אלקטרופורציה אורגנואידית: שיטה להעברת DNA פלסמיד לאורגנואידים במערכת העיכול

- אורגנואידים הם תרביות תאים זעירות תלת ממדיות שמקורן בתאי גזע ספציפיים לרקמות. הם יציבים מבחינה גנומית אך ניתנים לשינוי גנטי באמצעות טרנספקציה ולכן אידיאליים לחקירה גנטית. עבור transfection, זרע אורגנואידים בצלחת תרבית multiwell עם מדיום תרבית מסוים לדגור במשך הזמן הרצוי. לאחר מכן, הוסף תערובת דיסוציאציה לצלחת כדי לעזור דיסוציאציה של תאים אורגנואידים. מעבירים את התערובת לצינור וצנטריפוגה. השהה מחדש את גלולת האורגנואיד במאגר אלקטרופורציה המכיל DNA פלסמיד המסומן באופן פלואורסצנטי. החיץ מייצב את התאים ומונע מוות תאי כתוצאה מלחץ חשמלי.

מעבירים את התערובת לקובט ומחשמלים את התאים. דחפים חשמליים על פני קרום התא גורמים להיווצרות נקבוביות זמנית כדי להקל על ספיגת DNA פלסמיד לתוך התא. לאחר ההתחשמלות, מוסיפים מיד מדיום תרבית לתרחיף התא ומעבירים את התערובת לצינור. עכשיו, צנטריפוגות את התאים. משעים מחדש את הגלולה במטריצת המרתף ומעבירים לצלחת multiwell לפילמור. מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובודקים פלואורסצנטיות בתאים, מה שמאשר העברה יעילה. בפרוטוקול הבא, נבצע אלקטרופורציה כדי להדביק אורגנואידים במערכת העיכול.

- התחילו בחימום מראש של לוחות 48 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לזריעה לאחר אלקטרופורציה, ולאחר מכן הכינו מדיומים ספציפיים לתרבית בזאלית ואורגנואידית בהתאם להוראות כתב היד. טפחו חמש בארות אורגנואידים לכל דגימת אלקטרופורציה בצלחת של 48 בארות. הכינו 230 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה עם 10 מיקרומולר Y27632 לכל באר. עקוב אחר האורגנואידים תחת מיקרוסקופ. מוציאים את מדיום התרבית מהבארות ומנתקים את האורגנואידים באופן מכני בתערובת הדיסוציאציה המוכנה. אגרו חמש בארות לכל דגימת אלקטרופורציה לצינור אחד של 15 מיליליטר.

מערבבים את תוכן הצינור על ידי מערבולות ודגרים עליו במשך 5 עד 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד אשכולות של 10 עד 15 תאים מתרחשים, בדיקת הדיסוציאציה עם המיקרוסקופ. עצור את העיכול על ידי הוספת עד 10 מיליליטר של מדיום בסיסי ללא אנטיביוטיקה. צנטריפוגה את הצינור ב 450 פעמים גרם במשך חמש דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים פעמיים עם 4 מיליליטר של חיץ אלקטרופורציה. צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנאטנט לאחר כל שטיפה. לאחר השטיפות, להשעות מחדש את גלולת האורגנואיד ב 100 מיקרוליטר של חיץ אלקטרופורציה עם 30 מיקרוגרם של DNA פלסמיד.

מוציאים את תערובת הדנ"א-אורגנואיד המלאה לתוך קוביית אלקטרופורציה. הקפידו להימנע מבועות אוויר. הגדר את פרמטרי האלקטרופורציה כמתואר בכתב היד של הטקסט והקש על הקובטה באצבע כדי לערבב בעדינות את התאים. הכניסו את הקובט לתא הקובטה ולחצו על כפתור העכבה באלקטרופורטור כדי לרשום את ערך העכבה. לחץ על לחצן התחל כדי להפעיל את תוכנית האלקטרופורציה ולשלוט בערכי הזרמים, המתחים והאנרגיות המוצגים.

לאחר התחשמלות, מיד להוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית ללא אנטיביוטיקה לתאים ולערבב על ידי pipeting למעלה ולמטה. מעבירים את הדגימה לצינור חדש של 15 מיליליטר ושוטפים את הקובטה בתווך בסיסי כדי לאסוף את התאים הנותרים, ואז דוגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. צנטריפוגות את התאים ב 450 פעמים g במשך חמש דקות ומשליכים את supernatant. להשעות את הגלולה ב 100 מיקרוליטר של מטריצת מרתף זרע 20 טיפות מיקרוליטר בצלחת 48 באר שחוממה מראש.

דוגרים על הצלחת במשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס לצורך פילמור ומוסיפים 250 מיקרוליטר של מדיום תרבית בתוספת Y27632 ו-CHIR-99021 לבאר. כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה, בדוק את הפלואורסצנטיות בבקרת הטרנספקציה תחת המיקרוסקופ לאחר 24 עד 48 שעות.