Name: לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: למדו לבודד נוירונים היקפיים מזבובי Drosophila בשלבי פגית שלישיים באמצעות לייזר Microdissection. שיטה זו מאפשרת בידוד RNA באיכות גבוהה לניתוח ביטוי גנים ב-qRT-PCR ומיקרו-אריי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. Yuh-Nung יאן ווס Grueber למתן מניות לטוס השתמשו במחקר זה, ווירג&#39;יניה Espina, ד&quot;ר עמנואל Petricoin ד&quot;ר לאנס ליוטה לסיוע עם LCM. המחברים להכיר תומס פ קייט מילר Jeffress הזיכרון אמון על התמיכה של מחקר זה (DNC) ואת אוניברסיטת ג&#39;ורג&#39; מייסון מכללה משרד s (EPRI).

<ol><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136, 1049-1061 (2009).</li>
<li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+that+regulate+establishment%2C+maintenance%2C+and+remodeling+of+dendritic+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li>
<li>Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+populations+from+Drosophila+tissues+by+magnetic+bead+sorting%2C+for+use+in+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling.</a> Nature Protocols. , (2008).</li>
<li>Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+Drosophila+peripheral+neurons+by+magnetic+bead+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting.</a> J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29+of+Drosophila+hemocytes+reveals+important+functional+similarities+to+mammalian+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).</li>
<li>Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+germline+cells+from+Drosophila+embryos+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry.</a> Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).</li>
<li>Reeves, N., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+programs+activated+by+proneural+proteins+in+the+developing+Drosophila+PNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS.</a> Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).</li>
<li>Jinushi-Nakao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+Cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56, 963-978 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mRNA+from+specific+tissues+of+Drosophila+by+mRNA+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging.</a> Nucl. Acids Res. 33, (2005).</li>
<li>Appay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Gene+Expression+Profiling+of+Human+T+Cell+Subsets+Reveals+Parallel+Post-Thymic+Differentiation+for+CD4%2B+and+CD8%2B+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages.</a> J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).</li>
<li>Ginzinger, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+quantification+using+real-time+quantitative+PCR%3A+An+emerging+technology+hits+the+mainstream%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream.</a> Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).</li>
<li>Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+single-cell+RT-PCR+without+RNA+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification.</a> J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).</li>
<li>Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RT-PCR+gene+expression+profiling+of+acutely+dissociated+and+immunocytochemically+identified+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons.</a> J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+in+embryonic+mouse+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling in embryonic mouse lenses.</a> Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).</li>
<li>Scharschmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+osteoarthritic+connective+tissue+by+laser+capture+microdissection+and+QRT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Connect.+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR.</a> Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).</li>
<li>Spletter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulates+Drosophila+olfactory+projection+neuron+identity+and+targeting+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity.</a> Neural Dev. 2, 14-14 (2007).</li>
<li>Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+Drosophila+neuronal+remodeling%3A+a+role+for+the+RNA-binding+protein+Boule+as+a+negative+regulator+of+axon+pruning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning.</a> J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+multidendritic+sensory+neurons+are+necessary+for+rhythmic+locomotion+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).</li>
<li>Espina, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Prot%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול המוצגת כאן מתארת ​​את שיטת אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית הפריפריה באמצעות LCM. אמנם זה פרוטוקול LCM תוכנן עבור בידוד הספציפי של יחיד, מחלקה ספציפית או מספר הנוירונים תסיסנית דה משלב instar third הזחל של פיתוח, שינויים קלים של פרוטוקול יכול בקלות להיות מותאמים עבור לכידתו של סוגים אחרים תסיסנית תא מכל התפתחותי בשלבים באמצעות GAL4 ברורים, כטב&quot;מ-mCD8-GFP transgenes הכתב אשר התווית את סוג התא או סוגים של עניין. התוצאות של...

ציוד: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryostat </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 צינור חרוטי מ&quot;ל עבור קיבעון שקופיות, שטיפה, טיפול טריפסין ואתנול / התייבשות קסילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -80 ° C במקפיא </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגרה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PixCell כלי IIE LCM עם פלואוריד 300 אופטיקה epifluorescence אופטימיזציה עבור EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices) </li></ul>

לייזר microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

דנדריטים (דה) arborization נוירונים במערכת העצבים ההיקפית תסיסנית (PNS) לספק מערכת מודל מצוינת בה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס בכיתה ספציפית המורפוגנזה 1,2 דנדריט. כדי להקל על ניתוח מולקולרי של מחלקה ספציפית דה נוירון פיתוח, חיוני להשיג תאים אלה באוכלוסייה טהור. למרות מגוון רחב של תאים שונים, ספציפיים רקמות טכניקות בידוד RNA קיימים תאים תסיסנית, כולל טיהור תא חרוז מגנטי מבוסס 3,4, תא פלורסנט מיון פעיל (FACS) 5-8, ו - RNA חלבון מחייב מבוסס אסטרטגיות 9, אף אחד שיטות אלה יכול להיות מנוצל בקלות לבידוד בודדות או מרובות בכיתה ספציפית תסיסנית נוירונים דה עם רמה גבוהה של דיוק מרחבית. Microdissection לייזר לכידת (LCM) התפתחה ככלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי לבודד את סוגי תאים מסוימים ממקטעים רקמה עם רמה גבוהה של דיוק ברזולוציה מרחבית. RNA בתאים מבודדים המתקבל לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ניתוחים כולל qRT-PCR ו פרופיל microarray ביטוי בתוך סוג תא נתון 10-16. עד כה, LCM לא הוחל נרחב בניתוח של רקמות ותאים תסיסנית 17,18, כולל נוירונים דה בשלב instar third הזחל של התפתחות. כאן אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה שלנו הבידוד של נוירונים תסיסנית דה באמצעות מעמד אינפרא אדום (IR) של LCM. שיטה זו מאפשרת ללכוד של, נוירונים בודדים דה בכיתה ספציפית או מספר עם סגוליות גבוהה ברזולוציה מרחבית. גיל בהתאמה third הזחלים instar להביע כטב&quot;מ-mCD8: 19-GFP transgene בשליטת גם את הרביעי בכיתה דה נוירון ספציפי פ.פ.ק.-20 GAL4 הנהג או פאן דה נוירון ספציפי 21-7 21-GAL4 הנהג שימשו אלה ניסויים. RNA המתקבלים נוירונים בודדים דה הוא באיכות גבוהה מאוד וניתן להשתמש בו ישירות ליישומים במורד הזרם, כולל qRT-PCR או microarray מנתח. יתר על כן, פרוטוקול זה LCM ניתן להתאים בקלות ללכוד סוגים אחרים תסיסנית תא בשלבים שונים של פיתוח תלויים בסוג תא מסוים, GAL4 מונחה דפוס הביטוי של ה-GFP.

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או מרובים<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירונים דה מן הזחלים instar third באמצעות לכידת אינפרא אדום (IR) מעמד של Microdissection לכידת לייזר (LCM). RNA המתקבלים נוירונים בודדים יכולים לשמש בקלות עבור יישומים במורד הזרם כולל qRT-PCR או microarray מנתח.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

הנוירונים של העץ הדנדריטי (da) במערכת העצבים הפריפריאלית (PNS) של ה-Drosophila מהווים מערכת מודל מצוינת לחקר ה...

מיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (Laser capture MICRODISSECTION או LCM) הפכה לכלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לבודד סוגים ספציפיים של תאים מנתחי רקמה ברמת רזולוציה מרחבית ודיוק גבוהים. כאן נעשה שימוש ב-LCM כדי לבצע דיסקציה של נוירונים פריפריים מפסאות של זחלי oph בשלב השלישי (third instar). זחלים בשלב השלישי מוטמעים בתבנית קריו, מוקפאים, ולאחר מכן נעשה שימוש בסטטוס קריו כדי לחתוך נתחי רקמה סדרתיים, אשר מונחים על למסח דבק, מופשרים ומקובעים ב-70% ethanol.לאחר מכן מדגריים את השקופיות עם tripsin כדי להסיר שאריות של קוטיקולת הזחלים, ומבצעים דהידרטציה באמצעות מדרג של ethanol ובירוח באמצעות xylene. לאחר מכן, מניחים כיסיית LCM על חיתוך הרקמה, ותאים של נוירונים פלואורסצנטיים נבחרים נלכדים באמצעות לייזר פועם. לבסוף, מבודד RNA מהתאים שנלכדו עבור יישומים המשכיים כגון quantitative R-T-P-C-R או ניתוחי microarray.שלום, אני דן קוקס מהמחלקה למיקרוביולוגיה ומולקולרית וממכון קראסנו למחקר מתקדם באוניברסיטת ג'ורג' מייסון. שלום, אני איש AER מהמעבדה של ד"ר דן קוקס. היום נראה לכם הליך לבידוד תאים וטיהור RNA של נוירונים פריפריאליים בודדים או מרובים של drosophila באמצעות מיקרו-דיסקציה בלייזר (laser capture microdissection).אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתווכים את המורפוגנזה של קצב ה-DIN הספציפי למחלקה. אז בואו נתחיל. כל ההליכים המוצגים בסרטון זה מבוצעים בתנאים סטריליים ללא RNase, בהתאם לנהלים סטנדרטיים.התחילו את הפרוטוקול על ידי איסוף של 30 עד 40 זחלי גומרה (*Manduca sexta*) מבוגרים בשלב השלטה השלישי. שטפו את הזחלים במים מזוקקים פעמיים.שטפו קצרה ב-RNAs away, ולאחר מכן שטפו פעם אחת נוספת במים מזוקקים פעמיים. כדי להסיר את ה-RNAs away, השתמשו ב-Kim wipe נקי כדי לספוג לחלוטין את שאריות המים. לאחר מכן, קחו תבנית להטמעה ברקמה נקייה והוסיפו שכבה דקה של OCT.הניחו את התבנית על גוש קרח כדי לקירר אותה לאפס מעלות צלזיוס. באמצעות פינצטה, הניחו את הזחלים הנקיים ואת ה-OCT הקר. הטמפרטורה הנמוכה של ה-OCT תסייע בהפחתת תנועת הזחלים.במהלך תהליך ההטמעה, סדרו את הזחלים במקביל זה לזה. לאחר שסידרתם את הזחלים, מלאו לאט את התבנית ב-OCT מבלי להסיחם ממקומם. לאחר מכן, בצעו הקפאה מהירה.הקפיאו את התבנית על ידי הנחתה על קרח יבש. פעולה זו תבטיח שהזחלים יסודרו במישור אחד, דבר שימקסם את מספר התאים הזמינים בכל חיתוך. השתמשו בקריוסטט.בצעו חיתוכים של דגימות קפואות בעובי של 5 עד 8 מיקרומטר על גבי שקופיות זכוכית למיקרוסקופ שאינן טעונות, נקיות מ-RNA ומסומנות. אחסנו את השקופיות על קרח יבש, ולאחר מכן העבירו אותן לטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד המיקרו-דיסקציה. יש להכין את כל תמיסות ההתייבשות באופן טרי לפני כל סשן של LCM.התייבשות מלאה של חתכי רקמה קפואים של זחלים חיונית להשגת יעילות מיקרו-דיסקציה אופטימלית. הוצא את השקופיות המכילות את חתכי הרקמה הקפואים של הזחלים מהמקפיא בטמפרטורה של 80- °C והנח אותן על קרח יבש. הוצא שקופית אחת מקופסת השקופיות והנח אותה מיד בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters המולאה ב-70% ethanol למשך שלוש עד 10 שניות.לאחר מכן, שטפו את השקופית בתוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר המולא במים מזוקקים פעמיים נקיים מ-RNase למשך חמישה עד 10 שניות, כדי להסיר את העשב (cuticle) מחתכי הרקמה, אשר עלול להפריע ללכידת ה-LCM. העבירו בעדינות באמצעות פיפט 50 מיקרוליטר של 2.5% trypsin ישירות על חתך הרקמה והדרימו למשך חמישה עד 30 שניות בטמפרטורת החדר; שטפו את החתכים קצרה במבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה מים מזוקקים פעמיים נקיים מ-RNase כדי להסיר את ה-trypsin וכל שיירי עשב שאינם קשורים היטב. השלימו את תהליך הדהידרציה על ידי טבילה רצופית של השקופיות בתמיסות הבאות.70%ethanol, 95%ethanol, 100%ethanol, 100%ethanol, 100%xylene. ולבסוף, פעם נוספת ב-100%xylene. לאחר ההוצאת מים, ייבשו את השקיפות לחלוטין תחת זרם אוויר קל למשך 60 עד 120 שניות בטמפרטורת החדר.במידת האפשר, בצעו את המיקרו-דיסקציה בחדר עם בקרת לחות, כדי למנוע כל פגיעה ביעילות עקב לחות מוגברת. ראשית, הפעילו את אספקת הכוח למיקרוסקופ ולאות הבקרה של הלייזר. טענו את תושבת המכסות שלכם במכסות H-S-L-C-M.כל מכסה מסוגל ללכוד גופי תא רבים. לאחר מכן, פתחו את התוכנה של המכשירים המולקולריים והזינו את פרטי הניסוי, כולל את מספר השקופית ומספר מנת המכסים. הניחו את השקופית עם חיתוכי רקמת הזחלים על במה המיקרוסקופ לצורך ביצוע מיקרו-דיסקציה.טענו מכסה HS LCM חדש מהמחסנית אל מכשיר ה-P cell two ELCM ומקמו אותו כראוי ביחס לג'ויסטיק כדי להבטיח מיקום נכון של המכסה ביחס לאזור הלכידה; אתרו את התאים המסומנים פלואורסצנטית בקווי הדיווח התראנסגניים PPK GAL four U-A-S-M-C-D eight GFP או 21 7 G four UASM CD eight GFP. ניתן לזהות בקלות את נוירוני ה-dendritic, arborization, או DA של מערכת העצבים ההיקפית באמצעות פלואורסצנציית GFP. כדי למקסם את הסגוליות, בחרו תאים בעלי אות פלואורסצנטי חזק וחפיפה מינימלית בין התאים.בשלב הבא, התאימו את פרמטרי ההספק ומשך פעימת הלייזר כדי להשיג נקודת המסה מדויקת של הפולימר, שגודלה תואם לגודל נקודת הלייזר שנבחרה למיקרו-דיסקציה של נוירונים מסוג DA של מחלקה אחת. ההגדרות הבאות מומלצות: קוטר נקודה 7.5 micrometers, עוצמת לייזר 30 to 50 milliwatts, זמן לייזר 2 to 4 milliseconds ו-1 to 2 פעימות לתא.הגדרות הלייזר עשויות להשתנות בהתאם לסוג הרקמה, עובי הרקמה וסוג מכסה ה-LCM שבו נעשה שימוש. בסופו של דבר, הגדרות הלייזר דורשות בדיקה אמפירית כדי להשיג תוצאות לכידה אופטימליות. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לתהליך LCM.במהלך LCM, המכסה מונח מעל האזור המבוקש ולייזר אינפרא-אדום בעוצמה נמוכה פועל. פולס מופנה דרך המכסה אל סרט דק של פולימר תרמולב מעל התא או התאים המבוקשים. כאשר הלייזר פועל בפולסים, הסרט מתרכך, נצמד לתאי המטרה ומתגבש מחדש כאשר התאים המבוקשים דבקים בו.כאשר מרימים את המכסה מ SECTION של הרקמה, התא או התאים עוברים מיקרו-דיסקציה מהרקמה שמסביב כדי לדגום תאים נוספים לשדה חדש ולחזור על התהליך. לאחר שנדגמו התאים הרצויים, הרימו את מכסה ה-LCM והניחו אותו על שקף נקי כדי לאשר את נוכחות התאים שנדגמו ואת היעדרם של תאים בלתי רצויים או פסדתיים. דגמו תמונה של מכסה ה-HS LCM באמצעות תאורה פלואורסצנטית ותאורה שעברה דרך הדגימה.חברו את המכסה המכיל את התאים שעברו מיקרו-דיסקציה למכשיר המיצוי שלכם. לאחר מכן, הוסיפו 12 µL של בופר להפקת RNA למשטח המכסה וחברו מבחנה עם דפנות דקות במצב הפוך כפי שמוצג כאן. הניחו את המכלול על מגש יישור וכסו אותו בבלוק דגירה שחומם מראש.לאחר מכן, הכניסו את המגש לאינקובטור בטמפרטורה של 42 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה. צנטריפוגו את המבחנות המכילות את התמציות ב-800 ×g למשך שתי דקות. לאחר הוצאת המבחנות מהצנטריפוגה, סגרו אותן ואחסנו את תמציות התאים בטמפרטורה של 80 °C- עד למועד טיהור תמצית ה-RNA וביצוע טיהור ה-RNA בעזרת עמודה.בהתאם להוראות ערכת pico pure RNA extraction, הטיפול ב-DNA הוא רשות וניתן לבצעו בעמודה במהלך טיהור ה-RNA לפי הצורך. לאחר שה-RNA טוהרה, יש לאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. נעשה שימוש במיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (Laser capture microdissection) כדי לבודד נוירוני DA בודדים ספציפיים לסוג מסוים או נוירוני DA מרובים של drosophila מזחלי גיל שלישי.LCM מאפשר רמה גבוהה של דיוק וספציפיות בבידוד של גופי תאים של נוירוני D בזבוב הפירות (drosophila). מוצגת כאן תמונה מייצגת של חיתוך רקמה בעובי שמונה מיקרון שעבר דהידרטציה וטיפול בטריפסין. לפני ביצוע ה-LCM, שני נוירוני DA מסוג class four סומנו באמצעות GFP.חץ התכוון לנוירון המודגש ללכידה. גוף התא של הנוירון המודגש מבודל במיקרו-דיסקציה נקייה ובסגוליות גבוהה מתוך נתח הרקמה. התמונה מציגה מבט מקרוב של נוירון DA בודד מסוג class four שנלכד על מכסה ה-LCM.נמצא כי איכות ה-RNA הכולל שטוהר מנוירוני ה-DA שהבודדו הייתה מצוינת, כפי שהתבטאו בשיאים חדים של RNA ריבוזומלי 5.8 S ו-28 S בניתוח באמצעות Agilent 2100 bioanalyzer. בוצע RT-PCR כמותי בזמן אמת של המרקר הגנתי הספציפי לנוירונים, Lev, כדי להעריך את ההעשרה הספציפית-נוירונלית של התאים המבודדים באמצעות שיטת ה-delta delta CT. נצפתה העשרה של יותר מ-2.5 เท่า ברמות של lev בנוירוני ה-DA שנלכדו ב-LCM ביחס לבעל החיים כולו.הדגמנו כעת כיצד לבודד ולטהר RNA מנוירונים של Joss או נוירונים פריפריאליים באמצעות מיקרו-דיסקציה בשיטת לכידה בלייזר (LCM). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבצע אופטימיזציה לריכוז ה-trypsin ולזמן העיכול בהתאם לרקמה המיועדת למיקרו-דיסקציה ולעובי החתך. זמני דגירה ממושכים יותר עלולים להוביל לאובדן תאים רלוונטיים מחתכי הרקמה, בעוד שזמן דגירה קצר מדי עלול להיות לא מספיק להסרת הקוטיקולה של הזחלים, דבר שיוביל ל-LCM לא יעיל.חשוב לציין כי יש להכין את כל תמיסאות ייבוש הרקמה באופן טרי. כמו כן, כדי למנוע נזק לפולימר של מכסה ה-LCM, יש להמריא את ה-xylene לחלוטין לפני ביצוע ה-LCM. לבסוף, כדי לשמור על שלמות ה-RNA מהתאים המופקים, חיוני לשמור על תנאי מקדימה לשימור RNA לאורך כל הפרוצדורה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

laser-capture-microdissection-of-drosophila-peripheral-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Microdissection לייזר יושמה כדי לנתח את הביטוי פרופיל גנטי בתאים מסוימים של הדיסק כנף תסיסנית נתון RNAi...

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא...

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

הבידוד של נוירונים דופמין הבודדים או אזור tegmental הגחון עם אימונוהיסטוכימיה ישירה או עקיפה מודגם באמצעות microdissection ללכוד לייזר. פרמטרים לבידודה של רקמה משקופיות זכוכית באמצעות לייזר אינפרא אדום ומשקופיות קרום באמצעות השילוב של לייזר אינפרא אדום ואולטרא-סגול הם דנו.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

כאן, אנו מתארים את השיטה שאנו מועסקים התמונה המרצפת הדנדריטי מאוד בהכנה חיה של המוח הזחל Drosophila ילה , ואת הפרוטוקול שפיתחנו לכמת זמן קפיצה 3d מערכות הדמיה עבור הערכות כמותית של דנדט דינמיקה בפיתוח נוירונים.

זמן פקיעה הדמיה חיה הקוונפיקציה של הענף הדנדריטים המהירה בפיתוח של דרוזופילה נוירונים

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

פרוטוקול זה מדגים אבלציה של תאי לייזר של נוירונים בודדים בזחלי דרוזופילה שלמים. השיטה מאפשרת לחקור את ההשפעה של הפחתת התחרות בין תאי עצב במערכת העצבים המתפתחת.

אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית

למדו לבודד נוירונים היקפיים מזבובי Drosophila בשלבי פגית שלישיים באמצעות לייזר Microdissection. שיטה זו מאפשרת בידוד RNA באיכות גבוהה לניתוח ביטוי גנים ב-qRT-PCR ומיקרו-אריי.

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

גלה סרטונים נוספים