מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תרביות של אפיתל רשתית העובר האנושי, או RPE, שניתן להשתמש בהן כמודל. במחקרים של מחלות עיניים בבני אדם, הרקמות מתקבלות מתורמים כגלובוסים של עיניים שלמות. השלב הראשון של ההליך הוא להסיר שרירים ורקמות חיבור עודפות ולאחר מכן לפתוח את העין על ידי הסרת הקרנית והעדשה.

את העין מטפלים ב-dispa ומיישרים, ולאחר מכן מקלפים את השכבה החד-שכבתיות של ה-RPE מהכורואיד. את תאי ה-RPE שבודדו זורעים לבקבוקי תרבית ומגדלים במשך מספר שבועות עד שהם מגיעים למצב של שכבה חד-שכבתיות רציפה (confluent) ומפתחים פיגמנט. תרביות התאים משמשות לניסויים תפקודיים in vitro.

ניסויים מוצלחים in vitro חוזרים על עצמם במודלים של בעלי חיים בניסויים פרה-קליניים, שבהם ניתן להעריך טוב יותר את התגובות של ה-RPE בסביבות איתות מורכבות יותר. המודל המוצג כאן יוביל להבנה טובה יותר של פיזיולוגיית ה-RPE ולהתערבויות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות עיניים. שלום, שמי שלדון מילר.

המעבדה שלי ממוקמת במכון הלאומי לעיניים (National Eye Institute), המהווה חלק מהמכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health) בקמפוס בת'סדה, מרילנד. שלום, אני ארקי ממעבדה של מילר. היום נדגים לכם פרוצדורה להכנת תרביות ראשוניות של תאי אפיתל של הרשתית העוברית האנושית.

תאים אלו יוכנו כשכבות מונו-שכבה צפופות (confluent monolayers) שניתן להרכיב בתאי סינג (sing chambers) שעברו התאמה. נשתמש בתאי RPE אנושיים מבודדים אלו גם למחקרים בביוכימיה ובגנטיקה. אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו להקמת תרביות ראשוניות של תאי אפיתל כדי לחקור את התפקוד והבקרה של תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים ולפתח מודלים חייתיים קליניים למחלות.

אנו מתמקדים באפיתל הפיגמנט של הרשתית או ה-RPE, הנמצא בחלק האחורי של העין ומפריד בין הרשתית העצבית לבין אספקת הדם של הכורואיד. תרשים סכמתי זה של העין מראה את מיקומה של שכבת ה-RPE בחלק האחורי של העין, בסמוך לפוטורצפטורים. התמונה המלווה מציגה את תאי הרשתית, כאשר הפוטורצפטורים נמצאים מימין ותאי הגנגליונים נמצאים משמאל.

אפיתליום זה פעיל מטבולית באופן קיצוני. הוא מבצע פגוציטוזה של פוטורצפטורים באופן רציף ובבסיס יומי, והוא מאחסן, ממסר ומעביר את ויטמין A, הפיגמנט הראייתי, אל הפוטורצפטורים. במחזור הראייה, הוא פועל באופן הומאוסטטי כדי לשמור על ההרכב הכימי והנפח של החללים החוץ-תאיים הסובבים אותו.

תכונה קריטית של תאי אפיתל היא הפולריות שלהם. ההובלה הא-סימטרית המתמשכת של חלבונים לממברנות האפיקליות והבזאליות-לטרליות היא תהליך מווסת המאפשר לאפיתל לבצע תעבורה וקטורית של מטבוליטים, יונים ונוזלים מרחב חוץ-תאי אחד למשנהו. פעילות זו מסייעת לאפיתל לשמור על הבריאות והשלמות של הרשתית העצבית.

ההכנה במקום (in vitro) שאתה מתארים כאן מאפשרת את ניתוח חלבוני ההובלה, הקולטנים ומסלולי השיוך הקובעים את הפולריות והתפקוד האפיטלליים לפני תחילת הניתוח. הכין פלטה של 12 בארות במכסה זרימה למינרית עם תמיסות בטמפרטורת החדר. עבור כל עין נדרשת בארה אחת של תמיסת antibiotic antimycotic בריכוז 10x, שתי בארות של 1X PBS ובארה אחת של שתי יחידות למיליליטר של disc space המדולל במצע 5% RPE עם סרום. מלא צלחת ניתוח עם משטח סיליקון ב-1X HBSS, רוקן את הנוזל והעבר כל עין לבארה אחת של תמיסת antibiotic antimycotic.

דגרו למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הימנעו מהפעלת לחץ מוגבר על גלגל העין. שטפו את העין בשני בארות עוקבות של XPBS כדי להסיר שאריות אנטיביוטיקה.

לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להעבירו לצלוחית ניתוח הממולאת ב-one X-H-B-S-S תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לניתוח. השתמשו במספרי איריס כדי להסיר רקמת שריר ורקמה חיבורית עודפת מסביב לעין. יישרו את העין כך שהקרנית תפנה כלפי מעלה.

השתמשו בשתי מחטים סטריליות בכילום 27 כדי לקבע את העין לרפידת הסיליקון באמצעות רקמה מחברת, ללא פגיעה בסקלרה. במצב זה, השתמשו בסכין פתח-צד (side port knife) כדי לבצע חתך דרך הסקלרה. החתך צריך להיות במרחק של שליש מהמרחק שבין קו המשווה של העין למשטח הקדמי.

השתמשו במספרי איריס כדי להמשיך את החיתוך באופן מעגלי מסביב לעין, כדי למנוע נזק לאפיתל הרשתית הפיגמנטית (RPE) עקב משיכה של הוויטריוס לרשתית. השתמשו באותם מספריים כדי לחתוך דרך הגוף הזגוגי (vitreous body) על מנת להפריד את השלוף הקדמי של העין מגביע העין.

הרימו את החלק הקדמי של ה-IOA והשליכו אותו. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את העין הפתוחה אל באר ה-dys. ודאו שאין בועות אוויר בתוך העין.

דגרו למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. העבירו את העין מהחלל המבודד חזרה לכלי הניתוח, שמולא ב-1X HBSS טרי בטמפרטורת החדר. מקמו את העין כאשר הגביע פונה כלפי מעלה ואבטחו אותה באמצעות 2 מחטים במידה של 27 gauge.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה (dissecting microscope), השתמשו בפינצטה עדינה כדי להרים בעדינות את הרשתית שהופרדה חלקית באמצעות מספרי רשתית. גזרו את הרשתית מהעצב האופטי. השליכו את הרשתית בעזרת מספרי קשתית.

בצעו חתך מהיקף העין אל העצב האופטי. הצמידו את העין באמצעות 5 מחטים בכילוב 27. כדי למתוח את שכבת ה-RPE, השתמשו במספרי רשתית כדי לבצע חיתוך מעגלי סביב העצב האופטי.

הפרדת שכבת ה-RPE תוך מעבר להגדלה של 250x או יותר. אתרו את קצה גיליון ה-RPE לאורך החיתוך שבוצע על ידי מספרי האיריס ובסמיכות לעצב האופטי. השתמשו בשני זוגות פינצטות כדי להפריד את ה-RPE ואת קרומי ברוך משכבת רקמת הכורואיד.

נסה מספר אזורים לאורך קצה החיתוך כדי למצוא את הנקודה שבה הקשר בין ה-RPE לדרגורייד (choroid) הוא החלש ביותר. קלף בעדינות את הממברנה לאחור כדי להסירה לחלוטין. העבר את דפי ה-RPE למבחנה קונית של 15 milliliter מלאה ב-trypsin ב-EDTA בטמפרטורת החדר.

לאחר איסוף כל הדפים, סגרו את המבחנה במכסה והדגירו את המבחנות במקלח מים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C. נערה את המבחנה בעוצמה כדי להפריד את ה-RPE לצברים קטנים. היעדר גושים כהים של תאים מעיד על כך שההפרדה הושלמה.

החזירו את המבחנה לאמבט המים למשך חמש דקות נוספות. השתמשו בפיפט פסטור ובשאיבה עדינה כדי להסיר שאריות רקמה שלא התעכלו. סובבו את התאים במ centri-fuge במהירות של 280 5G למשך ארבע דקות.

הסיר את הנוזל העליון. השלם את הנפח הסופי לתשעה מיליליטרים באמצעות מצע 15%RPE בעזרת פיפטה כדי לבצע ריסספנסיה. העבר בעזרת פיפטה שלושה מיליליטרים מתליהית התאים לבקבוק תרבית (flask) של 25 סנטימטר רבוע.

הוסיפו שני מיליליטרים של מצע גידול RPE 15% טרי בטמפרטורת החדר. השאירו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% carbon dioxide. ככל שהתרביות יבשילו, הפיגמנטציה שלהן תעלה לאחר שלושה עד ארבעה שבועות.

תרביות מוצלחות יהיו קונפלואנטיות ובעלות פיגמנטציה חזקה ואחידה. כעת הצגנו בפניכם כיצד להכין תרביות ראשוניות של RP עוברי אנוש. זהו כל התהליך.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.