הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה
31 באוגוסט 2010
פרופוזיה של לב מבודד במצב Langendorff, בשילוב עם ספקטרוסקופיית 31P NMR, מאחדת את תחומי הביוכימיה והפיזיולוגיה לניסוי אחד. הפרוטוקול מאפשר מדידה דינמית של תכולת פוספט בעלת אנרגיה גבוהה ומחזוריותה בלב, תוך ניטור סימולטני של התפקוד הפיזיולוגי. כאשר היא מבוצעת נכון, טכניקה זו מהווה כלי בעל ערך להערכת האנרגטיקה של הלב.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את התפקוד הלבבי והאנרגטיקה בלב עכבר מבודד תחת פרפוזיה. דבר זה מושג על ידי ביצוע פרפוזיה ללב עכבר במצב LOR. בשלב שני, באמצעות בופר Krebs שנבחר ידנית והועשר בגלוקוז ופירובט, מוכנס בלון מלא במים לתוך החדר השמאלי (lv), מה שמאפשר ניטור רציף של התפקוד הלבבי במהלך הניסוי.
בשלב הבא, הלב מוכנס לתוך מבחנת NMR של 10 מילימטרים ומוכנס למגנט כדי להעריך את האנרגטיקה הלבבית באמצעות תצפית על התהודות של פוספו-קראטין ושל פוספטים אנורגניים. התוצאות שהתקבלו מראות את התפקוד והאנרגטיקה הלבבית בהתבסס על גלי לחץ של ה-LV, P 31 ומספקטרוסקופיית מסות. שלום, אני סטיב קיץ ממרכז מטבוליזם לבבי של MIT במחלקה לאנשטיזיה באוניברסיטת וושינגטון. היום אראה לכם הליך של פרפוזיה של לב מבודד בשילוב עם ספקטרוסקופיית 31 PNMR.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי להעריך את התפקוד והאנרגטיקה של הלב במודלים של עכברים בהנדסה ביולוגית. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הכינו ליטר אחד של בופר kres, hence light או KH.
החדירו בועות של 5%carbon dioxide ו-95%oxygen אל התערובת למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן הוסיפו calcium chloride בריכוז של שני millimolar, ואחריו את הסובסטרטים, 10 millimolar glucose ו-0.5 millimolar pyruvate. בניסויים אלו, נעשה שימוש בשתי מערכות נפרדות בו-זמנית עבור כל רכישה של P 31 Spectra.
מגנט BRUER 14 T מחובר לקונסולה מתקדמת של שלושה ומחשב המצויד בתוכנת top spin V 2.1 להערכת תפקוד הלב. מערכת פרפוזיית לב שנבנתה בהתאמה אישית מחוברת ל-power lab. ארבעה 30 דרישות נתונים.
המערכת מצוידת בתוכנת lab chart PRO six לניתוח נתונים. מי apparatus לבשפומת הלב כולל משאבה פריסטלטית מסוג mini pulse three הנשלטת על ידי בקר משאבות STH המשמש להזרמת בופר KH אל הלב. ויסות הטמפרטורה במהלך ניסוי ה-NMR הוא קריטי. משתמשים בסירקולטורים מחוממים כדי לשמור על הטמפרטורה בין 37.0 ל-37.5 degrees Celsius בזמן שהלב נמצא בתוך המגנט, והטמפרטורה מנוטרת לאורך כל הניסוי באמצעות חיישן טמפרטורה מסיב אופטי.
לאורך הניסוי, לחץ ה-LV ולחץ הפרפוזיה מנוטרים באמצעות מתמירים של לחץ המחוברים למערכת רכישת נתונים ומוצגים באמצעות התוכנה הנלווית. מתמר פיזיולוגי משמש לניטור לחץ ה-LV ומתמר לחץ דם חד-פעמי משמש לניטור לחץ הפרפוזיה. לבסוף, משתמשים בצינור טבורי כדי לספק לב גוף הלב את התמיכה (buffer) המחוממת והמחומצנת.
לאחר הכניסה למגנט, ולפני תחילת הניסוי, יש לכייל את חיישני הלחץ באמצעות המנומטר הסטנדרטי: ראשית, ללא לחץ בחיישן, כדי לאפס את הכיול. לאחר מכן, יש לנפח את המנומטר ללחץ גבוה יותר. הזן ערך זה לתוכנת המחשב.
לאחר מכן, ודאו כי חיישני הלחץ כוילו כראוי על ידי ניפוח מנומטר זה ללחצים ידועים ואימותם על מסך המחשב. ברגע שחיישני הלחץ כוילו, כילו את גשושית ה-NMR באמצעות מבחנה של NMR בנפח 10 מילימטר המכילה דגימה סטנדרטית של 150 מילימולרית של סודיום פוספט. בצעו את הכיול באמצעות תוכנת top spin.
ראשית, בצעו כיוון (tune) של הדגימה כדי לקבוע את תדר התהודה של הפספורס. לאחר מכן, בצעו שימינג (shim) לדגימה כדי ליצור שדה מגנטי הומוגני. כיול ראשוני זה משפר את האות ומקצר את הזמן הדרוש לתחילת תקופת הרכישה.
ברגע שהלב ממוקם בתוך הגשש כדי להתחיל את הוצאת לב העכבר, הזרק לעכבר 200 units של heparin באופן תוך-peritوني (intraperitoneal) כדי להפחית קרישה. לאחר חמש דקות, ניתן 175 mg/kg של sodium Penta barbital באופן תוך-peritوني. ברגע שהעכבר הרדים, הנח אותו על גבו והדבק את הזרועות והרגליים כדי לחשוף את אזור החזה.
בצע צביטה בבהוות ה🦶 כדי לוודא שהעכבר נמצא תחת הרדמה מלאה. חתוך. פתח את חלל הפריטונאום ואת בית החזה בעזרת מספריים, והשתמש בפינצטה כדי לקלף לאחור את כלוב הצלעות ולחשוף את חלל בית החזה. אחז ברקמת הריאה והרם בעדינות את הלב בעזרת מספריים קמורות.
חתכו את כלי הדם הגדולים מאחורי הלב והמשיכו באיטיות לכיוון ראש העכבר עד שהלב יהיה חופשי. עצרו מיד את פעולת הלב בבופר KH קר מאוד (קרח). השאירו את האיברים על קרח והוציאו במהירות את הריאות.
זהו את אונוי הטימוס וקלפו אותם בעדינות לאחור כדי לחשוף את האאורטה. לאחר מכן, הסירו את הטימוס. לבסוף, בודדו את האאורטה על ידי הסרה זהירה של כל רקמה סביבה.
באמצעות פינצטות מיקרו-תפרים, החזיקו בדרך כלל את שני דפנות האורטה כדי לחשוף את הלומן. לאחר מכן, הניחו בזהירות את האורטה על הקנולה. זו עשויה מצינור פוליאתילן בעל קוטר חיצוני של 0.965 millimeter.
החזק את האורטה במקומה בעזרת תפס מיקרו-כלי דם וקשור במהירות תפרים מסביב לאורטה. לאחר קשירת התפרים, הסר את התפס. השתמש בפינצטה כדי לוודא בזהירות שהקנולה נמצאת מעל שורש האורטה.
הוסיפו קשירות נוספות ככל שנדרש כדי להחזיק את הלב במקומו. הסירו רקמות עודפות באמצעות הפינצטה והמספריים המיקרוסקופיות. לאחר מכן, בצעו חתך קטן בתוך העלייה השמאלית.
החזק את הלב בעדינות והחדר בזהירות צינור פוליאתילן בקוטר חיצוני של 0.61 millimeter דרך העלייה השמאלית, חלל החדר השמאלי, והוצא אותו דרך השיא (apex). גזור את עודפי הצינור. לאחר מכן, החדר בלון לא מנופח ומלא במים דרך העלייה אל החדר השמאלי.
קבעו את הבלון במקומו באמצעות סרט דביק. לאחר מכן, הגבירו בהדרגה את מהירות משאבת הפריסטלטיקה כדי לספק זרימה מספקת ללב. המשיכו בביצוע פרפוזיה ללב עם בופר KH בזרימה קבועה השקולה לכ-2 mL לדקה, עד להנחת הלב בתוך גשש ה-NMR.
נפחו את בלון ה-LV בנפח קטן באמצעות מזרק מיקרומטרי כדי לוודא שמתמר הלחץ של ה-LV פועל עבור ספקטרוסקופיית NMR. ראשית, הכניסו בזהירות את הלב לתוך מבחנה NMR של 10 מילימטר. ספינר רחב מוצב סביב מבחנת ה-NMR כדי לסייע בהכוונת המבחנה למקום הנכון.
בתוך הגשושית, הצמד בחוזקה את כל המערך אל חבל הטבור באמצעות סרט דביק. לאחר מכן, הורד לאט את חבל הטבור אל תוך החור העליון של המגנט עד שצינור ה-NMR המכיל את הלב יימצא בתוך הסליל של גשושית ה-NMR בקוטר 10 millimeter. ברגע שהלב נמצא במיקום הנכון בתוך הגשושית, כוונן את ספיקת משאבת העזר כדי להשיג לחץ פרפוזיה של 80 millimeters of mercury.
שמרו על לחץ הפרפוזיה על ידי הפעלת מנגנון השמירה (hold) בבקר המשאבה. אפשרו תקופת שיווי משקל של 15 עד 20 דקות עבור הלב. במהלך תקופת שיווי המשקל, כווננו את נפח בלון ה-LV כדי להשיג לחץ דיאסטולי סופי של 8 עד 10 millimeters of mercury.
לאחר מכן, בצעו אופטימיזציה לפרמטרי הספקטרומטר על מנת להשיג את אות הפספורס הטוב ביותר האפשרי. כיילו את מכשיר ה-NMR על ידי הגדרת פולס הרדיו, כך שיתאים לתדר שבו הגרעין של הפספורס מהדהד. לאחר תקופת ההשתוויינות, בצעו shim לדגימה כדי להפוך את השדה המגנטי להומוגני.
התחל רכישה של מספר ספקטרומי P 31 NMR. תקופת הרכישה עבור כל ספקטרום תלויה בעוצמת השדה של המגנט, בגודל הדגימה וביחס אות לרעש הנדרש עבור ניסוי ספציפי. כאן הספקטרומים מתקבלים באמצעות מגנט של 14 Tesla על ידי מיצוע האות שהתקבל מ-256 פולסי תדר רדיו של 20 microseconds עם זווית הפיכה של 60 מעלות והשהיות של 2.0 seconds.
ניסוי זה יארך כ-10 דקות. מדד טיפוסי לתפקוד לבבי, הלחץ המפותח בחדר השמאלי (LV developed pressure), מתקבל על ידי חיסור הלחץ הדיאסטולי הסופי או EDP מהלחץ הסיסטולי. בעכבר C 57 black six רגיל, הלחץ המפותח ב-LV של הלב נע בדרך כלל בין 100 ל-110 millimeters of mercury בלחץ דיאסטולי סופי קבוע של 8 עד 10 millimeters of mercury.
מוצגות עקומות עיצוב מייצגות מעכברי ביקורת ומעכברים עם קשירה של אבי העורקים (aortic banded). תפקוד סיסטולי מיוצג על ידי הלחץ המפותח ב-LV כפונקציה של נפחי LV עולים, כפי שנקבע על פי נפח בלון ה-LV. תפקוד דיאסטולי מיוצג על ידי EDP כפונקציה של נפחי LV עולים.
ספקטרום NMR של P³¹ של לב עכבר בבידוד פרפוזיה מספק אותים של פוספוקריאטין (PHOSPHOCREATINE) או PCR, שלושת הפוספטים מ-TP ופוספט אנאורגני או pi. כאן, פיסגת ה-PI קטנה יחסית. זהו מצב טיפוסי ללב בפרפוזיה אירובית המוזן בפירובט או בחומצות שומן.
בנוסף לגלוקוז במהלך תקופות של איסכמיה, שיא זה עולה בעוד ששיא ה-PCR יורד. הרגע הצגתי בפניכם כיצד להכין לב של עכבר לפרפוזיה, כך שניתן למדוד בו-זמנית הן את התפקוד הלבבי והן את האנרגטיקה במהלך הניסוי. חשוב לוודא שהלב מקבל פרפוזיה נאותה.
אחרת, נתוני ה-NMR שלכם לא יהיו מהימנים. זהו זה. תודה ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול לביצוע פרפוזיה של לב מבודד במצב Langendorff בשילוב עם ספקטרוסקופיית 31P NMR, המאפשרת מדידה דינמית של האנרגטיקה הלבבית. השיטה מאפשרת ניטור סימולטני של תכולת הפוספטים בעלי האנרגיה הגבוהה ושל התפקוד הלבבי בלב של עכבר מבודד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה של הלב
- ביוכימיה
- ספקטרוסקופיית NMR
רקע
- פרפוזיית לנגנדורף (Langendorff perfusion) היא טכניקה המשמשת לחקר תפקוד הלב.
- ספקטרוסקופיית 31P NMR מספקת תובנות לגבי מטבוליזם אנרגטי ברקמות לבביות.
- שיטה זו מאפשרת הערכה של אנרגטיקה לבבית בזמן אמת.
- הבנת האנרגטיקה הלבבית היא חיונית להערכת בריאות הלב ומחלות לב.
מטרת המחקר
- לבחון את התפקוד הלבבי והאנרגטיקה בלב עכבר מבודד.
- להעריך את השפעתם של סובסטראטים שונים על ביצועי הלב.
- לפתח פרוטוקול מהימן למחקרי אנרגטיקה לבבית עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת באפר Krebs-Henseleit עם גלוקוז ופירובט.
- החדרת בלון מלא במים לתוך החדר השמאלי לניטור לחץ.
- שימוש במבחנת NMR של 10 mm להערכת אנרגטיקה לבבית.
- כיול של חיישני לחץ וגששי NMR למדידות מדויקות.
תוצאות עיקריות
- בידוד ופרפוזיה מוצלחים של לב עכבר.
- ניטור בזמן אמת של לחץ החדר השמאלי ולחץ הפרפוזיה.
- מדידה דינמית של פוספטים בעלי אנרגיה גבוהה במהלך הניסוי.
- תובנות לגבי הקשר בין זמינות סובסטרט לבין התפקוד הלבבי.
מסקנות
- הפרוטוקול משלב ביעילות הערכות פיזיולוגיות וביוכימיות.
- הוא מספק כלי בעל ערך לחקר האנרגטיקה של הלב במסגרות מחקריות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו כדי לבחון את בריאות הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הערכה סימולטנית של תפקוד הלב והאנרגטיקה שלו בלבבות עכברים מבודדים, ובכך מספק מערכת רלוונטית פיזיולוגית להערכת שינויים מולקולריים במודלים של מחלות קרדיווסקולריות. באמצעות שילוב של פרפוזיה בשיטת Langendorff עם ספקטרוסקופיית 31P NMR, חוקרים יכולים לקבל מדדים כמותיים בזמן אמת של מטבוליטים של פוספט בעלי אנרגיה גבוהה לצד פרמטרים המודינמיים, דבר התומך בהפחתת סיכונים מנגנונית בתהליכי תיקוף מטרות ובסריקות פרה-קליניות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי קישור שינויים מולקולריים לפנוטיפים תפקודיים ומטבוליים במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת ההשפעה של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות על האנרגטיקה והתפקוד של הלב בלבבות פועמים ושלמים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות טיפוליות באמצעות ניטור סימולטני של הלחץ המפותח ב-LV ושל רמות phosphocreatine/ATP תחת עקה פיזיולוגית או פתולוגית.
- ערך ניבוי: תומך במיון פורטפוליו באמצעות זיהוי תרכובות או מודיפיקציות גנטיות השומרות על הומאוסטזיס אנרגטי במהלך איסכמיה/reperfussion או בעת אתגרי עומס עבודה גבוה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי קביעת קו בסיס לתפקוד לבבי ולרמות מטבוליטים בפורמט הדירות (perfusion) של Langendorff הניתן לשחזור.
- פלטים כמותיים: מייצרת מדידות סימולטניות בזמן אמת של תפקוד המודינמי (לחץ LV) ואנרגטיקה ביוכימית (PCr, ATP, Pi) לצורך פיתוח בדיקה רב-פרמטרית.
- יכולת הרחבה ושימוש חוזר: ניתן להתאים את פלטפורמת הלב המבודד למודלים שונים של מחלות (למשל, aortic banding, מודלים טרנסגניים) כדי לאפשר הערכה עקבית של אותות בטיחות ויעילות לבבית בין פרויקטים שונים.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מעריך באופן ישיר את המשמעות התפקודית והאנרגטית של מודיפיקציות מולקולריות במודלים טרנסגניים של פתולוגיה לבבית, ובכך תומך בהתאמה של ביומרקרים טרנסלציונליים.
- המשכיות פרה-קלינית: מגשר בין שלב התיקוף של המטרה (target validation) לבין הערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת מדד כמותי המעוגן פיזיולוגית לבריאות הלב.
- קבלת החלטות מותאמת סיכון: מסייע בקביעת קריטריונים של go/no-go באמצעות זיהוי מוקדם של תפקוד אנרגטי לקוי, שעשוי לנבא כישלון קליני בשלבים מאוחרים של תוכניות למחלות קרדיווסקולריות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך אופטימיזציה של תרכובות מובילות ועד להערכה פרה-קלינית, ומספקת פלטפורמה רב-פעמית להערכת רעילות לבבית ומעורבות מטרה במערכות הרלוונטיות למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לשינויים מדידים באנרגטיקה לבבית ובתפקוד כיווצי.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות באמצעות תנאי פרפוזיה מבוקרים, ניטור לחץ בזמן אמת ורכישת ספקטרום NMR עקבית.
- אנליטיקה: מספקת תוצאות כמותיות רב-פרמטריות (לחץ מפותח ב-LV, לחץ בסוף דיאסטולה, יחסי PCr/ATP, תזוזות ב-Pi) המאפשרות השוואה אובייקטיבית בין תנאים ניסיוניים לטיפולים בתרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין גילוי ראשוני לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על רלוונטיות פיזיולוגית, תוך מתן אפשרות לחקירה ביוכימית של מסלולים מטבוליים בלבבים שלמים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת ניתנת להרחבה ורב-תחומית, הישימה לתוכניות של רעילות קרדיווסקולרית, מטבוליים ומיטוכונדריאלית במספר תחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתאם בין שינויים מולקולריים למדידות ישירות של תפקוד לבבי ומטבוליזם של פוספטים בעלי אנרגיה גבוהה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הכנת באפרים סטנדרטית, בקרת טמפרטורה, כיול של מתמר לחץ ונהלי shimming של NMR.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי זיהוי מוקדם של תרכובות קרדיוטוקסיות או כאלו המשבשות את המטבוליזם, ובכך מפחית את שיעורי הנשירה בשלבים מאוחרים של פיתוח תרופות למערכת קרדיו-וסקולרית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות ומועמדים על בסיס סיכון, על ידי אספקת תובנות מוקדמות לגבי רזרבה אנרגטית ועמידות למעמס במודלים של מחלות.
שיקולים ליישום
- דורש מומחיות בפרפוזיה של לב מבודד, ספקטרוסקופיית NMR וכיול של מחולל לחץ (pressure transducer).
- תלוי בגישה לספקטרומטרים של NMR בשדה גבוה (למשל, 14T) ובחומרת פרפוזיה ייעודית התואמת את מגבלות קוטר המגנט.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי פיזיולוגיה, פרמקולוגיה ואנליטיקת NMR לצורך רכישה ופרשנות עקבית של נתונים.
- שיקולי התאמה כוללים התאמות ספציפיות למודל של לחץ הפרפוזיה, נפח הבלון והרכב הסובסטרט, בהתבסס על הפנוטיפ של המחלה או הרקע הגנטי.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצים של יחס אות לרעש (signal-to-noise) בזיהוי מטבוליטים בריכוז נמוך, והצורך בהדרה קפדנית של ארטיפקטים איסכמיים במהלך ההקמה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.534Z&w=384&q=75)
