מודלים ניסויית לחקר פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה פיגמנט רשתית אפיתל

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תרביות של פיגמנט רשתית עוברי אנושי, אפיתל או RPE שיכולים לשמש כמודל. בחקירות של מחלות עיניים אנושיות, רקמות מתקבלות מתורמים ככדורי עין שלמים. השלב הראשון בהליך הוא לקצץ שרירים ורקמות חיבור מיותרות ולאחר מכן לפתוח את העין על ידי הסרת הקרנית והעדשה.

העין מטופלת בדיספה ומשוטחת, ואז מקלפים את שכבת ה-RPE מהכורואיד. גזור. RPE נזרעים לתוך צלוחיות ומגדלים אותם במשך מספר שבועות עד שהם מגיעים לחד-שכבות ומפתחים פיגמנט. תרביות תאים משמשות בניסויים פונקציונליים במבחנה.

ניסויים מוצלחים במבחנה חוזרים על עצמם במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים שבהם ניתן להעריך טוב יותר את תגובות RPE בסביבת איתות מורכבת יותר. המודל המוצג כאן יוביל להבנה טובה יותר של הפיזיולוגיה של RPE והתערבויות טיפוליות חדשות לטיפול במחלות עיניים. שלום, שמי שלדון מילר.

המעבדה שלי ממוקמת במכון העיניים הלאומי, שהוא חלק מהמכונים הלאומיים לבריאות בקמפוס בת'סדה מרילנד. היי, אני ארקי ממעבדת מילר. היום נראה לכם נוהל להכנת תרביות ראשוניות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית עוברי אנושי.

תאים אלה יוכנו כחד-שכבות קונפלואנט שניתן להרכיב בתאי שירה ששונו. נשתמש גם בתאי RPE אנושיים מבודדים אלה למחקרים בביוכימיה ובגנטיקה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להקים תרביות ראשוניות של תאי אפיתל כדי לחקור את התפקוד והוויסות של תהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים ולפתח מודלים קליניים של מחלות בבעלי חיים.

אנו מתמקדים באפיתל פיגמנט הרשתית או RPE, שיושב בחלק האחורי של העין, ומפריד בין הרשתית העצבית לאספקת הדם הכורואידית. הדיאגרמה הסכמטית הזו של העין מראה את המיקום של יריעת ה-RPE בחלק האחורי של העין ממש ליד קולטני האור. התוספת מציגה את תאי הרשתית עם קולטני האור מימין ותאי הגנגליון משמאל.

אפיתל זה פעיל מאוד מבחינה מטבולית. הוא פוגוציטוזיס קולטני אור באופן רציף על בסיס יומי, והוא מאחסן רייס, מיזז ומעביר את הפיגמנט החזותי ויטמין A לקולטני האור. במחזור הראייה הוא פועל באופן הומיאוסטטי כדי לשמור על ההרכב הכימי והנפח של החללים החוץ-תאיים שמסביב.

תכונה קריטית של אפיתל היא הקוטביות שלהם. האספקה הא-סימטרית המתמשכת של חלבונים לממברנות הצדדיות האפיקליות והבסיסיות היא תהליך מוסדר המאפשר לאפיתל לבצע את התנועה הווקטורית של מטבוליטים, יונים ונוזל מחלל חוץ-תאי אחד למשנהו. פעילות זו מסייעת לאפיתל לשמור על בריאות ושלמות הרשתית העצבית.

ההכנה במבחנה שאנו מתארים כאן מאפשרת ניתוח של חלבוני הובלה, קולטנים ומסלולי איתות הקובעים את קוטביות האפיתל ותפקודה לפני תחילת הדיסקציה. הכינו צלחת 12 בארות במכסה המנוע עם תמיסות בטמפרטורת החדר. כל עין דורשת באר אחת של 10 תמיסת אנטיביוטיקה אנטיביוטית, שתי בארות של XPBS אחד ובאר אחת של שתי יחידות למיליליטר של שטח דיסק מדולל במדיום RPE 5% בסרום מלאו צלחת חיתוך מרופדת בסיליקון ב-X-H-B-S-S אחד, רוקנו את הנוזל והעבירו כל עין לבאר אחת של תמיסת אנטיביוטיקה.

יש לדגור במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הימנע מהפעלת לחץ עודף על גלגל העין. יש לשטוף את העין בשתי בארות עוקבות של XPBS אחד כדי להסיר עודפי אנטיביוטיקה.

לאחר מכן השתמש במלקחיים כדי להעביר אותו לצלחת הניתוח המלאה ב-X-H-B-S-S אחד תחת מיקרוסקופ סטריאו מנתח. השתמש במספריים לקשתית כדי להסיר עודפי שרירים ורקמות חיבור סביב העין. יישר את העין כך שהקרנית פונה כלפי מעלה.

השתמש בשתי מחטים סטריליות בקוטר 27 כדי להצמיד את העין ברקמת חיבור מבלי לפגוע בסקלרה לכרית הסיליקון. בכיוון זה, השתמש בסכין יציאה צדדית כדי לבצע חתך דרך הסקלרה. החיתוך צריך להיות שליש מהמרחק מקו המשווה של העין למשטח הקדמי.

השתמש במספריים לקשתית כדי להמשיך את החיתוך בצורה מעגלית סביב העין כדי למנוע נזק לפיגמנט הרשתית. אפיתל, בקיצור RPE על ידי משיכת רשתית זגוגית. השתמש באותם מספריים כדי לחתוך את גוף הזגוגית כדי להפריד בין דש העין הקדמי לכוס העין.

הרם את החלק הקדמי של ה-IOA והשליך אותו. השתמש במלקחיים כדי להעביר את העין הפתוחה לבאר הדי. וודאו שאין בועות אוויר בעין. .

יש לדגור במשך 40 עד 60 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. העבירו את העין מחלל הדיסק בחזרה לצלחת הניתוח, שהתמלאה בטמפרטורת חדר טרייה אחת X-H-B-S-S. מקם את העין כשהכוס פונה כלפי מעלה ואבטח אותה עם 2 מחטים בגודל 27.

מתחת למיקרוסקופ הניתוח, השתמש במלקחיים עדינים כדי להרים בעדינות את הרשתית המופרדת חלקית בעזרת מספריים לרשתית. חתוך את הרשתית מעצב הראייה. השלך את הרשתית עם מספרי הקשתית.

בצע חתך מהיקף העין לעצב הראייה. הצמד את העין החוצה עם 5 מחטים בגודל 27. כדי למתוח את שכבת ה-RPE, השתמשו במספריים ברשתית כדי לבצע חתך מעגלי סביב עצב הראייה.

הפרדת שכבת ה-RPE עוברת להגדלה של פי 250 ומעלה. מצא את קצה יריעת ה- RPE לאורך החיתוך שבוצע על ידי מספרי הקשתית וקרוב לעצב הראייה. השתמש בשני זוגות מלקחיים כדי להפריד את ה-RPE ואת קרום הברוס משכבת הרקמה הכורואידלית.

נסה מספר אזורים לאורך קצה החיתוך כדי למצוא היכן הקשר בין ה-RPE לכורואיד הוא החלש ביותר. מקלפים בעדינות את הממברנה בחזרה כדי להסיר אותה לחלוטין. הנח את יריעות ה-RPE לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר מלא בנסיעות בטמפרטורת החדר ב-EDTA.

כאשר כל הסדינים נאספים, מכסים את הצינור, דוגרים את הצינורות באמבט מים למשך 10 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. נער את הצינור במרץ כדי להפריד את ה-RPE לאשכולות קטנים. אין גושי תאים כהים פירושו שההפרדה הושלמה.

החזירו את הצינור לאמבט המים למשך חמש דקות נוספות. השתמש בפסטר, פיפטה ויניקה עדינה כדי להסיר שאריות רקמה לא מעוכלות. סובב את התאים בצנטריפוגה ב-280 5G למשך ארבע דקות.

הסר את ה-supernatant. הביאו את הנפח הסופי עד תשעה מיליליטר עם פיפטה בינונית של 15% RPE להשעיה. התאים מזרימים שלושה מיליליטר מתרחיף התא לבקבוק בגודל 25 סנטימטר מרובע.

הוסף שני מיליליטר טמפרטורת חדר טרייה, 15% תרבית בינונית RPE. התאים הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. ככל שהתרבויות מתבגרות, הפיגמנטציה שלהן תגדל לאחר שלושה עד ארבעה שבועות.

תרביות מוצלחות יהיו מתכנסות ופיגמנטיות אחידות ואינטנסיביות. זה עתה הראינו לך כיצד להכין תרביות ראשוניות של RP עוברי אנושי. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.