אלקטרופורציה אורגנואידית: שיטה להעברת DNA פלסמיד לאורגנואידים במערכת העיכול
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מחקר סרטן
0 צפיות • 5:11 דק׳ • April 30th, 2023
- אורגנואידים הם תרביות תאים זעירות תלת ממדיות שמקורן בתאי גזע ספציפיים לרקמות. הם יציבים מבחינה גנומית אך ניתנים לשינוי גנטי באמצעות טרנספקציה ולכן אידיאליים לחקירה גנטית. עבור transfection, זרע אורגנואידים בצלחת תרבית multiwell עם מדיום תרבית מסוים לדגור במשך הזמן הרצוי. לאחר מכן, הוסף תערובת דיסוציאציה לצלחת כדי לעזור דיסוציאציה של תאים אורגנואידים. מעבירים את התערובת לצינור וצנטריפוגה. השהה מחדש את גלולת האורגנואיד במאגר אלקטרופורציה המכיל DNA פלסמיד המסומן באופן פלואורסצנטי. החיץ מייצב את התאים ומונע מוות תאי כתוצאה מלחץ חשמלי.
מעבירים את התערובת לקובט ומחשמלים את התאים. דחפים חשמליים על פני קרום התא גורמים להיווצרות נקבוביות זמנית כדי להקל על ספיגת DNA פלסמיד לתוך התא. לאחר ההתחשמלות, מוסיפים מיד מדיום תרבית לתרחיף התא ומעבירים את התערובת לצינור. עכשיו, צנטריפוגות את התאים. משעים מחדש את הגלולה במטריצת המרתף ומעבירים לצלחת multiwell לפילמור. מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובודקים פלואורסצנטיות בתאים, מה שמאשר העברה יעילה. בפרוטוקול הבא, נבצע אלקטרופורציה כדי להדביק אורגנואידים במערכת העיכול.
- התחילו בחימום מראש של לוחות 48 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לזריעה לאחר אלקטרופורציה, ולאחר מכן הכינו מדיומים ספציפיים לתרבית בזאלית ואורגנואידית בהתאם להוראות כתב היד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים