Name: הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למדו כיצד לייצר וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמידי על ידי טרנספקציה לתאי 293T ו-MDCK. שיטה זו מאפשרת למחקרי וירולוגיה לחקור ביולוגיה של השפעת ולפתח חיסונים פוטנציאליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצה להודות לחברי בעבר ובהווה של אדולפו גרסיה-סאסטרה ופיטר Palese מעבדות לפיתוח טכניקות שפעת הפוך גנטיקה פלסמידים. מחקר AG-S מעבדות ממומנת בחלקה על ידי נכה, מרכז NIAID במימון מצוינות למחקר שפעת ומעקב (HHSN266200700010C) וכן על ידי מענקים NIAD R01AI046954, U01AI070469 ו P01AI058113. מחקר LM-S מעבדה ממומנת חלקית על ידי מענק NIAID RO1AI077719.

<ol><li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li>
<li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li>
<li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+influenza+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li>
<li>Palese, P., Shaw, M. L. Orthomyxoviridae. The viruses and their replication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalese%2C+P+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. H. , 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins. PA, USA. 1647-1689 (2006).</li>
<li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li>
<li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

הר סיני הספר לרפואה של בעל זכויות הקניין הרוחני בתחום של נגיפי שפעת רקומביננטי, AG ו-S הוא ממציא בקניין רוחני זה.

ההצלה של נגיפי שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד הוא תהליך פשוט וברור פעם פרוטוקול מבוצע באופן שגרתי במעבדה, אבל בהתחלה, דברים רבים יכולים להשתבש. זה הכרחי להיות הכנה טובה פלסמיד כדי ליצור את הנגיף. תחזוקה נכונה של שורות תאים (293T ו MDCK) הוא חיוני להצלת ויראלי מוצלח. באופן מסורתי, תג גנטי מוחדר שפעת הגן קידוד פלסמיד, על ידי mutagenesis שקט. מבוא של מוטציה זו שותק (ים) ויצירת, למשל, הגבלה רומן אתר אנזים המשמש להבחין בין wild-type ו - וירוס השפעת רקומביננטי על ידי אנזים העיכול. לכן, לא...

שורות תאים 293T (מספר קטלוג CRL-11268) ו MDCK (מספר קטלוג CCL-34) שורות תאים נשמרות 37 ° C חממה עם 5 CO 2% DMEM 10% FBS, PS 1%. תאים הם צורה זמין סוג התרבות האמריקאית אוסף (ATCC, 10801 אוניברסיטת שדרות, Manassas, VA. 20110-2209 ארה&quot;ב). עוף וביצים Embryonated Embryonated 10 יום בן ביצי תרנגולת ניתן לקבל צ&#39;ארלס ריבר מעבדות, העופות ספציפי פתוגן אגרת התשלום (SPAFAS) העופות מוצרים ושירותים. פרנקלין מלאי, 106 כביש 32, צפון פרנקלין, CT 06254 ארה&quot;ב. ביצים מודגרת ב 37 ° C הקודמת ואחרי זיהום ויראלי. לפני ואחרי זיהום ויראלי, בדק את הביצים כדי לקבוע את הכדאיות של העוברים. חשוב מאוד לחפש ביצים מת לפני ואחרי זיהום ויראלי. לפני זיהום ביצה מת ניתן הבחין בקלות על ידי בהעדר כלי הדם, כמו גם העדר ניידות העובר. כאשר בדק את, עוברים לגור לזוז. לאחר זיהום ויראלי ביצה מת (כנראה קשור זיהום בנגיף שפעת) יהיה הבחין בקלות על ידי הופעתו של ביצה רע כפי שהוא נראה על ידי נפח קטן של נוזל דם allantoic. אינפקטד, ביצים מושלכות בשקיות autoclavable כפול autoclaved הבאים נהלים סטנדרטיים. עוף אדום דם תאים (RBC) עוף RBC ניתן לרכוש חוות Truslow, 201 כביש בעמק, Chestertown, MD 21620. חנות ב 4 ° C. עבור מבחני HA, לשטוף 5 מ&quot;ל של RBC עוף עם 45 מ&quot;ל של PBS 1X בצינור צנטריפוגה 50 מ&quot;ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1000 rpms, RT. מחק בזהירות את supernatant ולהשתמש דילול 1:1000 של RBC pelleted ב PBS 1X (הריכוז הסופי של RBC 0.5-1.0%). תרבות רקמות ונוזלים supernatants allantoic שניהם, תרבות supernatants רקמות ונוזלים allantoic ניתן לאחסן 4 ° C למשך תקופה קצרה של זמן. לאחר אישור הצלה וירוס, וירוסים supernatants תא או נוזל allantoic מאוחסנים ב -80 ° C. פלסמידים כל פלסמידים מוכנים באמצעות המלצות maxi פלסמיד ערכת הבא של היצרן. פלסמידים כל aliquot בריכוזים של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב DDH 2 O ו המאוחסן ב -20 ° C. עבור אחסון לטווח קצר, פלסמיד ניתן לשמור על 4 ° C. הריכוז של ה-DNA פלסמיד מטוהרים נקבעת על ידי לספקטרופוטומטריה ב 260 ננומטר, עם טוהר להיות מוערך באמצעות יחס 260:280 ננומטר. תכשירים עם 260:280 יחס 1.8-2.0 ננומטר נחשבים הופקע למטרות הצלה וירוס. בנוסף, ריכוז טוהר פלסמיד ויש אישר agarose עם ג&#39;ל כרומטוגרפיה. Ambisense pDZ פלסמידים (6) המכיל שמונה שפעת A/PR/8/34 גנים ויראליים (7) הן באיור 2. וירוסים הפרוטוקול המתואר להצלת שפעת A/PR/8/34 יכול להתבצע תחת biosafety רמה (מנהלת הליגה) 2 תנאים. חומר מזוהם, כולל תרבות supernatants רקמות ביצים embryonated, יש לעקר לפני סילוק. ההצלה של וירוס השפעת אחרים עשויים לדרוש תנאים מנהלת הליגה גבוהה יותר, ולכן, תנאים מיוחדים / מדידות הביטחון יהיה צורך אחר. תרבות רקמות התקשורת ופתרונות DMEM 10% FBS PS 1%: 445 מ&quot;ל מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM), 50 מ&quot;ל של סרום שור עוברית (FBS), ו - 5 מ&quot;ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין (PS). חנות ב 4 ° C. מדיה זה ישמש כדי לשמור על התאים 293T ו MDCK וכן transfections. DMEM BA 0.3% 1% נ.ב.: 495.7 מ&quot;ל של DMEM, 4.3 מ&quot;ל של 35% שור אלבומין (BA). חנות ב 4 ° C. רק לפני השימוש, מוסיפים טריפסין TPCK שטופלו לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. זיהומיות התקשורת. פוספט 10X שנאגרו מלוחים (PBS): 80 גרם של NaCl, 2 גרם של KCl, 11.5 גרם של Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 2 גרם של KH 2 PO 4. הוסף DDH 2 O עד 1 ליטר. התאם ל-pH 7.3. לעקר ידי החיטוי. אחסן בטמפרטורת החדר. 1X PBS: 10X PBS לדלל 1:10 עם DDH 2 O. לעקר ידי החיטוי ולאחסן בטמפרטורת החדר.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-dna פלסמיד

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

מאמצים על ידי מספר קבוצות מחקר שפעת כבר מרכזי פיתוח ושיפור של שפעת A גנטיקה הפוכה וירוס. הוקמה במקור בשנת 1999<sup&gt; 1,2</sup&gt; פלסמיד טכניקות מבוססות גנטית הפוכה לייצר וירוסים רקומביננטי חוללו מהפכה בתחום המחקר שפעת בגלל שאלות ספציפיות כבר ענה על ידי הנדסה גנטית, וירוסים זיהומיות שפעת רקומביננטי. מחקרים אלה כוללות שכפול הנגיף, פונקציה של חלבונים נגיפיים, התרומה של מוטציות ספציפיות חלבונים נגיפיים שכפול נגיפי ו / או בפתוגנזה ו, גם, וקטורים ויראליים באמצעות נגיפי שפעת רקומביננטי לבטא חלבונים זרים<sup&gt; 3</sup&gt;.

הצלה של שפעת וירוסים מ-DNA פלסמיד היא טכניקה ניסויית בסיסי וחיוני המאפשר לחוקרים שפעת לייצר וירוסים רקומביננטי ללמוד היבטים מרובים הביולוגיה של נגיף השפעת, וכן לשמש וקטורים או חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

מאמציה של מספר קבוצות מחקר בתחום השפעת היו מכריעים בפיתוח ובשיפור הגנטיקה ההפוכה של נגיף השפעת A. במקור...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להפיק נגיף שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמי. דבר זה מושג על ידי טרנספקציה של שמונה פלסמי DNA המקודדים לגנים של השפעת לתוך תרבית משותפת של תאי 2 9 3 t ותאי MDCK, תוך שימוש ב-Lipectomy 2000 כשלב שני. העלייה של תרבית הרקמה תשמש להדבקת תאי MDCK טריים ו/או ביצי עוף מושבחות בנות 10 ימים, אשר יעצימו את הנגיף הנוכח בעלייה מהתאים שעברו טרנספקציה.בשלב הבא נאסוף את העילאיים (supernatants) של תרביות הרקמה ואת הנוזל אלנטואי (allantoic fluid) מביצי רפאים של עוף שהודבקו. על מנת לאשר את נוכחות הנגיף באמצעות בדיקת HA, מתקבלות תוצאות המעידות על נוכחות הנגיף בהתבסס על הופעת אגלוטינציה. שלום, אני לואיס מרטינז ריטו מהמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת רוצ'סטר.היום אני אראה לכם כיצד להפיק וירוסי שפעת רקומביננטיים מ-DNA פלסמידי. אנו משתמשים בטכניקה זו במעבדה שלנו כדי לחקור היבטים מרובים בביולוגיה של נגיף השפעת וכדי לפתח וקטורים וחיסונים פוטנציאליים. אז בואו נתחיל.לפני תחילת הטרנספקציה, יש לחמם ל-37°C את ריאגנטים תרבית התאים: תמיסת סליין פוספטית מאוזנת ריכוז 1X, PBS-EDTA, טריפסין ומצע DMEM של KO בתוספת 10% FBS (סרום בקר עוברי) ו-1% PS (פניצילין-סטפטומיצין). לאחר מכן, הכין 250 µL של מצע Opti-MEM ו-6 עד 8 µL של LPF 2000 עבור כל טרנספקציה, והדגש בטמפרטורת החדר למשך 5 עד 1

generation-of-recombinant-influenza-virus-from-plasmid-dna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הכינו תרחיפי תאים בודדים של תאי HEK293FT (בצפיפות של 9 x 10^5 למ"ל) בתווך DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) מלא (טבלה 1). הוסיפו 10 מ"ל מהתרחף התאים הבודדים לבקבוק T75, והדגרימו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% פחמן דו-חמצני (CO2) למשך 20 שעות לפני הטרנספקציה.

ייצור פסאודו-וירוס באמצעות טרנספקציה של פלסמיד בתאים אנושיים

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

סרטון זה מדגים את היווצרותם של חלקיקים דמויי נגיף שפעת (VLPs) במערכת יונקים. לאחר שהם מבטאים שלושה וקטורי ביטוי אאוקריוטים – המקודדים חלבונים מבניים נגיפיים שונים – בתאים מארחים מתאימים של יונקים, החלבונים הנגיפיים המבוטאים מתאספים בעצמם ל-VLPs על קרום הפלזמה המארח ומשחררים באמצעות ניצנים מפני השטח של התא.

טכניקה ליצירת חלקיקים דמויי נגיף שפעת באמצעות מערכת יונקים

הסרטון מציג שיטה ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים מותאמים לקור. היא כרוכה בהדבקת תאים אנושיים בפלסמידים דו-כיווניים, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה נמוכה יותר כדי להניב נגיפים המתאימים לייצור חיסונים, המאופיינים בשכפול מופחת בתנאים חמים יותר.

יצירת נגיפי שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים לחיסונים

פרוטוקול מהיר ומודולרי ליצירת וירוסי חיסון רקומביננטיים המבטאים חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים בו זמנית בשיטת הבחירה הדומיננטית החולפת מתואר כאן.

מתודולוגיה לדור היעיל של חלבונים נגיפי חיסון מתויגים בפלורסנטיות

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

אנו מתארים שיטה שבאמצעותה אנו מזהים שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים חד-שבטיים אנושית או מאתר שמכוונות את hemagglutinin נגיפי שפעת A וירוסים. הפרוטוקול ניתן להתאים glycoproteins משטח אחר וירוס, נוגדנים נטרול המתאימים שלהם.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

הדור של רקומביננטי rotaviruses מ-DNA פלאמיד מספק כלי חיוני לחקר שכפול rotaviruses ו פתוגנזה, ופיתוח של וקטורים rotaviruses ביטוי וחיסונים. להלן, אנו מתארים גישה גנטית הפוכה פשוטה ליצירת רקומביננטי rotaviruses, כולל זנים המבטא חלבונים כתבת פלורסנט.

מפושטת הפוך שיטה גנטיקה כדי לשחזר רקומביננטי Rotaviruses ביטוי חלבונים עיתונאי

זוהי שיטה להפקת וירוסים "להוריד" רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.

דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית

למדו כיצד לייצר וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמידי על ידי טרנספקציה לתאי 293T ו-MDCK. שיטה זו מאפשרת למחקרי וירולוגיה לחקור ביולוגיה של השפעת ולפתח חיסונים פוטנציאליים.

הדור של וירוס שפעת רקומביננטי מ-DNA פלסמיד

גלה סרטונים נוספים