שיטת Hanging Drop: טכניקה ליצירת ספרואידים תלת ממדיים למלנומה

- ספרואידים הם מודלים תלת ממדיים של תרביות תאים במבחנה המחקים את ארכיטקטורת הגידול in vivo ומסייעים לחקור אינטראקציות תוך גידוליות. כדי להגדיר את התרבית, ראשית, להכין תרחיף חד תאי של תאי מלנומה בתווך המתאים שלהם. לאחר מכן, הבחינו בנפחים קטנים של תרחיף תאים זה, בנפרד במידה מספקת על פני השטח הפנימיים של מכסה צלחת תרבית סטרילית ולא דביקה. הפכו בזהירות את המכסה והניחו אותו על בסיס צלחת התרבית המכילה PBS ליצירת תא לחות. דוגרים על הצלחת בתנאים מתאימים.

לחות מ-PBS מונעת אידוי של מדיה מהטיפות התלויות. רעננו את הטיפות על ידי החלפת כמה מיקרוליטרים של מדיה. בשל מתח פני השטח, הטיפות שומרות על צורתן הכדורית ונשארות תלויות מפני השטח הפנימיים של הצלחת. כוחות הכבידה מאפשרים לתאים להישאר בתרחיף מבלי להתפשט אלא מצטברים ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים בתוך הטיפות. לבסוף, שטפו את הטיפות עם PBS כדי לקצור את הספרואידים. אספו אותם בכלי תרבית לא דביק.

בפרוטוקול הבא נדגים יצירת ספרואידים תלת מימדיים של תאי מלנומה 451-LU בשיטת הטיפה התלויה.

- כדי להתחיל, תרבית תאי מלנומה 451-LU באמצעות מדיום RPMI המכיל 10% FCS, על פי פרוטוקולים כלליים של תרבית תאים. כדי ליצור ספרואידים של מלנומה, שטפו את תאי המלנומה בתרבית ב-PBS. לאחר מכן, הוסף 5 מיליליטר של 1x Trypsin-EDTA ב- PBS. יש לדגור במשך 3 עד 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 5 מיליליטר של RPMI המכיל 10% FCS כדי לנטרל את הטריפסין. לאחר מכן, העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות כדי לקצור את התאים. השהה מחדש את גלולת התא בסל"ד המכיל 10% FCS.

לאחר מכן, ספרו את התאים ודללו את תרחיף התא לריכוז סופי של 10,000 תאים למיליליטר. השתמש במולטי-פיפטה אלקטרונית כדי ליצור כתמים של 40 x 25 מיקרוליטר של תרחיף תאים על פני השטח הפנימיים של המכסה של צלחת תרבית תאים סטרילית ולא דבקה של 10 סנטימטרים.

לאחר מכן, הפכו את המכסה בתנועה מהירה וחלקה, והניחו אותו על צלחת תרבית התאים המכילה 5 מיליליטר PBS. תרכבו את הכלים התלויים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו-חמצני למשך 10 עד 14 ימים.

חמישה ימים לאחר איתור הטיפה הראשונית, השתמש במתקן אלקטרוני כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של RPMI המכיל 10% FCS לכל טיפה. לאחר 10 עד 15 ימים, קצרו את הספרואידים על ידי שטיפה עדינה שלהם מהמכסה עם PBS. אספו את הספרואידים בצלחת תרבית תאים טרייה ולא דביקה.