גידול מהיר של מלנוציטים ופיברובלסטים ראשוניים של מורין: בידוד מלנוציטים ופיברובלסטים מדגימת עור מורין שלם

- העור מורכב מתאים שונים המאכלסים את שכבותיו השונות. מלנוציטים, התאים מייצרי המלנין, מתמקמים בצומת האפידרמיס-עור, ואילו פיברובלסטים, התאים המייצרים את רקמת החיבור, שוכנים בדרמיס.

כדי לבודד במהירות מלנוציטים ופיברובלסטים, התחל על ידי לקיחת גזע של גור עכבר שעבר המתת חסד. חותכים את העור בגחון לאורך תא המטען. מקלפים את העור המכיל את שכבת האפידרמיס והעור וטוחנים את הרקמה לחתיכות קטנות.

כעת, טפלו עם חיץ עיכול המכיל אנזימי טריפסין וקולגנאז המפרקים את המטריצה החוץ תאית ומשחררים את התאים לתרחיף. צנטריפוגה כדי לפלס את התאים ולהשליך את הסופרנטנט. להשעות מחדש את התאים במדיה מלנוציטים ולהעביר את התרחיף לתוך צלחת multiwell.

במהלך התרבית, רוב הפיברובלסטים נצמדים לקרקעית הבאר, בעוד המלנוציטים ותאי אפידרמיס אחרים נשארים בתרחיף. שאפו את התאים המרחפים והוסיפו מדיה ספציפית לפיברובלסטים לתרבית הפיברובלסטים כדי לקדם את צמיחתם. העבירו את המתלה לבאר מצופה קולגן טרי כדי לסייע ביצירת תרבית דבקה.

יש להוסיף גנטיקה, אנטיביוטיקה ולהוסיף מצע גידול מלנוציטים טרי. גנטיקה מבטלת באופן סלקטיבי את כל הפיברובלסטים שנותרו, בעוד שהתקשורת מקדמת צמיחה של מלנוציטים על פני סוגי תאי אפידרמיס אחרים. בפרוטוקול הבא, נבודד מלנוציטים ופיברובלסטים מעור גור מורין.

- בארון זרימה למינרית, גלגלו לזמן קצר את תא המטען של כל עכבר שעבר המתת חסד בצלחת פטרי סטרילית המכילה 70% אתנול. מוציאים את העכבר מהאתנול ומניחים אותו בצלחת פטרי סטרילית ריקה. לאחר מכן, לעקר מספריים כירורגיים באתנול 70%. השתמש מספריים אלה כדי לבצע חתך בעור בצד הגחוני של תא המטען, החל מהצוואר וממשיך לזנב. בעזרת מלקחיים סטריליים, מקלפים את העור מתא המטען של העכבר ומסירים רקמת שומן עודפת מהצד העורי של העור.

מניחים את העור, דרמיס כלפי מטה, לתוך צלחת 6 בארות המכילה 3 מיליליטר של 1x תרופה אנטיביוטית/אנטי-מיקוטית. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 2 עד 3 דקות. לאחר מכן, הפעל את מסוק הרקמות והתאם את ההגדרות לאלה המוצגות כאן.

- יש להקפיד לנקוט משנה זהירות בעת התקנת להב מסוק הרקמות ובעת הפעלת המכונה.

- מעבירים את העור, צד הדרמיס כלפי מטה, לצלחת מסוק רקמות סטרילית ומעבירים את העור במלואו דרך מסוק הרקמות שלוש פעמים. לאחר מכן, להעביר את העור הומוגני לצינור חרוטי סטרילי 15 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר של חיץ העיכול העור.

באמצעות מיקרופיפטה P1000, מערבבים את המתלה המתקבל על ידי פיפטינג למעלה ולמטה במרץ עשר עד חמש עשרה פעמים. מכסים את הצינור החרוטי ודגרים על הדגימה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, תוך הקפדה על היפוך הצינור כל 3 עד 5 דקות.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ברוטור דלי מתנדנד ב 750 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי pellet את התאים בעור הומוגנט. השתמש מיקרופיפטה P1000 כדי להסיר לאט ולחלוטין את חיץ העיכול של העור, נזהר לא להפריע את הכדור.

- יש להקפיד לשאוף את כל חיץ העיכול של העור. אם אתם נתקלים בבעיות, שטפו את כדורית התא עם 2 עד 3 מיליליטר של מדיה מלנוציטית וחזרו על הצנטריפוגה והסירו עודפי חיץ לעיכול העור.

- לאחר מכן, השהה מחדש ביסודיות את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיה מלנוציטים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה חמש עשרה עד עשרים פעמים עם פיפטה P1000. העבר את תמיסת התא המתקבלת טיפה לבאר לא מצופה בצלחת 6 בארות המכילה 1 מיליליטר של מדיה מלנוציטים. לדגור על העור המצופה הומוגנט באינקובטור תרבית רקמה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 40 דקות.

לאחר מכן, מעבירים את הסופרנאטנט התרבית מהתבשיל הלא מצופה לבאר אחת של צלחת מצופה קולגן מצופה 6 בארות. הוסף G418 למדיה כך שהריכוז הסופי הוא 100 ננוגרם למיליליטר. הוסף 2 מיליליטר של מדיה פיברובלסטים לבאר אחת של צלחת לא מצופה, המכילה כעת פיברובלסטים דבקים. לדגור על שתי התרביות למשך הלילה באינקובטור תרביות רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

לאחר 16 עד 24 שעות של דגירה, שאפו בנפרד את התקשורת ואת כל הפסולת מכל תרבות. שטפו כל צלחת פעמיים, באמצעות מיליליטר אחד של PBS לכל שטיפה. לאחר מכן, הוסף 2 מיליליטר של מדיה מלנוציטים טריים לתרבית המלנוציטים, והוסף 2 מיליליטר של מדיה פיברובלסטים טריים לתרבית הפיברובלסט.