לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

לכידת לייזר MICRODISSECTION או LCM התגלה ככלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי לבודד סוגי תאים ספציפיים מקטעי רקמה עם רמה גבוהה של רזולוציה ודיוק מרחביים. כאן LCM משמש לניתוח נוירונים היקפיים מזחלי אופ כוכב שלישי. זחלי כוכב שלישי מוטבעים בתבנית קריו ומוקפאים ואז סטטוס קריו המשמש לחיתוך קטעי רקמה סדרתיים, המונחים על שקופיות זכוכית מופשרות ומקובעות באתנול 70%.

לאחר מכן המגלשות מודגרות עם טריפסין כדי להסיר שאריות של ציפורני הזחל ונתונות להתייבשות באמצעות שיפוע אתנול וניקוי קסילן. לאחר מכן, מכסה LCM מונח על קטע הרקמה ותאי עצב פלואורסצנטיים סלקטיביים נלכדים באמצעות לייזר פועם. לבסוף, RNA מבודד מהתאים שנלכדו ליישומים במורד הזרם כגון ניתוחי R-T-P-C-R כמותיים או ניתוחי מיקרו-מערך.

היי, אני דן קוקס מהמחלקה למולקולרית ומיקרוביולוגיה וממכון קרסנאו ללימודים מתקדמים באוניברסיטת ג'ורג' מייסון. היי, אני איש AER מהמעבדה של ד"ר דן קוקס. היום נראה לכם נוהל לבידוד תאים וטיהור RNA של נוירונים היקפיים בודדים או מרובים של דרוזופילה באמצעות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המתווכים מורפוגנזה של קצב DIN ספציפי למחלקה. אז בואו נתחיל. כל ההליכים המוצגים בסרטון זה מבוצעים בתנאים נטולי RNA לחלוטין בהתאם לנהלים סטנדרטיים.

התחל פרוטוקול זה על ידי איסוף 30 עד 40 התאמה מיושנת. זחלי כוכב שלישי. שוטפים את הזחלים במים מזוקקים כפולים.

יש לשטוף לזמן קצר ב-RNA משם, ולאחר מכן לשטוף פעם נוספת במים מזוקקים כפולים. כדי להסיר את ה-RNA, בעזרת ניגוב קים נקי נפנד לחלוטין את כל עודפי המים. לאחר מכן, קחו תבנית נקייה להטמעת רקמות והוסיפו שכבה דקה של OCT.

מניחים את התבנית על גוש קרח להתקרר לאפס מעלות צלזיוס. בעזרת מלקחיים מניחים את הזחלים הנקיים ואת ה-OCT הקר. הטמפרטורה הנמוכה של ה-OCT תעזור להפחית את תנועת הזחלים.

בתהליך ההטבעה, סדרו את הזחלים במקביל זה לזה. לאחר שהזחלים מסודרים, מלאו לאט את התבנית ב-OCT מבלי להפריע להם. הצמד הבא.

הקפיאו את התבנית על ידי הנחתה על קרח יבש. זה יבטיח שהזחל יתארגן לאורך מישור יחיד, מה שימקסם את מספר התאים הזמינים בכל חתך. באמצעות קריוסטט.

חותכים קטעים קפואים בעובי של חמישה עד שמונה מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ללא RNA ללא תווית רגילה. אחסן את השקופיות על קרח יבש, ולאחר מכן העביר אותן למינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות למיקרו-דיסקציה. יש להכין את כל התמיסות להתייבשות טריות לפני כל מפגש LCM.

התייבשות מוחלטת של קטעי רקמת זחל קפואים חיונית להשגת יעילות מיקרו-דיסקציה אופטימלית. הסר את השקופיות המכילות את חלקי רקמת הזחל הקפואים מהמקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס והניח אותן על קרח יבש. הסר שקופית בודדת מקופסת השקופיות והנח אותה מיד בצינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא באתנול 70% למשך שלוש עד 10 שניות.

לאחר מכן שטפו את השקופית בצינור חרוטי של 50 מיליליטר מלא במים מזוקקים כפולים ללא RNA למשך חמש עד 10 שניות כדי לנקות את הציפורן מחלקי רקמה שעלולים להפריע ללכידת ה-LCM. יש לשפוך בעדינות 50 מיקרוליטר של 2.5% ישירות על חלק הרקמה ולדגור במשך חמש עד 30 שניות בטמפרטורת החדר, לשטוף את החלקים לזמן קצר בשפופרת חרוטית של 50 מיליליטר המכילה RNAs, מים מזוקקים כפולים חופשיים להסרת הטריפסין וכל שברי ציפורן שנדבקים באופן רופף. השלם את תהליך ההתייבשות על ידי טבילת המגלשות ברצף בתמיסות הבאות.

70% אתנול 95% אתנול, 100% אתנול, 100% אתנול, 100% קסילן. ולבסוף, עוד פעם אחת ב-100% קסילן. לאחר ההתייבשות, יבש לחלוטין את המגלשות מתחת לזרם אוויר עדין למשך 60 עד 120 שניות בטמפרטורת החדר.

במידת האפשר, בצע את המיקרו-דיסקציה בחדר מבוקר לחות כדי למנוע כל ירידה ביעילות עקב לחות מוגברת. ראשית הפעל את החשמל עבור המיקרוסקופ ותיבת בקרת הלייזר. טען את המכסים במכלול מחזיק הכובע שלך במכסי H-S-L-C-M.

כל כובע מסוגל ללכוד גופי תאים רבים. לאחר מכן, פתח את תוכנת ההתקנים המולקולריים והזן את פרטי הניסוי כולל מספר השקופית ומספר המכסה. הנח את השקופית עם קטעי רקמת הזחל על במת המיקרוסקופ למיקרודיסקציה.

טען מכסה HS LCM חדש מהמחסנית על תא P שני מכשיר ELCM ומקם אותו נכון ביחס לג'ויסטיק כדי להבטיח מיקום נכון של המכסה ביחס לאזור הלכידה, אתר את התאים המסומנים פלואורסצנטית ב-PPK GAL ארבעה U-A-S-M-C-D שמונה GFP או 21 7 G ארבעה UASM CD שמונה קווי דיווח טרנסגניים GFP. ניתן לזהות בקלות את הנוירונים הדנדריטיים, הארבוריזציה או ה-DA של מערכת העצבים ההיקפית על ידי פלואורסצנטיות GFP. כדי למקסם את הספציפיות, בחר תאים עם אות פלואורסצנטי חזק, חפיפה מינימלית של תאים.

לאחר מכן, התאם את פרמטרי דופק הלייזר של העוצמה ומשך הזמן כדי להשיג נקודת פולימר מומסת מדויקת שגודלה תואם את גודל נקודת הלייזר שנבחר לניתוח מיקרו של נוירוני DA מסוג יחיד. ההגדרות הבאות מומלצות. קוטר נקודתי 7.5 מיקרומטר חוזק לייזר 30 עד 50 מילי-וואט זמן לייזר, שתיים עד ארבע אלפיות השנייה וירייה אחת עד שתיים לכל תא.

הגדרות הלייזר עשויות להשתנות בהתאם לסוג הרקמה, עובי הרקמה וסוג מכסה ה-LCM המשמש. בסופו של דבר, הגדרות לייזר דורשות בדיקה אמפירית לתוצאות לכידה מיטביות. לאחר מכן, הכניסו את הרקמה ל-LCM.

במהלך LCM, הכובע ממוקם מעל אזור העניין ולייזר אינפרא אדום בעל הספק נמוך. הדופק מופנה דרך הכובע על סרט פולימר מעבדה תרמו דק מעל התא או התאים המעניינים. כאשר הלייזר דופק, הסרט מתרכך, נצמד לתאי המטרה ומתמצק עם התאים המעניינים המחוברים אליו.

כאשר המכסה מורם מקטע הרקמה, התא או התאים עוברים מיקרו-דיסקט מהרקמה שמסביב כדי ללכוד תאים נוספים לשדה חדש ולחזור על התהליך. לאחר שנלכדו התאים המעניינים, הרם את מכסה ה-LCM והנח אותו על שקופית נקייה כדי לאשר את נוכחותם של התאים שנלכדו והיעדר תאים או פסולת לא רצויים. צלם את מכסה HS LCM באמצעות פלואורסצנטיות ותאורת אור משודרת.

חבר את המכסה המכיל את התאים המיקרו שנותחו כדי לחלץ את המכשיר שלך. לאחר מכן הוסף 12 מיקרוליטר של מאגר מיצוי RNA למשטח הכובע וחבר צינור תגובה בעל דופן דקה הפוכה כפי שמוצג כאן. הנח את המכלול על מגש יישור וכסה אותו בבלוק דגירה שחומם מראש.

לאחר מכן מניחים את המגש באינקובטור של 42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאחר צנטריפוגת הדגירה. הצינורות המכילים את התמציות בכוח הכבידה פי 800 למשך שתי דקות. לאחר הוצאת הצינורות מהצנטריפוגה, יש לסגור אותם, לאחסן את תמציות התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיגיע הזמן לטהר את תמצית ה-RNA ולטהר את ה-RNA.

על פי הוראות ערכת מיצוי ה-RNA הטהור של פיקו, הטיפול ב-DNA הוא אופציונלי וניתן לבצע אותו על עמודה במהלך טיהור ה-RNA לפי הצורך. לאחר טיהור ה-RNA, אחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר שימשה לבידוד נוירונים של דרוזופילה DA ספציפיים או מרובים מזחלי כוכב שלישי.

LCM מאפשר רמה גבוהה של דיוק וסגוליות בבידוד של גופי תאי עצב דרוזופילה D. מוצגת כאן תמונה מייצגת של קטע רקמה מיובש ומטופל בטריפסין של שמונה מיקרון. לפני ביצוע LCM, שני נוירונים מסוג ארבע DA מסומנים ב-GFP.

ראש החץ מציין את תא העצב המודגש ללכידה. גוף התא של הנוירון המודגש מנותח בצורה נקייה עם ספציפיות גבוהה מקטע הרקמה. החרק מראה מבט אנדוני של נוירון DA יחיד מדרגה 4 שנלכד על כובע ה-LCM.

סך ה-RNA המטוהר מנוירוני ה-DA המבודדים נמצא באיכות מצוינת כפי שעולה מנוכחות של 5.8 SAS חד ו-28 s ריבוזומלי. RNA מגיע לשיא כאשר הוא מנותח על ביואנלייזר Agilent 2100 בזמן אמת שעתוק הפוך כמותי PCR של הסמן הספציפי לגן העצבי. לב בוצע כדי להעריך את ההעשרה הספציפית העצבית של תאים מבודדים באמצעות שיטת דלתא דלתא CT העשרה של יותר מפי 2.5 ברמות הלב נצפתה בנוירוני DA שנלכדו ב-LCM ביחס לחיה כולה.

זה עתה הראינו לכם כיצד לבודד ולטהר RNA מג'וס או מנוירונים היקפיים באמצעות מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לייעל את ריכוז הטריפסין ואת זמן העיכול בהתאם לרקמה שיש לנתח מיקרוס בעובי החתך. זמני דגירה ארוכים יותר עלולים לגרום לאובדן תאים מעניינים מקטעי הרקמה, בעוד שזמן דגירה קצר עשוי להיות לא מספיק להסרת ציפורן הזחל וכתוצאה מכך LCM לא יעיל.

חשוב לציין, כל תמיסות ייבוש הרקמות חייבות להיות מוכנות טריות. כמו כן, כדי למנוע נזק למכסה ה-LCM, יש לאדות לחלוטין את פולימר הקסילן לפני ה-LCM. לבסוף, כדי לשמור על שלמות ה-RNA מהתאים המטוהרים, חיוני לשמור על תנאים מוקדמים של RNA לאורך כל ההליך.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.