בידוד קרטינוציטים בעור האדם: שיטה לתרבית קרטינוציטים ראשוניים מדגימות עור

- קרטינוציטים הם התאים הבולטים ביותר הנמצאים באפידרמיס, או השכבה החיצונית ביותר של העור. הם מסדרים את עצמם בשכבות מרובות מעל הדרמיס, הקשורות לסוגי תאים שונים אחרים כגון מלנוציטים, תאים דנדריטיים ותאי מרקל.

כדי לבודד keratinocytes, להתחיל על ידי נטילת רקמת האפידרמיס מעור האדם. לאחר מכן, לטפל עם מאגר עיכול אנזימטי. אנזימים במאגר מפרקים את חלבוני המטריקס החוץ-תאיים הנמצאים ברקמת האפידרמיס, ובכך גורמים לדיסוציאציה של התא. כעת, הוסף מדיה מתאימה ושבש מכנית את הרקמה.

כדי לשחרר את התאים המנותקים לתרחיף, סנן את תרחיף תאי האפידרמיס דרך מסננת כדי להסיר גושי תאים או פסולת. צנטריפוגה כדי לכרות את תאי האפידרמיס ולהפריד אותם מהסופרנטנט המכיל אנזים. הסר את supernatant ו resuspend את התאים באמצעות מצע גידול keratinocyte מועדף. תרבית את התאים למשך הזמן הרצוי.

במהלך התרבית, המדיה האופטימלית מעשירה את התפשטות הקרטינוציטים על ידי קידום הצמיחה הסלקטיבית שלהם על פני סוגי תאי האפידרמיס האחרים. בפרוטוקול הבא נראה בידוד של קרטינוציטים מרקמת עור אנושית בוגרת.

- איסוף דגימות עור בגודל 10 ס"מ על 15 ס"מ ממתנדבים בוגרים בריאים שעברו ניתוחים פלסטיים. שמרו על קרירות העור על ידי הובלת דגימות העור בקופסת קלקר המכילה גוף קירור. במידת הצורך, יש לאחסן את דגימת העור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בעזרת מספריים, אזמלים ומלקחיים מעוקרים, הסירו שומן מתחת לחלק העור.

לאחר מכן, באמצעות מחטים, אבזם את החלק העור על כיסוי סטרילי על גבי צלחת. בעזרת פד גזה יבש ומעוקר, נקו את העור. לאחר מכן, יש להמשיך עם אתנול 70% על פד גזה מעוקר. לאחר מכן, באמצעות פלנר כף הרגל, לחתוך את שכבת האפידרמיס העליונה של החלק העור, ולהעביר אותו לתוך צלחת פטרי 9 ס"מ.

לאחר מכן, הוסף מיד 25 מיליליטר של תמיסת DPBS/טריפסין/גלוקוז שהוכנה בעבר לצלחת הפטרי. לדגור על הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. באמצעות פיפטה, הסר את תמיסת DPBS/טריפסין/גלוקוז מצלחת הפטרי והוסף 10 מיליליטר של RPMI-1640 בתוספת 2% FBS כדי להשבית את הטריפסין.

כעת, בעזרת שתי מלקחיים, שחררו את תאי האפידרמיס למדיום על ידי גירוד עדין והתסיסה הן של האפידרמיס והן של תא העור של חלקי העור. מסננים את תרחיף תאי האפידרמיס דרך מסנן מתכת ואוספים את התסנין לתוך צינור 50 מיליליטר. הוסף את חלקי העור הנותרים לצינור 50 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של RPMI-1640 ללא FBS ומערבולת למשך 10 שניות.

סננו את המתלה דרך מסנן המתכת לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל את תרחיף תאי האפידרמיס. לאחר מכן, הוסף DPBS לנפח כולל של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את מתלה התא ב 450 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. לאחר מכן, להסיר את supernatant, בהתאם לגודל של גלולת התא, להשעות מחדש את גלולת תא האפידרמיס בערך 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM.

באמצעות שיטת הצביעה הכחולה טריפאן, ספרו את התאים תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, לכל בקבוק תרבית של 75 סנטימטרים רבועים, מעבירים 8 פעמים 10 לתאים השישיים יחד עם 12 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס KSFM. נערו בעדינות את צלוחיות התרבית כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים. לדגור על הקרטינוציטים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 100% לחות ו-5% CO₂. שנה את המדיום לאחר יומיים, ולאחר מכן, 3 פעמים בשבוע.