גירוי תאי T Ex vivo בגידול הלבלב: שיטה להגברת ייצור הציטוקינים בתאי T

- תאי T פעילים עוברים למיקרו-סביבה של גידול הלבלב, שם הם משחררים ציטוקינים כמו אינטרפרון-גמא, או גמא IFN, וגורם נמק גידולי-אלפא, או TNF אלפא, המסייע בתיווך תגובה אנטי-סרטנית יעילה. כאשר ציטוקינים יוצאים במהירות מתא T, הרמות התוך-תאיות יכולות להיות בלתי ניתנות לגילוי. לכן, תא T זקוק לגירוי כדי להגביר את ייצור הציטוקינים הבסיסיים לצורך לימוד תפקידם הטיפולי בגידול.

התחל על ידי לקיחת השעיה של תאים סרטניים מן הלבלב של העכבר. כעת, טפלו בתאי T הנמצאים בתרחיף התא באמצעות קוקטייל לגירוי ציטוקינים ודגרו על התערובת למשך הזמן הרצוי. קוקטייל זה מאפשר שחרור יוני סידן מהרשתית האנדופלסמית אל הציטופלסמה. רמות סידן גבוהות, בתורן, מפעילות גורמי שעתוק גרעיניים מסוימים, מה שמוביל לעלייה בייצור ציטוקינים בתאי T.

לאחר מכן, לטפל בתאים עם קוקטייל מעכב הובלת חלבון לדגור על הצינור. קוקטייל זה חוסם את העברת הציטוקינים מהרשתית האנדופלסמית לקומפלקס הגולג'י, וכתוצאה מכך הצטברות ציטוקינים בתוך התא. לבסוף, הכתימו את התאים באמצעות סמנים תוך-תאיים מתאימים לניתוח ציטומטריית זרימה. בפרוטוקול הבא נבצע גירוי תאי T כדי להעלות את הריכוז התוך-תאי של ציטוקינים.

- כדי להתחיל, השתמש במלקחיים כדי להעביר את הגידול על צלחת פטרי. אחסנו 5 מיליליטר של מדיום העיכול בצינור של 50 מיליליטר על קרח כדי למנוע את תחילת פעילות האנזים. קח aliquot קטן של פתרון זה כדי לכסות את הגידול על צלחת פטרי. השתמש באזמל סטרילי ומלקחיים כדי לחתוך את הגידול לחתיכות קטנות, בערך פחות מ -3 מילימטרים אורך. מגרדים את חתיכות הגידול לתוך הצינור והופכים בעדינות את הצינור עד שכל החתיכות שקועות במצע העיכול. מעבירים את הצינורית למכשיר ניעור למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול. ודא שכל חתיכות הגידול שקועות ולא דבוקות לקצה הצינור.

מיד לאחר שלב העיכול, הניחו את הצינורית על קרח כדי להאט את פעילות האנזים. הוסף EDTA כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מילימולר ומערבל לזמן קצר את הדגימה כדי לערבב על מנת להאט עוד יותר את פעילות האנזים. פתח את הצינורית ושטוף כל עיכול גידול ממכסה הצינור עם מדיום סל"ד טרי. לאחר מכן, הכינו מסננת של 70 מיקרון. הניחו אותו על צינור פתוח של 50 מיליליטר על קרח. מרטיבים מראש את הפילטר במדיום. משעים מחדש את התאים המעוכלים ושוטפים את דפנות הצינור באמצעות פס של 25 מיליליטר ומעלה. הפתח הרחב יותר של הסטריפט מאפשר לעיכול העבה לעבור בקלות.

מעבירים את כל העיכול למסננת בעזרת פס 25 מיליליטר. מועכים מעלה ומטה את הגידול על גבי המסנן באמצעות בוכנה מזרק 1 מיליליטר. לשטוף ברציפות תאים דרך המסננת עם RPMI. הקפידו לשטוף בכוח מספיק כדי לדחוף את התאים דרכם. המשיכו לשטוף עד שכל התאים עברו דרך המסננת. צנטריפוגה את הצינור במשך חמש דקות ב 300 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס.

בזהירות להשעות מחדש את גלולת התא להשלים RPMI, ולעבור ישירות דרך מסנן אחר כדי להסיר כל מטריצה תאית או גושי תאים גדולים כי לא ניתן להשעות כראוי. אם אין צורך בגירוי, הכתימו מיד את התאים המבודדים לניתוח ציטומטריית זרימה או השהו אותם מחדש במדיום הקפאה של 10% DMSO ב- FBS ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע גירוי, ראשית, לספור את התאים. לדלל את התאים בתווך מלא כדי להשיג ריכוז של 2 פעמים 10 עד 6 לכל 100 מיקרוליטר. צלחת 100 מיקרוליטר של תאים בכל באר של צלחת 96 תחתית U. מוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום שלם המכיל הכנה פי 2 של PMA ויונומיצין. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, להוסיף 20 מיקרוליטר של הכנה 10X של Brefeldin-A ו Monensin מדיה מלאה כדי להשיג ריכוז סופי של 1.06 micromolar ו 2.0 micromolar, בהתאמה. מחזירים את הצלחת לאינקובטור לעוד ארבע שעות.