Name: מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: חקור שיטת תרבית תאי אפיתל פיגמנט רשתית עובריים אנושיים ליצירת מודל מחקר מדויק למחלות עין. שיטה זו מאפשרת ניסויים פונקציונליים ומחקרים טרום-קליניים לפיתוח טיפולים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדה ג&#39;פרי Adijanto, טינה Banzon, Li Rong, צ&#39;ין וואן, Congxiao ג&#39;אנג, זאו ג&#39;ינג, קוני Zhi, Awais זיא, נטליה Strunnikova לעזרה באפיון הללו בתרביות תאים. תודה מיוחדת זאו ג&#39;ינג, קוני Zhi, וטינה Banzon על עזרתם בשמירה על מלאי גדול של תרביות תאים. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לחקר הבריאות תוכנית עירונית.

<ol><li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li>
<li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+184%3A+Phototransduction%3A+RPE+transport+Retina+Phototransduction%3A+RPE+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+the+Eye%22%5BJournal%5D)">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , Elsevier. 2540-2540 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+Building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li>
<li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+localization%2C+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+%28JAM-C%29+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%7Bgamma%7D+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-C+and+-D+induced+proliferation%2Fmigration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li>
<li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y%282%29+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li>
<li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204%2F211+alters+epithelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li>
<li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment%2C+migration%2C+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium%3A+relevance+for+proliferative+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li>
<li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling%2C+ion%2C+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li>
<li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%29-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בניסויים הנוכחי, אנו מתארים שינויים נוספים של טכניקות שפורסמו בעבר שלנו 3 נועד לייעל את הצעדים הדרושים כדי לייצר מספר רב של תרבויות העיקרי hfRPE עקבית עם מספרים גבוהים יותר של תאים זמינים לכל עין. כל שינוי בהליך המקורי נבדק בקפדנות בפיזיולוגיה מספר ניסויים בביולוגיה מולקולרית על מנת להבטיח כי השינויים לא להכניס חפצים נבדקות ללא הרף על ידי מעבדות רבות אחרות באמצעות תאים אלה. לבסוף, ניסויים נוספים בוצעו להשוות את בתוצאות חוץ גופית כדי הפרעות דומות בבעלי חיים.

מכשירים הדרושים פרוטוקול לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ סטריאו - כל כניסה עם x250 הגדלה העבודה הדרושים לנתיחה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת הביתור - למשל קימבל 100 x 20mm # 23062 (אחד לכל דיסקציה) כל מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sylgard 184 - חתול WPI. # SYLG184 * * כדי להכין תבשיל לנתח לעקוב Sylgard 184 כללו הוראות ערבוב, אלסטומר לשפוך נוזל מעורב לתוך צלחת פטרי כדי ליצור 5-8mm השכבה. אפשר אלסטומר לרפא לפחות 24 שעות. צלחת עם אלסטומר נרפא ניתן לעקר באמצעות אתנול 70% ו פעמים רבות שימוש חוזר (~ 100 פעמים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 27 G מחטים BD PrecissionGlide אורך ¼ 1 (5 לכל דיסקציה) כל מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS 1X תמיסה המכילה Ca ומלחים Mg - חתול GIBCO # 14025 500ml (טוב חתכים מרובים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איריס להב משונן מספריים קרביד, מעוקל - FST חתול # 14559-11 (אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים רשתית - Katena חתול # K4-5300 (אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים - למשל דומון מלקטת # 5 עם טיפים מלוטשים חתול WPI # 500085 (2 יח&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכין Sideport - Alcon, חדה 1mm, שפוע כפול, חתול זווית # 8065921540. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שפופרת 15 מ&quot;ל - (אחד לכל עין) כל מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה פסטר זכוכית - (אחד לכל דיסקציה) כל מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 12 היטב (אחד לכל דיסקציה) כל מקור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primaria 25cm 2 בקבוק - (2-3 לכל עין) כל מקור </li></ol>

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

פיתחנו תרבות התא הליך זה יכול לייצר כמויות גדולות של monolayers ומחוברות העיקרי של האדם העובר אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) עם תרבויות, מאפיינים מורפולוגיים פיזיולוגיים הגנטי של הרשתית האדם הילידים. אלה בתרביות תאים hfRPE התערוכה פיגמנטציה כבד, מיקרוסקופית אלקטרונים להראות נרחב microvilli קרום apical. מתחמי junctional זוהו עם תיוג immunofluorescence של חלבונים שונים צומת חזק. הקוטביות פונקציה אפיתל של תרבויות אלה העיקרי לשחזור בקלות דומים למד בעבר מודלים יונקים של הרשתית הילידים, כולל האדם. תוצאות אלו הוארכו על ידי פיתוח של התערבויות טיפוליות במודלים של בעלי חיים שונים של מחלת העין האנושית. התמקדנו אסטרטגיות להסרת הצטברות נוזל נורמלי ברשתית או רווח subretinal. החלל subretinal תאיים המפריד בין מגזרים photoreceptor החיצוני של קרום apical של הרשתית לבין הוא קריטי עבור תחזוקה של קבצים מצורפים הרשתית וכן שורה שלמה של הרשתית / הרשתית אינטראקציות.

אנו מספקים שיטה לשחזור עבור monolayers culturing ומחוברות של העובר תאים אנושיים אפיתל הפיגמנט ברשתית (hfRPE) תאים התערוכה מורפולוגיה, פיזיולוגיה, קוטביות, וחלבון וביטוי גנים דפוסים של רקמת יליד מבוגר. עבודה זו הורחבה במודל חיה של מחלות עיניים שונות.

פיתחנו פרוצדורה לתרבית תאים המסוגלת להפיק כמויות גדולות של שכבות חד-שכבתיות (monolayers) רבויות (confluent) של אפיתל הפיגמנט של הרשתית (RPE) ראשוני מעובר אנושי...

המטרה הכללית של הליך זה היא לייצר תרביות של אפיתל הפיגמנט של הרשתית העוברית האנושית, או RPE, שניתן להשתמש בהן כמודל. בחקירות של מחלות עיניים אנושיות, רקמות מתקבלות מתורמים כגלגלי עיניים שלמים. השלב הראשון של ההליך הוא להסיר שרירים ורקמת חיבור עודפות, ולאחר מכן לפתוח את העין על ידי הסרת הקרנית והעדשה.את העין מטפלים ב-dispa ומשטחים, ולאחר מכן קולפים את השכבה החד-שכבתיות של ה-RPE מהכורואיד. את תאי ה-RPE המבודדים זורעים בבקבוקון תרבית ומגדלים במשך מספר שבועות עד להגעתם לשכבה חד-שכבתיות צפופה (confluent monolayer) ולפיתוח פיגמנט. תרביות התאים משמשות לניסויים תפקודיים in vitro.ניסויים מוצלחים in vitro חוזרים על עצמם במודלים של בעלי חיים בניסויים פרה-קליניים, שבהם ניתן להעריך טוב יותר את התגובות של ה-RPE בסביבות איתות מורכבות יותר. המודל המוצג כאן יוביל להבנה טובה יותר של פיזיולוגיית ה-RPE ולהתערבויות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות עיניים. שלום, שמי שלדון מילר.המעבדה שלי ממוקמת במכון הלאומי לעיניים (National Eye Institute), שהוא חלק מהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) בקמפוס בת'סדה, מרילנד. שלום, אני ארקי ממעבדת מילר. היום נראה לכם הליך להכנת תרביות ראשוניות של תאי אפיתל של הרשתית העוברית האנושית.תאים אלו יוכנו כשכבות חד-שכבתיות צפופות (confluent monolayers) שניתן יהיה להרכיב בתאי-סינג (sing chambers) משופרים. נשתמש בתאי RPE אנושיים מבודלים אלו גם למחקרים בביוכימיה ובגנטיקה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי להקים תרביות ראשוניות של תאי אפיתל, במטרה לחקור את התפקוד והוויסות של תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים ולפתח מודלים קליניים של מחלות בבעלי חיים.אנו מתמקדים באפיתל הפיגמנט הרשתית או ה-RPE, הממוקם בחלק האחורי של העין ומפריד בין הרשתית העצבית לבין אספקת הדם של הכורואיד. תרשים זה של העין מראה את מיקומו של שכבת ה-RPE בחלק האחורי של העין, סמוך מאוד לפוטו-רצפטורים. התמונה המוכנסת מראה את תאי הרשתית, כאשר הפוטו-רצפטורים נמצאים מימין ותאי הגנגליון נמצאים משמאל.אפיתל זה פעיל מטבולית באופן קיצוני. הוא מבצע פגוציטוזה של פוטורצפטורים באופן רציף ובבסיס יומי, והוא מאחסן, מעבד ומעביר את ויטמין A, הפיגמנט הראייתי, אל הפוטורצפטורים. במחזור הראייה, הוא פועל באופן הומאוסטטי כדי לשמור על ההרכב הכימי והנפח של החללים החוץ-תאיים הסובבים.תכונה קריטית של תאי אפיתל היא הפולריות שלהם. ההובלה האסימטרית המתמשכת של חלבונים לממברנות האפיקליות והבסאליות-לטרליות היא תהליך מווסת המאפשר לאפיתל לבצע תעתוע וקטורי של מטבוליטים, יונים ונוזלים מחלל חוץ-תאי אחד לאחר. פעילות זו מסייעת לאפיתל לשמור על בריאותם ושלמותם של תאי הרשתית העצבית.ההכנה במעבדה (in vitro) המתוארת כאן מאפשרת ניתוח של חלבוני תובלה, רצפטורים ומסלולי איתאות הקובעים את הפולריות והתפקוד האפיתליים לפני תחילת הנתיחה. הכינו פלטת 12 בארות במנדף זרימה למינרית עם תמיסות בטמפרטורת החדר. לכל עין נדרשת בארה אחת של תמיסת antibiotic antimycotic בריכוז 10x, שתי בארות של 1x PBS ובארה אחת של 2 units per milliliter של disc space המדולל בתווך 5%RPE עם סרום. מלאו צלחת נתיחה עם ריפוד סיליקון ב-1x HBSS, רוקנו את הנוזל והעבירו כל עין לבארה אחת של תמיסת antibiotic antimycotic.דגרו למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הימנעו מהפעלת לחץ מופרז על גלגל העין. שטפו את העין בשני בארי (wells) עוקבים של XPBS כדי להסיר אנטיביוטיקה עודפת.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה להעברה של העין לכלי ניתוח המולא ב-one X-H-B-S-S תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמשו במספרי איריס להסרת שרירים ורקמות חיבור עודפות מסביב לעין. יישרו את העין כך שהקרנית תפנה כלפי מעלה.השתמשו בשתי מחטים סטריליות בכי মাপ 27 כדי להקבע את העין לפד הסיליקון באמצעות רקמת חיבור, מבלי לפגוע בסקלרה. במנח זה, השתמשו בסכין לפתח צד (side port knife) כדי לבצע חתך דרך הסקלרה. החתך צריך להיות במרחק של שליש מהמרחק שבין קו המש equator של העין לבין השטח הקדמי.השתמש במספרי איריס כדי להמשיך את החיתוך באופן מעגלי מסביב לעין כדי למנוע נזק לאפית הפיגמנט של הרשתית, המקוצרת כ-RPE, כתוצאה ממשיכה של הרשתית והזגוגית. השתמש באותם מספריים כדי לחתוך דרך הגוף הזגוגית כדי להפריד את השטוח הקדמי של העין מגביע העין.הרם את החלק הקדמי של ה-IOA והשלח אותו. השתמש בפינצטה כדי להעביר את העין הפתוחה אל תוך באר ה-dys. ודא שאין בועות אוויר בעין.דגרו למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. העבירו את העין מהחלל המוגדר בחזרה לכלי הנתיחה, שמולא ב-1X HBSS טרי בטמפרטורת החדר. מקמו את העין כאשר הגביע פונה כלפי מעלה וקבעו אותה באמצעות 2 מחטים בקוטר 27 gauge.תחת מיקרוסקופ dissection, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להרים בעדינות את הרשתית המופרדת חלקית באמצעות מספרי רשתית. גזרו את הרשתית מהעצב האופטי. השליכו את הרשתית באמצעות מספרי קשתית.בצעו חתך מהיקף העין אל העצב האופטי. קבעו את העין באמצעות 5 מחטים בכיסוי 27 gauge. כדי למתוח את שכבת ה-RPE, השתמשו במספרי רשתית כדי לבצע חיתוך מעגלי מסביב לעצב האופטי.הפרדת שכבת ה-RPE תוך מעבר להגדלה של 250x או יותר. אתרו את קצה גיליון ה-RPE לאורך החתך שבוצע על ידי מספרי האיריס ובסמיכות לעצב optic nerve. השתמשו בשני זוגות פינצטות כדי להפריד את ה-RPE ואת ממברנת ברוס (Bruch membrane) משכבת רקמת הכורואיד.נסו מספר אזורים לאורך קצה החיתוך כדי למצוא את הנקודה שבה הקשר בין ה-RPE לטחול (choroid) הוא החלש ביותר. קלפו בעדינות את הממברנה לאחור כדי להסירה לחלוטין. העבירו את דפי ה-RPE למבחנה קונית בנפח 15 milliliter הממולאת ב-trypsin EDTA בטמפרטורת החדר.כאשר כל הדפים נאספו, סגרו את השפופרת במכסה, והדגירו את השפופרות בבן-מריא למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. נערו את השפופרת בעוצמה כדי להפריד את ה-RPE לצבירים קטנים. היעדרם של גושי תאים כהים מעיד על כך שההפרדה הושלמה.החזירו את המבחנה למקלח המים למשך חמש דקות נוספות. השתמשו בפסטור, בפיפטה ובשאיבה עדינה כדי להסיר שאריות רקמה שלא עוכלו. סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-280 5G למשך ארבע דקות.הסר את הנוזל העליון (supernatant). השלם את הנפח הסופי לתשעה מיליליטרים באמצעות מצע 15%RPE וערבב בעזרת פיפטה כדי לתלות מחדש את התאים. העבר בעזרת פיפטה שלושה מיליליטרים של תגלי התאים לבקבוק תרבית (flask) של 25 סנטימטר רבוע.הוסיפו שני מיליליטרים של מצע תרבית 15% RPE טרי בטמפרטורת החדר. השאירו את התאים למשך לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% carbon dioxide. ככל שהתרביות יבשילו, הפיגמנטציה שלהן תגבר לאחר שלושה עד ארבעה שבועות.תרביות מוצלחות יהיו קונפלואנטיות ובעלות פיגמנטציה עזה ואחידה. כעת הצגנו בפניכם כיצד להכין תרביות ראשוניות של RP עוברי אנוש. זהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להבדיל תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית תאי גזע pluripotent האנושי הנושאים מוטציות נגזר החולה. הקווים המוטנטים תא עשוי לשמש עבור ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ. גישה זו מחלה-ב--תבשיל עוקף את הקושי של השגת תאי RPE אדם מקורי.

בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות

כאן, אנו מציגים שיטה להקלטת תגובות חשמליות אור-עורר של אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) בעכברים באמצעות טכניקה המכונה DC-ERGs שתואר לראשונה על ידי מרמורשטיין, Peachey, ועמיתים בתחילת שנות ה-2000.

אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) להקלטת התגובות החשמליות המעוררות אור של אפיתל פיגמנט רשתית העכבר

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

אנו מתארים שיטה להפרדה יעילה של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מהרשתית בעיניים אנושיות ויצירת שטוחים שלמים של RPE/כורואידים לצורך ניתוחים היסטולוגיים ומורפומטריים של ה-RPE.

ייצור יעיל ועקבי של אפיתל פיגמנט רשתית/כורואיד שטוח מעיני אדם לניתוח היסטולוגי

אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.

בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה

מודלים של עכברים יכולים להיות כלים שימושיים לחקר הביולוגיה של אפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE). נקבע כי עכברים יכולים לפתח מערך של פתולוגיות RPE. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פנוטיפ כדי להבהיר ולכמת פתולוגיות RPE בעכברים באמצעות אור, אלקטרונים הולכה ומיקרוסקופ קונפוקלי.

פרוטוקול להערכה וכימות של פתולוגיות אפיתל פיגמנטי ברשתית במודלים עכבריים של ניוון מקולרי הקשור לגיל

מחלות עיניים ניווניות המשפיעות על שכבת אפיתל פיגמנט הרשתית של העין יש מקורות מונוגניים ופוליגניים. מספר מודלים של מחלות ויישום תוכנה, LipidUNet, פותחו כדי לחקור מנגנונים של מחלות, כמו גם התערבויות טיפוליות פוטנציאליות.

שיטה מבוססת ליפידים-למידת מכונה לאפיון וכימות משקעי שומנים באמצעות אפיתל פיגמנט רשתית שמקורו ב-iPSC

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להשגה וטיפוח של תאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים (RPE) מעיניים חזיריות ממקור מקומי. תאים אלו מהווים חלופה איכותית לתאי גזע ומתאימים למחקר רשתית במבחנה .

בידוד תאי אפיתל פיגמנט רשתית חזיריים ראשוניים למידול חוץ גופי

אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) פועל כמחסום מכריע בין הכורואיד לרשתית, ומקדם את בריאותם ותפקודם של סוגי תאי רשתית, כגון פוטורצפטורים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל לבידוד וטיפוח RPE של מורין בוגר.

שיטה פשוטה לבידוד ותרבית של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעכברים בוגרים

חקור שיטת תרבית תאי אפיתל פיגמנט רשתית עובריים אנושיים ליצירת מודל מחקר מדויק למחלות עין. שיטה זו מאפשרת ניסויים פונקציונליים ומחקרים טרום-קליניים לפיתוח טיפולים חדשים.

מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

גלה סרטונים נוספים