרוטוקול זה דורשת כמות מזערית של ההתקנה הם הקלים ביותר לנהל, הקלטות באמצעות מנגנון זלוף נוזלי להקל על השימוש ריאגנטים תרופתי, למרות אופי הידרופובי של odorants רבים מסבך משלוח ריח, ולבסוף, הקלטות שבהן ראש נותר בשלמותו ניתן להשתמש ב &#39;מלאכותי לרחרח &quot;ניסויים, למרות מיקום האלקטרודה קשה יותר כאשר turbinates נחשפים במלואם.

<table><tbody><tr><td>צינור להולכת אוויר</td><td>ציוד</td><td>הכנה מותאמת אישית</td><td></td><td>ניתן להשתמש בגוף של מזרק בנפח 1 מ"ל עם מחבר T כתחליף</td></tr><tr><td>שולחן אוויר</td><td>ציוד</td><td>Newport Corp.</td><td>LW3030B-OPT</td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>ציוד</td><td>Warner Instruments</td><td>DP-301</td><td></td></tr><tr><td>מחשב ותוכנה לרכישת נתונים</td><td>ציוד</td><td>Axograph 4.9.2 על Apple Macintosh</td><td></td><td>גרסאות מעודכנות של Axograph עבור Mac OS X ו-Windows זמינות בכתובת http://axographx.com/.</td></tr><tr><td>לפיד בוטאן</td><td>ציוד</td><td></td><td></td><td>A cr&amp;#232;me br&amp;#251;נא לספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם.&amp;#232;הלפיד פועל היטב</td></tr><tr><td>דיגיטייזר</td><td>ציוד</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ לניתוח (Dissecting Scope)</td><td>ציוד</td><td>Scienscope</td><td>SSZ</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודות</td><td>ציוד</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-1021</td><td></td></tr><tr><td>התקני קיבוע מגנטיים (12 מ"מ)</td><td>ציוד</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטורים</td><td>ציוד</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R M3301L</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרופיפטות</td><td>ציוד</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>אוסצילוסקופ</td><td>ציוד</td><td>Tektronix, Inc.</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>ציוד</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורית סיליקון</td><td>ציוד</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>במת הדגימה</td><td>ציוד</td><td>הכנה בהתאמה אישית</td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל חפץ מוצק וקטן כדי להגביה את צלחת הקיבוע. קבע את הצלחת באמצעות חימר פיסולי.</td></tr><tr><td>מחטים בכי মাপ 18</td><td>חומרים</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי זכוכית בנפח 2 oz.</td><td>חומרים</td><td>VWR international</td><td>16152-201</td><td></td></tr><tr><td>קפילריות זכוכית</td><td>חומרים</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW150F-6</td><td></td></tr><tr><td>פקקי סיליקון גודל 16D</td><td>חומרים</td><td>כלי מעבדה כימיים</td><td>D1069809</td><td></td></tr><tr><td>חוט כסף</td><td>חומרים</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>AGW1010</td><td></td></tr><tr><td>SylGuard 184</td><td>חומרים</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td>מבית World Precision Instruments</td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>אמיל אצטט</td><td>ריאגנט</td><td>Aldrich</td><td>W504009</td><td></td></tr><tr><td>סידום כלוריד (CaCl2)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1016</td><td></td></tr><tr><td>דימטיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>הפטאלדהיד</td><td>ריאגנט</td><td>Aldrich</td><td>H2120</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl₂·6H₂O)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+6 שעות&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד (NaCl)</td><td>ריאגנט</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>מד flowmeter</td><td>ציוד</td><td>Gilmont Instruments</td><td>GF-2260</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב electroolfactogram

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

בעלי חיים תלויים olfaction להתנהגויות קריטיים רבים, כמו מציאת מקורות מזון, הימנעות מטורפים, וזיהוי conspecifics עבור הזדווגות ואינטראקציות חברתיות אחרות. ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא שיטה אינפורמטיבי, קל לנהל, ואמין לתפקד assay הריח ברמה של אפיתל הריח. מאז 1956 תיאור של EOG על ידי Ottoson ב צפרדעים 1, ההקלטה EOG יושם חוליות רבים, כולל סלמנדרות, ארנבות, חולדות, עכברים ובני אדם (נבדקה על ידי סקוט סקוט ג&#39;ונסון, 2002, נ&quot;צ. 2). ההתקדמות שינוי גנטי בעכברים לעורר עניין מחדש ההקלטה EOG לאפיון פיזיולוגיים של תפקוד חוש הריח של עקום החוצה עקום בעכברים. הקלטות EOG יושמו בהצלחה כדי להדגים את התפקיד המרכזי של חוש הריח התמרה רכיבים אות 3-8, ולאחרונה לאפיין את התרומה של מנגנוני ויסות מסוים לתגובות OSN 9-12. איתור odorant מתרחשת על פני השטח של האפיתל על חוש הריח cilia של OSNs, שם מפל הולכת אותות מוביל הפתיחה של תעלות יונים, יצירת זרם זורם לתוך cilia ו depolarizes הממברנה 13. EOG הוא פוטנציאל שלילי נרשם extracellularly על גירוי odorant על ​​פני השטח של האפיתל חוש הריח, הנובע סיכום של שינויים אפשריים שנגרמו OSNs תגובה הפרט בתחום הקלטה 2. השוואה של משרעת ו קינטיקה של EOG ובכך לספק מידע חשוב על איך הנדסה גנטית ומניפולציות ניסיוניים אחרים להשפיע על איתות המולקולריים שבבסיס התגובה OSN לריח. כאן אנו מתארים הקלטה אוויר EOG על שלב ההכנה של turbinates עכבר חוש הריח. בקצרה, לאחר להקריב את העכבר, turbinates חוש הריח נחשפים על ידי שחצתה את הראש לאורך קו האמצע והסרת מחצה. הכנה חלזוני ממוקם אז הגדרת הקלטה, אלקטרודה ההקלטה ממוקם על פני השטח של האפיתל חוש הריח על אחד turbinates המדיאלי. אלקטרודה הפניה מחובר חשמלית לרקמה באמצעות פתרון חיץ. זרם מתמיד של אוויר humidified הוא פוצץ על פני השטח של האפיתל כדי לשמור אותו לח. אדי פתרונות odorant הוא ניפח לתוך זרם של אוויר humidified כדי לעורר את האפיתל. התגובות מוקלטים דיגיטציה לניתוח נוסף.

ההקלטה (EOG) electroolfactogram היא דרך אינפורמטיבי, קל לנהל, אמין להערכת תפקוד הריח ברמה של אפיתל הריח. פרוטוקול זה מתאר הגדרת הקלטה, רקמות העכבר הכנה, איסוף נתונים, ניתוח נתונים בסיסיים.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

בעלי חיים מסתמכים על חוש הריח עבור התנהגויות קריטיות רבות, כגון מציאת מקורות מזון, הימנעות מטורפים וזיהוי בני מינם לצורך הזדווגות ו...

דגימה של אפיתל ריחוני מורכבת על צלחת ומוצבת בזרם של אוויר מלחח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, אלקטרודת ייחוס מחוברת חשמלית לרקמה באמצעות תמיסת בופר. אלקטרודת רישום ממוקמת על פני השטח של האפיתל הריחוני.האפיתולרי הריחית מעוררת על ידי נפיחות של חומרי ריח הנשלטות במחשב המועברות בזרם של אוויר לח, הנושא את חומרי הריח אל האפיתולרי הריחית. אותות EOG מועברים דרך מגבר וממיר דיגיטלי למחשב ההקלטה. שלום, אני קתרין סיאר מהמעבדה להיגיינה XO במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.היום נדגים לכם פרוצדורה להקלטת אלקטרו-אולפקטוגרמה מעכברים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את תגובותיהם של נוירונים תחושתיים ריחוניים לריחות. אז בואו נתחיל.מערכת ההקלטה מורכבת מאלקטרודת הקלטה, אלקטרודת ייחוס, צינור להולכת אוויר, במת דגימה ומיקרוסקופ לדיסקציה, כאשר כולם מעוגנים על שולחן אוויר בתוך כלוב פאראדיי. מיקרו-מניפולטורים משמשים למיקום האלקטרודות בתוך צינור הולכת האוויר. זרם אוויר רציף מועבר בבעבוע דרך מים מזוקקים להוספת לחות, לפני מעברו בצינור הולכת האוויר ומעל הדגימה.צלוחית תרבית של 60 מילימטר הממולאת בסיליקון בעובי של שישה עד שמונה מילימטרים משמשת כמשטח קיבוע לדגימה. באגן הקיבוע חללנו בתוך הסיליקון באר ותעלה, כדי לספק אמצעי לחיבור חשמלי של אלקטרודת הייחוס לדגימה באמצעות תמיסת רינגר משופרת.אלקטרודות ההקלטה והייחוס מחוברות למגבר. אותים מהמגבר נשלחים לממיר אנלוגי-דיגיטלי (digitizer) ולאחר מכן למחשב. תוכנת XI graph משמשת לשליטה בפרוטוקול הגירוי, להקלטת האות ולניתוח התגובות.אוסצילוסקופ מחובר לאחר המגבר לצורך ניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי בזמן מיקום אלקטרודת ההקלטה ובמהלך הקלטות EOG. הגשת גירויי הריח נשלטת על ידי pico spritzer, המחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת האות רגע לפני הגשת גירוי הריח.מוצא ה-pico spritzer מחובר לבקבוק ריח המכיל חומר ריח נוזלי. הבקבוק מחובר לאחר מכן לצינור הזרמת האוויר. כעת נראה כיצד להכין אלקטרודות לניסויי הקלטה.אלקטרודת ההקלטה היא תיל כסף-כלוריד בתוך קפילרה מזכוכית שנמשכה ומולאה בתמיסת רינגר משופרת. אלקטרודת הייחוס היא תיל כסף-כלוריד. התחילו בהכנת שתי האלקטרודות על ידי התקנת תיל כסף במחזיק האלקטרודה.עבור אלקטרודת ההקלטה, על חוט באורך של סנטימטר אחד עד שניים לבלוט מקצה מחזיק האלקטרודה. ניתן להשאיר חוט ארוך יותר עבור אלקטרודת הייחוס. כדי להוסיף את ציפוי כסוף הכלוריד, מקמו את החוט ב-0.1 molar sodium chloride וחברו את מחזיק האלקטרודה לקוטב החיובי של מקור מתח DC של 1.5 עד תשעה וולט.יש לחבר חשמלית את הקוטב השלילי של מקור המתח לתמיסת נתרן כלורי בריכוז 0.1 molar. יש להמתין 10 דקות להמשך התגובה של הכלוריד כדי להשוות את כל מטען הסטטי שבין אלקטרודת הרישום לאלקטרודת הייחוס. יש להשחית את האלקטרודות זו בזו לזמן קצר לפני התקנתן על מכשיר הרישום.בשלב הבא, משכו קפילרה מזכוכית באמצעות מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות. פתח קצה הקפילרה צריך להיות בקוטר של כ-5 עד 10 מיקרון. השתמשו בעיפרון יהלום כדי לסמן ולשבור את הקצה התעומת של הקפילרה, כך שתהיה ארוכה בכשני סנטימטרים מחוט הכסף.השתמשו בלהבת בוטאן כדי לבצע ליטוש באש לקצה החתוך, ולאחר מכן המסו 0.5% agros בתמיסת רינגר משופרת. השתמשו בפיפטת העברה כדי למשוך כמות קטנה של תמיסת agro מותכת אל קצה האלקטרודה, באמצעות מזרק שחומם ונמשך כדי ליצור קצה דק וארוך. מלאו את הקפילרה הנמשכת עד למחצית מגובהה.בעזרת תמיסת ריינגר משונה, הקש בעדינות על הקפילרה כדי להוציא בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה המלאה בצנצנת אחסון המכילה כמות קטנה של תמיסת ריינגר משונה בתחתיתה עד למועד השימוש. לאחר שדגימת הרקמה הוכנה והיא מוכנה להקלטה, התקן קפילרה מלאה מעל חוט אלקטרודת ההקלטה עם האלקטרודות המוכנות.בואו נבחן ניסוי הקלטה כדי להתחיל בהכנת רקמה להקלטה. הסירו את העור המכסה את גולגולתו של עכבר שהוקרב וחצו את הראש לשניים לאורכה לאורך קו האמצע; מקמו מחצית אחת של הראש, כאשר הצד המדיאלי פונה כלפי מעלה, על צלחת הקיבוע. הסירו בזהירות את המחיצה כדי לחשוף את הטורבינאטים.הנח את הצלחת עם הרקמה המקובעת על במת ההקלטה. כוונן את הבמה כך שמיקום ההקלטה על הקונכיות יהיה ממורכז תחת המיקרוסקופ. כעת פתח את מיכל האוויר כדי להזרים אוויר מלחח בקצב של כ-600 milliliters per minute אל פני השטח של הקונכיות.מקמו את צינור הזרמת האוויר כך שיהיה במרחק של כ-10 millimeters ממיקום ההקלטה. הגדירו את המגבר למצב DC, שכן הגברה במצב AC תגרום לארטיפקטים באות ה-EOG. בצעו רכישת נתונים עם מסנן מעביר נמוכים (low pass filter) של one kilohertz והגבר של 100 x.כעת התקינו את אלקטרודות ההקלטה והייחוס על המיקרו-מניפולטורים. הורידו את אלקטרודת הייחוס אל תוך הבאר שבצלוחית ההרכבה וכסו אותה בתמיסת רינגר משופרת כך שתהיה מחוברת חשמלית לרקמה. הורידו בזהירות את אלקטרודת ההקלטה אל פני השטח של turbinate 2B או 3.האלקטרודה צריכה לגעת קלות במשטח של אפיתל הריח. כאשר האלקטרודה תיכנס במגע עם האפיתל, תופיע קו בסיס ישר באוסצילוסקופ. כעת, חברו בקבוק עם חומר ריח לפתח הצדדי בצינור הזרמת האוויר במחשב.התחל פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה עבור רכישת הנתונים צריך להיות 2 kHz או גבוה יותר. התוכנה תפעיל פולס של ריח ותתחיל בהקלטה.פרוטוקול גרייה טיפוסי עשוי לכלול פולס בודד מוצמד במשך 100 מילישניות, פולסים של 100 מילישניות המופרדים במרווח של שנייה אחת, או פולס רציף של עשר שניות. כדי למזער אדפטציה, המתינו בין דקה לחמש דקות בין הפרוטוקולים לאחר מתן ריכוזי ריח גבוהים. ריח שיורי עלול להישאר בצינור; שטפו את צינור האוויר עם 95% ethanol וייבשו אותו לפני המשך העבודה עם דגימות רקמה נוספות.תוכנת Axo graft מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של אות ה-EOG. פרמטרים אלו כוללים את אמפליטודת התגובה, זמן השהיה (latency), הזמן עד לשיא וקבועי זמן של סיום. מספר פרמטרים של ה-EOG שימושיים במיוחד להשוואת תגובות מנורמלות בין עכברים, כולל אמפליטודת התגובה, זמן העלייה של השהיה, הזמן עד לשיא וקבוע זמן של סיום.מוצגים כאן OGs מעכבר בתגובה לגירוי בריכוזים עולים של amyl acetate נוזלי. הקו השחור בחלק העליון מציין את התזמון ואת משך גירוי הריח. כאן אנו רואים קשר של תגובה למינון הממוצע מחמישה עכברים; פסי השגיאה מייצגים רווחי סמך של 95%.ירידה באמפליטודת השיא נצפית לעיתים קרובות בריכוזי ריח גבוהים מאוד. דוגמה ל-EOG בתגובה לגירוי של פולס זוגי מוצגת; פולס קצר בודד של חומר ריח מעורר אדפטציה הנמשכת מספר שניות. מוצג כאן EOG בתגובה ל-10 שניות של גירוי מתמשך של חומר ריח.ה-EOG מראה דסנסיטיזציה במהלך הצגה רציפה של חומר ריח. הרגע הדגמנו כיצד להקליט את האלקטרודפקטרוגרמה מעכברים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להניח את האלקטרודה בדיוק על פני השטח של האפיתליום ולא להחדיר את האלקטרודה מתחת לפני השטח.יש להקליט תמיד מאותו צד של הראש ולהימנע משינויים במערך הניסוי כדי לצמצם שונות; שמרו על הרקמה לחה, אך ללא הצטברות של טיפות נוזל. הנחת הרקמה תחת זרימת אוויר לח מיד לאחר הניתוח תשמור על הרקמה במצב מיטבי להקלטה. זהו כל הפרוטוקול. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

analyzing-responses-mouse-olfactory-sensory-neurons-using-air-phase

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מערך Multielectrode (MEA) הקלטות לספק שיטה ללימוד את הפעילות החשמלית של אוכלוסיות גדולות של נוירונים. כאן, אנו מציגים את הפרטים של הכנה MEA להקליט האפיתל עכבר vomeronasal ובמקביל מגרה את הרקמות.

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

מערכות חוש הריח חרקים לספק הזדמנויות ייחודיות עבור odorant-Induced התגובות הקלטה בצורות של electroantennograms (EAG) והקלטות sensillum יחיד (SSR), אשר סיכם תגובות מכל קולטן נוירונים odorant (ORNs) הממוקם על האנטנה ועל מאלה שוכנו הפרט sensilla, בהתאמה.

מדידות אלקטרו ממערכת עש חוש הריח

מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של אותות אופטיים flavoproteins מהותי autofluorescence הדמיה אותות ריח עורר פעילויות המפה על פני השטח של הנורה חוש הריח אצל עכברים.

פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence

נוירונים קולטניים ריח (ORNs) להמיר אותות ריח ראשון לתוך קולט נוכחיים מעורר בתור פוטנציאל פעולה שמועברים לנוירונים מסדר השנייה בנורת חוש הריח. כאן אנו מתארים את טכניקת יניקת פיפטה כדי להקליט את הקולטן odorant מושרה פוטנציאלי פעולה הנוכחי ומORNs העכבר בו זמנית.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

לזבובי פירות יש מערכת ריח מורכבת, הם יכולים להבחין במאות ריחות ולהשתמש בחוש הריח שלהם כדי לכוון החלטות התנהגותיות. סרטון זה מתאר את בדיקת האולפקטומטר הארבע-כיוונית, שיטה לחקר תגובות התנהגותיות של חוש הריח בזבובים. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטפל בזבובי בדיקה ומהם השלבים הקריטיים בעת ביצוע הבדיקה.

בדיקת אולפקטומטר ארבע-כיוונית: שיטה להערכת תגובות מרומזות ריח בדרוזופילה

סרטון זה מדגים הקלטה אלקטרופיזיולוגית של נוירונים חושי ריח (OSNs) בעכברים באמצעות טכניקת מהדק טלאי מחורר. אפיתל הריח, המכיל OSN עם קולטני ריח מתויגים פלואורופור, מבודד מעכבר ומאובטח בתא הקלטה. פיפטת הקלטה מהודקת לידית הדנדריטית של OSN, וניסטטין בתוך הפיפטה מנקב את הממברנה כדי ליצור קישוריות חשמלית עם התא. לבסוף, פיפטה נוספת משמשת להעברת ממריץ ריח, והפעילות האלקטרופיזיולוגית של התא המתוקן נרשמת.

רישום טלאי מהדק מחורר של נוירונים חושי ריח בעכברים

אנחנו מדגימים וריאציות של טכניקה רבת יחידת ההקלטה התאית לאפיין תגובות ריח מעורר בשלושת השלבים הראשונים של מסלול ההרחה חסר חוליות. טכניקות אלה יכולים בקלות להיות מותאמות לבחינת פעילות הרכב במערכות עצביות אחרות גם כן.

שיטות הקלטה בעל מספר יחידות לאפיין את הפעילות עצבית בארבה (<em&gt; Schistocerca אמריקנה</em&gt;) מעגלי ריח

ניתוח התכונות הפיזיולוגיות של נוירונים חושי ריח עדיין מתמודד עם מגבלות טכניות. כאן אנו מתעדים אותם באמצעות מהדק טלאי מחורר בהכנה שלמה של אפיתל הריח בעכברים ממוקדי גנים. טכניקה זו מאפשרת לאפיין את תכונות הממברנה ותגובות לליגנדים ספציפיים של נוירונים המבטאים קולטני ריח מוגדרים.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

אנו מתארים כאן הגדרה התנהגותית ושיטת ניתוח נתונים לבדיקת תגובות הריח של עד 100 זבובי חומץ (Drosophila melanogaster). ניתן להשתמש במערכת זו עם גירוי ריח יחיד או מרובה, וניתנת להתאמה להפעלה אופטוגנטית או להשתקה של תת-קבוצות עצביות.

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח היא שיטה רגישה, איתנה ותו לאופתית להערכת רגישות חוש הריח בדגים ימיים. הוא מתעד קלט חושי ראשי והוא אינו תלוי במליתיות חיצונית.

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט

פרוטוקול זה מתאר בניית אולפקטומטר לניסויי התנהגות חוש הריח. הוראות שלב אחר שלב, יחד עם תמונות, ניתנות על מנת להבטיח בנייה מוצלחת של האולפקטומטר. מידע לפתרון בעיות שנתקלו בהן במהלך התהליך כלול גם כן.

בניית אולפקטומטר לחקר התנהגות חוש הריח של מכרסמים

למדו לתעד תגובות חשמליות של נוירונים חוש ריח בעכברים באמצעות שיטת האלקטרואולפקטוגרם. פרוטוקול זה מספק כלי אמין לחקר תפקוד הריח ברמת האפיתל הריחני.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

גלה סרטונים נוספים