מדוע קביעת ה-IC50 קריטית לפני העלאת המינון?

קביעת ה-IC50 הבסיסי באמצעות בדיקת MTT מספקת את ריכוז הייחוס להתחלת העלאת המינון ב-1/10 IC50, מה שמבטיח הפעלת לחץ סלקטיבי ללא ציטוטוקסיות מיידית. דבר זה מאפשר פיתוח הדרגתי של עמידות לאורך זמן במקום מוות תאי חריף.

כיצד פלט של בדיקת MTT מעיד על התפתחות עמידות?

בדיקת MTT מודדת ייצור של פורמזן כתוצאה מפעילות רדוקטאזה מיטוכונדריאלית בתאים חיוניים, כאשר הצפיפות האופטית ב-570 nm נמצאת במתאם למספר התאים; עמידות מאושרת כאשר התאים שומרים על חיוניות בריכוזים עולים של afatinib אשר עיכבו את הצמיחה בתחילה.

מה מאפשר שכפול מהימן של פיתוח שורות תאים עמידות?

העלאה מדורגת של המינון במצב של תת-צפיפות (subconfluency), עם עליות ריכוז של 10-20% בכל מעבר, מספקת פרוטוקול סטנדרטי של לחץ סלקטיבי שניתן לשחזר במעבדות שונות ליצירת מודלים עמידים איזוגניים.

מדוע דרישות השחזור חיוניות לשיתוף פעולה בין-תפקודי?

פיתוח עמידות עקבי בין חזרות מבטיח שהפנוטיפים שנצפו מונעים גנטית ולא באופן סטוכסטי, מה שמאפשר העברה אמינה בין צוותי הגילוי, פיתוח הבדיקות והצוותים הפרה-קליניים לצורך מחקרי תיקוף מטרה.

איזה ניתוח סטטיסטי נדרש כדי לאשר התפתחות עמידות?

העמידות מאושרת על ידי השוואת עקומות חיותיות שהתקבלו מבדיקת MTT בין התאים ההוריים לתאים שהחשיפו למנות מדורגות, דבר המצריך בדיקת מובהקות סטטיסטית (למשל, ניתוח הסטה של IC50) כדי להוכיח רגישות מופחתת לתרופה לאורך זמן.

העלאת מינון: שיטה לפיתוח עמידות לתרופות בתאים סרטניים

JoVE Encyclopedia of Experiments

מחקר סרטן

0 צפיות • 4:17 דק' • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- מעכבי טירוזין קינאז, TKI, חוסמים את קולטן הקינאז מלהיקשר ל-ATP, ומונעים את הזרחון. התחל עם ציפוי תאים סרטניים במצע גדילה. לאפשר להם להגיע לצפיפות נוחה, ולהעביר את התאים למספר בארות. לאחר גדילה של לילה, יש לפזר ריכוזי תרופות שונים במספר בארות ולתת לתאים לגדול למשך הזמן הרצוי. הוסיפו MTT, צבע מסיס במים, כדי למדוד את כדאיות התא. אנזימים מיטוכונדריאליים ממירים MTT לפורמזן סגול בלתי מסיס בתוך תאים חיים.

עצור את התגובה על ידי הוספת חומר מסיס מתאים ומדידת פורמזן ספקטרופוטומטרית. שיטה זו נקראת מבחן MTT. שרטט גרף של תאים חיים המסומנים על ידי פורמזן כנגד ריכוזי תרופות. חישוב ריכוז מעכב, IC₅₀, על ידי מציאת ריכוז התרופה שהורגת 50% מהתאים באמצעות התוכנה.

לאחר מכן, לגדל תאים סרטניים במדיום הצמיחה ולהפיץ אותם בשלוש צלחות שונות. לאחר שהתאים מגיעים לתת-מפגש מוסיפים דילול של 1/10 מריכוז IC₅₀. אפשרו לתאים לגדול ולבצע את בדיקת MTT. חזור על תהליך זה עם הגדלת מינון התרופה. תאים סרטניים מפתחים אט אט עמידות ל-TKIs עקב מוטציות ברצף החלבון.

הפרוטוקול הבא מראה התפתחות עמידות לאפטיניב בתאי PC9 על ידי הסלמת מינון.

- כדי לקבוע את ריכוז עמידות האפטיניב המתאים, תרבית תאי PC9 במדיום גידול בתרבית תאים של 10 ס"מ טיפלה בצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. להשעות מחדש את תאי PC9 ב 4 כפול 10 ל 4 תאים למיליליטר של ריכוז בינוני צמיחה זרע את התאים ב 50 מיקרוליטר של תאים השעיה לכל באר ב 96 microplate באר. לאחר דגירה של לילה באינקובטור תרביות התא, יש לטפל בתאים עם 50 מיקרוליטר של תמיסת אפטיניב לבאר בשישה עותקים משוכפלים של הריכוזים שצוינו. ואחרי דגירה של 96 שעות באינקובטור תרבית התא, מוסיפים 15 מיקרוליטר צבע MTT לכל באר.

לאחר ארבע שעות באינקובטור תרביות התא, מוסיפים 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירת מסיסות לכל באר ומחזירים את הצלחת לאינקובטור למשך הלילה. למחרת בבוקר, למדוד את הצפיפות האופטית ב 570 ננומטר על קורא microplate. לחשיפה רציפה לאפאטיניב, תרבית תאי PC9 בצלחות P100 המכילות 10 מיליליטר של מדיום גדילה עד שהתאים מגיעים לתת-מפגש.

מעבירים את התרביות התת-קונפלואנטיות לשלוש מנות P100 חדשות של 9 מיליליטר מדיום גידול לכל צלחת תרבית ראשונית ומחזירים את התאים לאינקובטור תרביות התא. למחרת בבוקר, הוסיפו 0.1 ננו-מולרית או 1/10 מהריכוז המעכב החצי מקסימלי של אפטיניב לכל סט של שלוש מנות תרבית. כאשר התאים המטופלים באפטיניב הופכים לתת-פלואנטיים, השתמשו בפיפט של 1 מיליליטר כדי לערבב היטב את התרביות והעבירו מיליליטר אחד של תאים מכל מנה ל-9 מיליליטר של מצע גידול טרי במנות P100 חדשות.

הוסף ריכוזים גבוהים ב -10% עד 20% של אפטיניב לתרבויות החדשות, והגדל את ריכוז האפאטיניב על ידי עליית מינון מדורגת בכל פעם שהתרביות מגיעות לתת-מפגש על פני תקופה של 10 עד 12 חודשים. כאשר מגיעים לריכוז אפטיניב של 1 מיקרומולרית, בצע את בדיקת MTT כפי שהודגם כדי לאשר שהתאים פיתחו עמידות לאפטינב.