Name: מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למד כיצד למדוד פעילות Calpain בתאים חיים וקבועים באמצעות זרימת cytometry. פרוטוקול זה משתמש בסובסטר פלואורסצנטי BUC, LMC MAC כדי לנטר שינויים בפלואורסצנציה ולזהות פעילות מוגברת בתאי לוקמיה ולימפומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי מענקים מכוני הקנדי לחקר בריאות, לוקמיה לימפומה וחברה של קנדה וקרן לימפומה של קנדה.

הכן ריאגנטים הערה: כל PBS מכיל Ca 2 + ו - Mg 2 + <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור מגיב הוסף 20μM 7-amino-4-chloromethyl coumarin, t-BOC, לאוצין, מתיונין אמיד (BOC-LM-CMAC) לטמפרטורת החדר PBS. כל השעיה תא ידרוש מגיב איתור 2ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde 1% (תאים קבוע) מדולל של 4% מניות paraformaldehyde פתרון בטמפרטורת החדר PBS. Aliquot paraformaldehyde 1mL 1% ל צינור אחד FACS. שלושה צינורות FACS נדרשים עבור כל תנאי הניסוי (דוגמה 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 צורך 9 צינורות FACS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD150606 (מעכב calpain) מחדש PD150606 ב DMSO לריכוז סופי של 100 מ"מ. הגן הזה מגיב וכל תאים שטופלו בו מן האור למשך הניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PD98059 (MEK1 מעכב) מחדש PD98059 ב DMSO לריכוז סופי של 50mm. </li></ol> הכן תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים 32Dkit ב 5 x אוקטובר 05-01 x 10 6 תאים לכל מ"ל Opti-ממ התקשורת בתוספת 5% בסרום שור עוברית, WEHI-3 supernatant כמקור של IL-3 (או כל מקור אחר של IL-3 כאלה כמו חלבון רקומביננטי), 0.1% 2-mercaptoethanol ואנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 12 x 10 6 תאים 32Dkit לשלושה צינורות פלקון 15 מ"ל (4 x 10 6 תאים לכל צינור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב 1000 סל"ד למשך 5 דקות בשעה 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. Resuspend התאים 2ml בטמפרטורת החדר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייחס one ההשעיה תא עם 50μM PD150606. ודא המדגם מוגן מפני אור על ידי כיסוי הצינור פלקון עם רדיד אלומיניום. וורטקס דגירה קצר לאחר מכן עבור 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את ההשעיה התא השני עם 20μM PD98059. פלייט התאים צלחת תרבות 35mm רקמות דגירה עבור 2 שעות 37 ° C. </li></ol> Calpain Assay בתוך תאים קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד דגימות הם דוגרים עם PD150606, להתחיל את assay calpain על דגימות מטופל. בגין על ידי הוספת מגיב איתור 2ml להשעיית כל תא. מיד להוסיף 1mL של ההשעיה תא / מגיב תערובת זיהוי צינורות FACS הכין בעבר עם paraformaldehyde 1% (0 דקות נקודת זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה השעיות תא מגיב עם זיהוי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 1mL ההשעיה לתא צינור FACS עם paraformaldehyde 1mL 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דוגרים השעיות תא בתערובת גילוי 5 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 1mL ההשעיה לתא צינור FACS עם paraformaldehyde 1mL 1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור assay calpain על תאים 32Dkit כי טופלו במעכבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים לילה בחושך ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום גלולה הבא התאים ב 1800 סל"ד למשך 5 דקות בשעה 15 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. Resuspend התאים 750uL PBS. המקום התאים על קרח ולשמור בחושך. </li></ol> רוכשת את הנתונים עבור תאים קבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התאים באמצעות II LSR (BD Bioscience). מסננים מוגדרים עבור Xcyte Lightwave (UV) לייזר, קו עירור 355nm לייזר 25mW כוח, פליטה של ​​405 ו - 450 ננומטר במשך המצע ואת המוצר בהתאמה. לעבור בנד מסננים עבור המצע ואת המוצר הם 405/20 ו - 450/50. מסננים לעבור לונג על המצע ואת המוצר הם 405 ו 450. מתח PMT נקבע על 350-375 ו 325-350 על מצע עבור המוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת ניסוי BD FACSDiva עם הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה, פיזור צד; ההודו-1 כחול (יומן); ההודו-1 ויולט (יומן). בגליון העבודה להגדיר את הגרפים הבאים: פיזור קדימה לעומת פיזור נקודה בצד המגרש עם שער על תאים חיים (איור 1 א), הודו-1 היסטוגרמה כחול, הודו-1 היסטוגרמה ויולט, הודו-1 כחול מול הודו-1 ויולט העלילה נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את השנייה עם LSR AlignFlow ו AlignFlow בתוספת חרוזי ניאון (Invitrogen). מתח PMT צריך להיות מותאם למקום השיא של ההיסטוגרמה הקרינה חרוז באותו ערוץ לפני כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכישת נתונים באמצעות תאים 32Dkit בנקודת זמן 0 דקות. התאם את מתח הפרמטר לפי הצורך. רוכשת ולהקליט 10,000 אירועים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הרכישה עבור כל דגימה, שטיפה במכונה עם FACS חיץ בין צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא הנתונים. ודא LSR II הוא ניקה על פי הנחיות המכון. </li></ol> Calpain Assay בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המתלים תא כאמור לעיל, ללא PD150606. תביאו את דגימות את השנייה LSR ולהקים מסננים הפרמטרים לעיל. הגדר את גליון לעיל. כלול מזימה נקודה גדולה מראה ההודו-1 כחול נגד הזמן. הגדר את תוכנית לרכוש את num מקסימליתבער של אירועים (אין שער להפסיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50μM PD150606 אחד ההשעיה התא של תאים 32Dkit. שמור על מדגם בחושך דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין רכישת מידע על ההשעיה תא 32Dkit ללא PD150606. השתמש ספיקה נמוכה של 200-300 אירועים בשנייה. לאחר 30 שניות עד דקה 1 להסיר את הצינור מהמכונה. הוסף 20μM BOC-LM-CMAC אל התאים. וורטקס בקצרה ולאחר מכן להמשיך לרכוש את הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים עבור 10-20 דקות או עד מישורים את הפעילות calpain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3 ו - 4 עם תאים 32Dkit שטופלו PD150606. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא הנתונים. ודא LSR II הוא ניקה על פי הנחיות המכון. </li></ol> Calpain Assay ב (מעורב) אוכלוסיות מורכבות Cell * ניסוי זה יהיה לזהות תאים 32Dkit ההשעיה תא שנקטפו מן הטחול עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את הטחול מהעכבר כל אחד. Lyse תא דם אדום עם NH 4 Cl במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן השעיות תא יחיד 2ml PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים כל השעיה התא לשניים. פנקו 1 ההשעיה תא עם 50μM PD150606 עבור 20-30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לעיל עבור Assay Calpain בתוך תאים קבוע (שלבים 1-6) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. לשטוף את התאים 500μL PBS. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים חיץ מכתים 200μL עם BSA 2%. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן הראשוני (FITC אנטי עכבר CD117). הנוגדן אמור לשמש בדילול 1:200 ב מכתים חיץ. ודא את הנוגדן נשמרת בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נוגדן ראשוני 200μL אל התאים. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 400μL PBS להגדיל את היקף עבור cytometry הזרימה. מניחים את התאים על הקרח ולשמור בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כמתואר רוכשת את הנתונים עבור תאים קבוע. הוסף FITC את הפרמטרים כוללים היסטוגרמה עבור FITC בגליון העבודה. </li></ol> ניתוח תוצאות נציג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים באמצעות FlowJo (Treestar). שער על תאים חיים המבוסס על פרופיל פיזור קדימה בצד (איור 1 א). קבע את הקרינה מתכוון הודו כחול מהשער תא קיימא (איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) אוכלוסיית תאים משולבים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש FITC הקרינה על מגרשים histograms ו נקודה כדי לזהות את האוכלוסייה 32Dkit </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הקרינה מתכוון הודו כחול של האוכלוסייה 32Dkit </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב-Microsoft Excel כדי הגרף הקרינה אומר (איור 2 א). חשב את השיפוע של הקו בין 5 ל 10 דקות. שיפוע גרף בצורת תרשים עמודות כדי לקבוע פעילות calpain בתאים (איור 2b). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="איור 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1a"> איור 1a. קביעת תאים חיים המבוסס על פרופיל פיזור קדימה בצד. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="איור 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1b"> איור 1b. שינוי ממוצע הקרינה לאורך זמן 10 דקות. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="איור 2א" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2a"> איור 2 א. נציג גרף של הקרינה מתכוון. <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="איור 2ב" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2b"> איור 2b. Calpain פעילות בתאים 32Dkit עם מעכבי.

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפעילות calpain בתאים 32Dkit קבוע וחיים נקבע בפרוטוקול הווידאו הזאת. טיפול קו התא עם מעכב calpain PD150606 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. בנוסף, טיפול מעכב MEK1 PD98059 הביא עיכוב מלא של פעילות calpain בתאים. ERK הוא activator העיקריים של calpain-2 3. התוצאות מראות כי calpain-2 הפעילות העיקרי בתאי 32Dkit. עבודה נוכחי במעבדה שלנו היא חוקרת את ההשלכות של פעילות מוגברת calpain את תרומתם של calpain-1 ו-2 calpain ב לוקמיה. <p class="jove_content" style=";text-al...

<table><tbody><tr><td>PBS
BOC-LM-CMAC
4% פראפורמלהיד (paraformaldehyde)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;המס 4 גרם פאראפורמאלדהיד ב-100 מ"ל PBS. תחת מapay, חמם את הדגימה תוך כדי ערבוב עד להגעה לשקיפות.&lt;br/&gt;יש להניח לקרר ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורה של 4°C&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>השתמשו ב-PD150606 ששוחזר טרי כדי להשיג עיכוב מקסימלי של קלפאין.</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות FACS של AlignFlow, AlignFlow פלוס חרוזים פלואורסצנטיים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;בניסויים אלו נעשה שימוש בתעלוק של תאי WEHI-3 כמקור ל-IL-3. כל מנת איסוף של תעלוק WEHI-3 עוברת תיטור כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי המשמש לצמיחת תאי 32Dkit. </td></tr></tbody></table>

מדידת פעילות calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains נמצאים בכל מקום תאיים, סידן רגיש, פרוטאזות ציסטאין נייטרלי<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains ממלאים תפקידים מכריעים תהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל איתות, שיפוץ cytoskeletal, רגולציה של אפופטוזיס ביטוי גנים התקדמות מחזור התא<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpains היו מעורבים רבים, כולל מחלות dystrophies שרירים, סרטן, סוכרת, אלצהיימר וטרשת נפוצה<sup&gt; 1</sup&gt;. Calpain תקנה מורכב מובנת. רמות ה-mRNA וחלבון לתאם היטב עם פעילות, הגבלת שימוש בטכניקות של גן או חלבון הביטוי כדי למדוד את פעילות calpain. פרוטוקול זה מפרט וידאו assay תזרים cytometric שפותחו במעבדה שלנו למדידת פעילות calpain בתאים חיים קבוע. שיטה זו משתמשת המצע פלורסנט BOC-LM-CMAC, אשר ביקע במיוחד על ידי calpain, כדי למדוד את פעילות calpain.<sup&gt; 2</sup&gt; בסרטון הזה, פעילות calpain ב קבוע וחיים Murine לוקמיה תאים 32Dkit, לבד או כחלק אוכלוסייה splenocyte נמדדת באמצעות LSRII (BD Bioscience). תאים 32Dkit הם הראו פעילות גבוהות לעומת splenocytes נורמלי.

מאמר זה יפרט את הפרוטוקול למדידת פעילות calpain בתאים קבועים חי באמצעות cytometry הזרימה.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

קלפאינים (Calpains) הם פרוטאזות ציסטאין ניטרליות, רגישות לסידן, הנמצאות בכל תא 1. לקלפאינים תפקידים מכריעים בתהליכים פיזיולוגיים רבים, ...

קלפאינים (Calpains) הן פרוטאוזות סיסטאין ניטרליות, רגישות לסידן תוך-תאי ונפוצות, הממלאות תפקידים מכריעים בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל העברה של אותות, עיצוב מחדש של השלד התאי, בקרה על ביטוי גנים, אפופטוזה והתקדמות מחזור התא. כדי למדוד את פעילות הקלפאין בתאים מקובעים ובחיים, מוסיפים את הסובסטרט הפלואורסצנטי BUC, LMC MAC. Buc LMC MAC נחתוך באופן ספציפי על ידי קלפאין, מה שמוביל לעלייה בפלואורסצנציה. השינוי בפלואורסצנציה מנוטר באמצעות ציטומטריה של זרימה, אשר חושפת פעילות קלפאין מוגברת בתאי 30 2D kit בהשוואה לתאי cytes נורמליים.שלום, אני כריסטינה פאר מהמעבדה של ד"ר סטיוארט ברגר באוניברסיטת טורונטו, מהמחלקה לאימונולוגיה ומרשת הבריאות האוניברסיטלית. היום אראה לכם כיצד למדוד פעילות של calpain בתאים מקובעים ובתאים חיים באמצעות בדיקה המבוססת על ציטומטריה זרימה. אנו משתמשים בבדיקה זו במעבדה שלנו כדי לבחון את פעילות ה-calpain בתאי לוקמיה ולימפומה.בואו נתחיל. לפני תחילת הניסויים, הכינו את הריאגנטים הדרושים, כולל ריאגנט גילוי 1% PARAFORM aldehyde cal pain inhibitor PD 1 50 0 6 0 6, ו-MEC one inhibitor PD 9 8 0 5 9. לפרטים על הכנת ריאגנטים אלו, עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף. העבירו מיליליטר אחד של 1%para formaldehyde לכל מבחנה.עבור התאים המקובעים המוצגים בסרטון זה, נדרשות שלוש מבחנות fax לכל תנאי ניסויי. נבדקים שלושה תנאים, ולכן דרושות תשע מבחנות fax. התחילו עם 32 תאי dki בריכוז של 0.5 עד פעם אחת 10 של ששת התאים למילליטר שגדלו במצע אופטימלי.תוספת של סרום עגל עוברי, IL-3, tumor capto ethanol ואנטיביוטיקה. העבר 4×10⁶ תאים לכל אחד משלושה מבחנות פאלקון בנפח 15 מיליליטר. הנח את המבחנות בצנטריפוגה והשק תאים על ידי סבוב ב-225 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורה של 15 °C.לאחר הסנטריפוגה, שאבו את העלייה (supernatant) והשאיבו את התאים בשני מיליליטר של PBS בטמפרטורת החדר. טיפלו בתמיסת תאים אחת עם 50 µM של מעכב קלפאין PD 150606. ודאו שהמדגם מוגן מאור על ידי כיסוי המבחנה בנייר אלומיניום. ערבבו קצר במכשיר וורטקס (Vortex) ולאחר מכן הדגרו למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.טפל בתרחיף התאים השני באמצעות 20 µM של מעכב MEK, PD 9059. זרע את התאים בצלחת תרבית רקמות של 35 mm והדגר אותם למשך שעתיים ב-37 °C בזמן שהדגימות עוברות הדגרה. התחל בבדיקת ה-Calpain על הדגימות שלא טופלו.התחילו בהוספה של שני מיליליטר של ריאגנט זיהוי לת сусפנסיית התאים. העבירו מיד אחד מיליליטר של תערובת ריאגנט הזיהוי עם סספנסיית התאים למבחנות ה-fax שהוכנו מראש, כדי ליצור את דגימת ה-T equals zero. דגרו את סספנסיית התאים עם ריאגנט הזיהוי למשך חמש דקות.בטמפרטורת החדר, העבירו מיליליטר אחד של תערובת ריאגנט הגילוי של תרחיף התאים אל נבובת ה-fax שהוכנה מראש עם מיליליטר אחד של 1% paraform aldehyde, כדי להפיק את דגימת ה-T השווה ל-5. המשיכו לדגור את שאר תרחיפי התאים עם תערובת הגילוי למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, העבירו מיליליטר נוסף של תרחיף התאים לנבובת fax מוכנה עם מיליליטר אחד של 1% Paraform aldehyde.זוהי נקודת הזמן T שווה ל-10 דקות. כעת, חזרו על בדיקת ה-cal pain ב-30 תאי 2D kit שטופלו במעכבים. כסו את הסטנד (rack) בנייר אלומיניום.קבעו את התאים למשך לילה בחושך בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, שקיעו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה ב-725 Gs למשך חמש דקות ב-15 °C. לאחר הסבב, שאבו את supernatant ולאחר מכן השהו את התאים ב-750 µL של PBS.הניחו את התאים על קרח ושמרו אותם בחושך עד למועד ביצוע הסייטומטריה של הזרימה. כאן, רכישת הנתונים מודגמת עבור תאים מקובעים. בצעו סייטומטריה של זרימה באמצעות LSR two.הגדירו את המסננים עבור קו העירור של גל האור (ex excite) או לייזר UV ל-355 nanometers ואת הספק הלייזר ל-25 milliwatts, עם פליטה של 405 ו-450 nanometers עבור התסבס והמוצר בהתאמה. מסנני ה-BAM pass שבהם נעשה שימוש עבור התסבס והמוצר צריכים להיות 405 over 20 ו-450. מסנני longpass עבור התסבס והמוצר צריכים להיות 405 ו-450 over 50.כוון את מתח ה-PMT ל-350 עד 375 עבור התסבסיר (substrate) ול-325 עד 350 עבור המוצר. הגדר ניסוי ב-BD FACSDiva עם הפרמטרים הבאים: פיזור קדימה (Forward scatter), פיזור צדי (side scatter), Indo one blue באמצעות סולם לוגריתמי, ו-one violet.השתמשו גם בסולם לוגריתמי בגיליון העבודה. הגדירו את הגרפים הבאים: תרשים פיזור של פיזור קדמי (forward scatter) מול פיזור צדדי (side scatter) עם שער (gate) לתאים חיים.היסטוגרמה של Indo one blue, היסטוגרמה של Indo one violet ותרשים פיזור של Indo one blue מול Indo one violet מכיילים את ה-LSR two באמצעות חרוזי line flow ו-line flow plus פלואורסצנטיים. יש לכוון את מתח ה-PMT כך ששיא ההיסטוגרמה של פלואורסצנציית החרודים ימוקם באותו הערוץ לפני כל ניסוי. התחל באיסוף נתונים באמצעות תאי ה-30 2D kit בנקודת הזמן של 0 דקות.כוון את מתחי הפרמטרים לפי הצורך. רכוש והקלט 10,000 אירועים לכל דגימה. שטוף את המכשיר עם fax buffer וחזור על הרכישה עבור כל דגימה.ייצאו את הנתונים לאחר רכישת הנתונים. ודאו כי ה-LSR two נקי בהתאם להנחיות המוסד. הכינו את תרחיפי התאים כפי שנעשה קודם לכן, ללא הוספת רכיב הגילוי או מעכב ה-cal pain.העבירו את הדגימות למכשיר ה-LSR two והגדירו את המסננים והפרמטרים כפי שנעשה קודם לכן. הגדירו את גיליון העבודה כפי שנעשה קודם לכן. כללו תרשים פיזור (dot plot) גדול המציג את Indo one blue מול הזמן.הגדירו את התוכנית כך שתקלוט את מספר האירועים המקסימלי. ללא שער עצירה (stop gate). הוסיפו 50 µM של מעכב קלפאין (calpain inhibitor) לתליה אחת של תאי 32 G kit.שמרו את הדגימה בחושך והדגירו אותה בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות בזמן שהתאים מדגברים. התחילו באיסוף נתונים של תרחיף התאים מהערכה ה-30 2D ללא מעכב cal pain. השתמשו בקצב זרימה נמוך של 200 עד 300 אירועים לשנייה.לאחר 30 שניות עד דקה אחת, הוצא את המבחנה מהמכונה. הוסף 20 µM של Bach LMC mac לתאים. זהו ריאגנט הגילוי.הוא נחתך באופן ספציפי על ידי calpain, וחיתוכו גורמת לעלייה בפלואורסצנציה של הסובסטרט. ערבבו במערבל (vortex) לזמן קצר ואז המשיכו ברכישת הנתונים. רכשו נתונים למשך 10 עד 20 דקות או עד שפעילות ה-cal pain מגיעה לרמה קבועה (plateau).בשלב הבא, חזרו על הרכישה עם 32 תאי gki שטופלו במעכב calpain. עם הסיום, ייצאו את הנתונים לצורך ניתוח. התחילו את בדיקת התאים המעורבים עם תרחיף תאים שהופק מטחול של עכבר.חלקו כל תרחיף תאים לשני חלקים. טפלו בתרחיף תאים אחד ב-50 micromolar של מעכב calpain, כסו בנייר אלומיניום והדגירו למשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך. לאחר ביצוע בדיקת ה-calpain כפי שתוכננה בעבר עבור תאים מקובעים, כסו את המבחנות בנייר אלומיניום והדגירו את התאים למשך הלילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלסיוס, בחושך.ביום למחרת, סובבו בצנטריפוגה ב-725 Gs למשך חמש דקות ב-15 °C. שאבו את הנוזל העליון, שטפו את התאים ב-500 µL של PBS ושאבו שוב את הנוזל העליון. השביחו מחדש את התאים ב-200 µL של תמיסת צביעה עם 2% BSA והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את הנוגדן הראשוני, ZI anti-US.מכינים CD one 17 בבופר צביעה כך שמהילול הסופי יהיה 1 ל-200. יש לוודא שהנוגדן נשמר בחושך. מוסיפים 200 µL של נוגדן ראשוני לתאים ומדגירים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.לאחר מכן, הוסיפו 400 µL של PBS כדי להגדיל את הנפח עבור ציטומטריית זרימה. הניחו את התאים על קרח ושמרו אותם בחושך. רכשו נתונים באמצעות אותו הליך ציטומטריית זרימה שהוצג עבור תאים מקובעים.הוסיפו את ZI לפרמטרים וכללו היסטוגרמה עבור ZI בגיליון העבודה לאחר רכישת הנתונים בציטומטר הזרימה. בצעו ניתוח באמצעות FlowJo על תאים חיים על בסיס פרופיל פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור פנימי (side scatter). קבעו את ממוצע הפלואורסצנציה עבור Indo Blue מתוך שער התאים החיים.בגרף זה, הקו האדום מציין את ממוצע הפלואורסצנציה של הסובסטרט בדקה 0, והקווים הכחול והירוק מציינים את ממוצע הפלואורסצנציה של הסובסטרט לאחר 5 ו-10 דקות. עבור אוכלוסיית התאים המעורבת, השתמשו בפלואורסצנציית FXI בהיסטוגרמות ובסממנים של גרף נקודות (dot plots) כדי לזהות את אוכלוסיית 30 2D kip. קבעו את ממוצע הפלואורסצנציית endo blue של אוכלוסיית 30 2D kip.לבסוף, השתמש ב-Microsoft Excel כדי להוציא גרף של ממוצע הפלואורסצנציה. חשב את השיפוע של הקו בין דקה 5 לדקה 10. הצג את השיפוע כגרף עמודות כדי לקבוע את פעילות ה-cal pain בתאים.הנתונים המוצגים כאן מעידים כי ב-30 תאי 2D ישנן רמות גבוהות של פעילות calpain וכי ניתן לעכב את פעילות ה-calpain באמצעות מעכבי MEK. כעת הצגנו כיצד למדוד פעילות calpain בתאים מקובעים ובתאים חיים. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב להגדיר את ה-LSR two בצורה נכונה ולכייל את המכשיר באמצעות חרוזי פלואורסצנציה.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

measuring-calpain-activity-in-fixed-and-living-cells-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את התיוג של תאים עצביים עם נוגדנים לקומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית, חלבון הקשור ל-DNA מיטוכונדריאלי וחלבון הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, ואחריו זרימה ציטומטרית כדי לכמת את רמותיהם.

מדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים בתאי עצב באמצעות זרימה ציטומטרית

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

פרוטוקול זה מתאר בדיקת ציטוטוקסיות רגישה מבוססת תאים. על ידי ספירת הירידה בתדירות של תאי CD4+ T מטרה חיים בנוכחות מספר הולך וגדל של תאי CD8+ T אפקטיביים, בדיקה זו מאפשרת הערכה ישירה של הפעילות הציטוליטית של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן.

בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת תאים למדידת פעילות ציטוטוקסית

סידן הוא מעורב במסלולי איתות פיסיולוגיים וpathophysiological רבות. הדמיה תא חי דורשת ציוד מיוחד ויכולה להיות זמן רב. שיטה מהירה, פשוטה באמצעות cytometer זרימה לקבוע שינויים יחסי בסידן cytosolic בתאי האפיתל חסיד הביאו להשעיה הייתה מותאמת.

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.

קביעת פני התא יחסית והביטוי סה&quot;כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה

Mitophagy, השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה, היה מעורב הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי, הוא deregulated למחלות אנושיות שונות. עם זאת, שיטות נסיוניות נוח למדידת פעילות mitophagy מוגבלים מאוד. כאן, אנו מספקים וזמינותו רגיש למדידת פעילות mitophagy באמצעות cytometry זרימה.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

מתן רגישות מתא בודד, cytometry זרימה בזמן אמת הוא לצורכיכם לכמת קולטן עם מודאלים מרובים פונקציות של תרבויות חיים. באמצעות ובתאים עצבית למבוגרים, הפונקציה קולטן P2X7 הוערכה באמצעות זרם סידן זוהה על ידי סידן אינדקטור, היווצרות נקבובית transmembrane על-ידי אתידיום ברומיד ספיגת ולאחר phagocytosis באמצעות חרוזים לייטקס פלורסנט.

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

כאן, אנו מתארים קבוצה של שיטות לאפיון האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות של תאים או microvesicles.

ניתוח האינטראקציה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית עם מיקרו-וסיקלים מלאכותיים של פוספוליפידים באמצעות ציטומטריה כמותית של זרימה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות למדידת פעילות הקספז באמצעות מצע פלואורוגני באמצעות ציטומטריית זרימה או ספקטרופלואורומטר.

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות הישרדות לאחר לחץ בדגימות שמרים. הבדיקה משתמשת בשני צבעים פלואורסצנטיים, SYTO 9 ופרופידיום יודיד (PI), כדי לכמת את שלמות קרום הפלזמה. הוא משתמש בזרימה ציטומטרית כדי לספק הערכות כמותיות וניתנות לשחזור של חלקי התאים החיים, המתים והפגומים עבור דגימות פוסט-מתח חמצוני.

בדיקת LIVE/DEAD אופטימלית בשילוב עם ציטומטריית זרימה לכימות הישרדות לאחר מתח בתאי שמרים

למד כיצד למדוד פעילות Calpain בתאים חיים וקבועים באמצעות זרימת cytometry. פרוטוקול זה משתמש בסובסטר פלואורסצנטי BUC, LMC MAC כדי לנטר שינויים בפלואורסצנציה ולזהות פעילות מוגברת בתאי לוקמיה ולימפומה.

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

גלה סרטונים נוספים