ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

תכשיר של אפיתל ריח מותקן על צלחת ומונח לזרם אוויר לח. תחת מיקרוסקופ מנתח, אלקטרודת ייחוס מחוברת חשמלית לרקמה באמצעות תמיסת חיץ. אלקטרודת הקלטה מונחת על פני אפיתל הריח.

אפיתל הריח מגורה על ידי נשיפות ריח מבוקרות מחשב הניתנות לזרם של אוויר לח, הנושא את הריחות לאפיתל הריח. אותות EOG מועברים דרך מגבר ודיגיטייזר למחשב ההקלטה. היי, אני קתרין סיאר מהמעבדה להיגיינה XO במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

היום נראה לך נוהל לרישום הגרם האלקטרו אולף מעכברים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את התגובות של נוירונים חושי ריח לריחות. אז בואו נתחיל.

מנגנון ההקלטה מורכב מאלקטרודה הקלטה, אלקטרודה ייחוס, צינור העברת אוויר, שלב דגימה ומיקרוסקופ ניתוח, כולם מעוגנים על שולחן אוויר בתוך כלוב פאראדיי. מניפולטורים של מיקרום משמשים למיקום האלקטרודות בצינור אספקת האוויר. זרם אוויר רציף מבעבע דרך מים מזוקקים כדי להוסיף לחות לפני שהוא עובר דרך צינור אספקת האוויר ומעל הדגימה.

צלחת תרבית בגודל 60 מילימטר מלאה בסארד להתאמה של שישה עד שמונה מילימטרים משמשת כמשטח הרכבה לדגימה. באר ותעלה חלולים מהמגן בצלחת ההרכבה. לספק אמצעי לחיבור חשמלי של אלקטרודת הייחוס לדגימה באמצעות תמיסת צלצול שונה.

אלקטרודות ההקלטה והייחוס מחוברות למגבר. אותות מהמגבר נשלחים לדיגיטייזר ולאחר מכן למחשב. תוכנת גרף XI משמשת לשליטה בפרוטוקול הגירוי, הקלטת האות וניתוח התגובות.

אוסצילוסקופ מחובר לאחר המגבר לניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי תוך הצבת אלקטרודת ההקלטה. ובמהלך הקלטות EOG. אספקת גירוי הריח נשלטת על ידי פיקו שפריצר, המחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת אותות רגע לפני מתן גירוי ריח.

תפוקת הפיקו שפריצר מחוברת לבקבוק ריח המכיל ריח נוזלי. לאחר מכן הבקבוק מחובר לצינור אספקת האוויר. עכשיו בואו נראה כיצד להכין אלקטרודות להקלטת ניסויים.

אלקטרודת ההקלטה היא חוט כסף כלוריד בנימי זכוכית משוכים במילוי תמיסת צלצול שונה. אלקטרודת הייחוס היא חוט כסף כלוריד. התחל להכין את שתי האלקטרודות על ידי התקנת חוט כסף לתוך מחזיק האלקטרודה.

עבור אלקטרודת ההקלטה, סנטימטר עד שני סנטימטרים של חוט צריכים לבלוט מקצה מחזיק האלקטרודה. ניתן להשאיר חוט נוסף לאלקטרודה הייחוס. כדי להוסיף את ציפוי כלוריד הכסף, מקם את החוט בנתרן כלורי מולרי של 0.1 וחבר את מחזיק האלקטרודה למסוף החיובי של מקור מתח DC של 1.5 עד תשעה וולט.

יש לחבר את המסוף השלילי של מקור החשמל חשמלית לתמיסת נתרן כלוריד 0.1 מולארי. אפשר לכלוריד בתגובה להמשיך במשך 10 דקות כדי להשוות כל מטען סטטי בין ההקלטה לאלקטרודת הייחוס. גע בקצרה באלקטרודות זו בזו לפני התקנתן על מכשיר ההקלטה.

לאחר מכן, משוך נימי זכוכית באמצעות חולץ מיקרו פיפטה. הפתח בקצה הנימים צריך להיות בקוטר של כחמישה עד 10 מיקרון. השתמש בעיפרון יהלום כדי לקלוע ולנתק את הקצה הקהה של הנימים כך שהוא ארוך בכשני סנטימטרים מחוט הכסף.

השתמש בלפיד בוטאן כדי ללטש את הקצה החתוך כעת להמיס 0.5% אגרוס בתמיסת צלצול שונה. השתמש בפיפטה העברה כדי למשוך כמות קטנה של תמיסת אגרו מותכת לקצה האלקטרודה באמצעות מזרק שחומם ונמשך לקבלת קצה דק וארוך. מלאו את הנימים הנמשכים כמחצית הדרך.

עם תמיסת צלצול שונה, החלק בעדינות את הנימים כדי לעקור בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה המלאה בצנצנת האחסון עם כמות קטנה של תמיסת רינגר שונה בתחתית עד שהיא מוכנה לשימוש. לאחר שדגימת רקמה מוכנה ומוכנה להקלטה, התקן נימי מילוי מעל חוט האלקטרודה של ההקלטה כשהאלקטרודות מוכנות.

בואו נסתכל על ניסוי הקלטה כדי להתחיל להכין רקמות להקלטה. הסר את העור המכסה את הגולגולת של עכבר שהוקרב, וחצה את הראש לאורך קו האמצע, תושבת מחצית מהצד המדיאלי של הראש כלפי מעלה על צלחת ההרכבה. הסר בזהירות את המחיצה כדי לחשוף את הטורבינות.

הניחו את הכלי עם רקמה רכובה על שלב ההקלטה. יישר את ה-stage כך שמיקום ההקלטה על הטורבינות יהיה מרוכז מתחת למיקרוסקופ. כעת הפעל את מיכל האוויר כדי לספק אוויר לח בסביבות 600 מיליליטר לדקה למשטח הטורבינה.

מקם את צינור אספקת האוויר כך שיהיה במרחק של כ-10 מילימטרים ממיקום ההקלטה. הגדר את המגבר למצב DC מכיוון שהגברת AC תגרום לחפצים באות ה-EOG. רכוש עם מסנן מעבר נמוך של קילו-הרץ אחד ורווח של 100 x.

כעת הרכיב את אלקטרודות ההקלטה והייחוס על המניפולטורים המיקרו. הורד את אלקטרודת הייחוס לבאר על צלחת ההרכבה וכסה אותה בתמיסת צלצול שונה כך שהיא מחוברת חשמלית לרקמה. הורד בזהירות את אלקטרודת ההקלטה על פני הטורבינה, שתיים B או שלוש.

האלקטרודה בקושי צריכה לגעת במשטח אפיתל הריח. כאשר האלקטרודה באה במגע עם האפיתל, יופיע קו בסיס ישר על האוסילוסקופ. כעת, חבר בקבוק ריח ליציאת הצד בצינור אספקת האוויר במחשב.

התחל פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה לרכישת נתונים צריך להיות שני קילו-הרץ ומעלה. התוכנה תפעיל דופק ריח ותתחיל להקליט.

פרוטוקול גירוי טיפוסי עשוי להיות משך של 100 אלפיות השנייה, פולסים בודדים מזווגים, פולסים של 100 אלפיות שנייה המופרדים על ידי מרווח של שנייה אחת או דופק מתמשך של עשר שניות. כדי למזער את ההסתגלות, אפשר בין דקה לחמש דקות בין פרוטוקולים לאחר מתן ריכוזי ריח גבוהים. ריח שיורי עלול להישאר בצינור, לשטוף את צינור האוויר עם אתנול 95% ולייבש לפני שתמשיך עם דגימות רקמה נוספות.

תוכנת השתלת Axo מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של אות ה-EOG. פרמטרים כאלה כוללים את משרעת התגובה, חביון, זמן לשיא וקבועי זמן של סיום. מספר פרמטרים של ה-EOG שימושיים במיוחד להשוואה של תגובות מנורמלות בין עכברים, כולל משרעת התגובה, זמן עליית ההשהיה, זמן השיא וקבוע הזמן של הסיום.

מוצגים כאן OGs מעכבר בתגובה לגירוי עם ריכוזים הולכים וגדלים של אמיל אצטט נוזלי. הקו השחור בחלק העליון מציין את העיתוי ומשך גירוי הריח. כאן אנו רואים יחס תגובת מינון ממוצע מחמישה פסי שגיאה של עכברים הם מרווחי סמך של 95%.

ירידה במשרעת השיא נצפית לעתים קרובות בריכוזי ריח גבוהים מאוד. דוגמה ל-EOG בתגובה לגירוי דופק מזווג מוצגת פעימה קצרה אחת של ריח מעוררת הסתגלות הנמשכת מספר שניות. מוצג כאן EOG בתגובה ל-10 שניות של גירוי ריח מתמשך.

ה-EOG מראה דה-סנסיטיזציה במהלך הצגת ריח מתמשכת. זה עתה הראינו לך כיצד לרשום את גורם האלקטרודה גרם מעכברים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למקם את האלקטרודה רק על פני האפיתל ולא לחדור לאלקטרודה מתחת לפני השטח.

הקלט תמיד מאותו צד של הראש והימנע משינויים בהגדרה כדי למזער את השונות, לשמור על הרקמה לחה, אך מבלי לאסוף טיפות נוזליות, הנחת הרקמה מתחת לאוויר הלח מיד לאחר הדיסקציה תשמור על הרקמה במצב הטוב ביותר להקלטה. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.