הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה
August 31st, 2010
זלוף לב מבודד במצב לנגנדורף, בשילוב עם ספקטרוסקופיה 31P NMR, משלב את תחומי הביוכימיה והפיזיולוגיה לניסוי אחד. הפרוטוקול מאפשר מדידה דינמית של תכולת פוספט באנרגיה גבוהה ותחלופה בלב תוך ניטור תפקוד פיזיולוגי. כאשר מבוצעת כהלכה, זוהי טכניקה חשובה בהערכת אנרגטיקה לבבית.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לצפות בתפקוד הלב והאנרגיה בלב עכבר מבודד. זה מושג על ידי החדרת לב עכבר במצב LOR. עם מאגר בחירת היד של קרבס המועשר בגלוקוז ופירובט כשלב שני, מוחדר בלון מלא במים לחדר השמאלי או lv, המאפשר ניטור מתמיד של תפקוד הלב במהלך הניסוי.
לאחר מכן, הלב מוכנס לתוך צינור NMR של 10 מילימטר ומוחדר למגנט על מנת להעריך את אנרגטיקת הלב באמצעות התבוננות בתהודה של פוספו קריאטין פוספטים של TP והתקבלו תוצאות הפוספט האנאורגני המראות תפקוד לב ואנרגטיקה על סמך גלי הלחץ LV ו- P 31 וספקטרוסקופיה מסה p. היי, אני סטיב קיץ ממרכז חילוף החומרים של MIT במחלקה להרדמה באוניברסיטת וושינגטון. היום אראה לכם הליך לזלוף לב מבודד בשילוב עם ספקטרוסקופיה של 31 PNMR.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להעריך את תפקוד הלב והאנרגיה במודלים של עכברים מהונדסים ביולוגית שלנו. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הכינו ליטר אחד של kres, ומכאן מאגר אור או KH.
הכניסו לתערובת 5% פחמן דו חמצני ו -95% בועות חמצן למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן מוסיפים שני סידן כלורי מילי-מולרי, ואחריהם מצעים, 10 גלוקוז מילי-מולרי ופירובט 0.5 מילי-מולרי. עבור ניסויים אלה, שתי מערכות נפרדות משמשות בו זמנית לכל רכישה של P 31 Spectra.
מגנט BRUER 14 T מתממשק עם שלוש הקונסולות המתקדמות ומחשב המצויד בתוכנת ספין V 2.1 עליונה להערכת תפקוד הלב. מערכת זלוף לב שנבנתה בהתאמה אישית מתממשקת למעבדת הכוח. ארבע 30 דרישת נתונים.
מצויד בתרשים המעבדה PRO שש תוכנה לניתוח נתונים. מנגנון זלוף הלב כולל משאבה פריסטלטית מיני דופק שלוש הנשלטת על ידי בקר משאבת STH המשמשת להחדרת מאגר KH לוויסות טמפרטורת הלב במהלך ניסוי ה- NMR היא קריטית. סירקולטורים מחוממים משמשים לשמירה על הטמפרטורה בין 37.0 ל-37.5 מעלות צלזיוס בזמן שהלב נמצא בתוך המגנט והטמפרטורה מנוטרת למשך הניסוי באמצעות בדיקת טמפרטורת סיבים אופטיים.
לאורך כל הניסוי, לחץ ה-LV ולחץ הזלוף מנוטרים באמצעות מתמרי לחץ המחוברים למערכת איסוף נתונים ומוצגים באמצעות התוכנה הכלולה. מתמר פיזיולוגי משמש לניטור לחץ LV ומתמר לחץ דם חד פעמי משמש לניטור לחץ הזלוף. לבסוף, חבל טבור משמש לאספקת המאגר המחומצן המחומם ללב.
ברגע שנכנסים למגנט, לפני תחילת הניסוי, כייל את מתמרי הלחץ עם מד מומנט התאנה הסטנדרטי במקום הראשון, ללא לחץ לתוך המתמר, כדי לאפס את הכיול. לאחר מכן נפח את המונומטר הזה ללחץ גבוה יותר. הזן ערך זה בתוכנית המחשב.
לאחר מכן ודא שמתמרי הלחץ כוילו כראוי על ידי ניפוח מד מומנט מומנט התאנה הזה ללחצים ידועים ואימותם על מסך המחשב. לאחר כיול מתמרי הלחץ, כייל את בדיקת ה-NMR עם צינור NMR של 10 מילימטר המכיל דגימה סטנדרטית של 150 מילי-מולרי נתרן פוספט. בצע את הכיול באמצעות תוכנת הסיבוב העליונה.
ראשית, כוון את הדגימה כדי להגדיר את תדירות תהודת הזרחן. לאחר מכן העבר את הדגימה ליצירת שדה מגנטי הומוגני. כיול ראשוני זה מקל על האות ומפחית את הזמן הדרוש לתחילת תקופת הרכישה.
לאחר שהלב ממוקם בתוך הגשושית כדי להתחיל את מיצוי לב העכבר, הזריק לעכבר 200 יחידות של הפרין תוך-צפקי כדי להפחית את הקרישה. לאחר חמש דקות, יש לתת 175 מיליגרם לק"ג נתרן פנטה ברביטל תוך-צפק. לאחר הרדמת העכבר, הניחו אותו על גבו והדביקו את הידיים והרגליים כדי לחשוף את אזור החזה.
בצע צביטה בבוהן כדי להבטיח שהעכבר מורדם לחלוטין. חתך. פתח את חלל הצפק והחזה בעזרת מספריים והשתמש במלקחיים כדי לקלף את כלוב הצלעות ולחשוף חלל בית החזה בעזרת מלקחיים. החזיקו ברקמת הריאה והרימו בעדינות את הלב בעזרת מספריים מעוקלים.
חותכים את כלי הדם הגדולים מאחורי הלב וממשיכים לאט לכיוון ראש העכבר עד שהלב משתחרר. עצרו מיד את הלב במאגר KH קר כקרח. שמור את האיברים על קרח והסר במהירות את הריאות.
זהה את אונות התימוס וקילף אותן בעדינות לאחור כדי לחשוף את אבי העורקים. לאחר מכן הסר את התימוס. לבסוף, בודדו את אבי העורקים על ידי הסרה זהירה של כל הרקמות שמסביב.
בעזרת מלקחיים מיקרו תפירה, בדרך כלל החזיקו את שני דפנות אבי העורקים כדי לחשוף את הלומן. לאחר מכן הניחו בזהירות את אבי העורקים על הצינורית. עשוי מצינורות פוליאתילן בקוטר חיצוני של 0.965 מילימטר.
החזק את אבי העורקים במקומו בעזרת מהדק כלי מיקרו וקשר במהירות תפרים סביב אבי העורקים. לאחר קשירת התפרים, הסר את המהדק. השתמש במלקחיים כדי לבדוק היטב שהצינורית נמצאת מעל שורש אבי העורקים.
הוסף את כל הקשרים הנוספים הנחוצים כדי להחזיק את הלב במקומו. הסר כל רקמה מיותרת באמצעות המלקחיים והמספריים המיקרו. לאחר מכן בצע חתך קטן באורקל השמאלי.
החזק בעדינות את הלב והכנס בזהירות צינורות פוליאתילן בגודל 0.61 מילימטר דרך האטריום השמאלי, חלל החדר השמאלי והחוצה דרך הקודקוד. חתוך את הצינורות העודפים. לאחר מכן, הכנס בלון מלא במים מנופח דרך האטריום לחדר השמאלי.
החזק את הבלון במקומו באמצעות סרט דבק. לאחר מכן הגדל בהדרגה את מהירות המשאבה הפריסטלטית כדי לספק זרימה מספקת ללב. המשך לחלחל את הלב עם מאגר KH באמצעות זרימה קבועה השווה לכשני מיליליטר לדקה עד שהלב יוכנס לתוך בדיקת ה-NMR.
נפח את בלון ה-LV בנפח קטן באמצעות מזרק מיקרומטר כדי לוודא שמתמר הלחץ LV פועל עבור ספקטרוסקופיה של NMR. ראשית, הכנס בזהירות את הלב לתוך צינור NMR של 10 מילימטר. ספינר חזיר רחב ממוקם סביב צינור ה-NMR כדי לעזור להנחות את הצינור למצב הנכון.
בתוך הבדיקה, חבר היטב את המנגנון כולו לחבל הטבור בעזרת סרט דבק. לאחר מכן, הורד לאט את חבל הטבור לתוך הקדח העליון של המגנט עד שצינור ה-NMR המכיל את הלב נמצא בתוך הסליל של בדיקת ה-NMR בגודל 10 מילימטר. ברגע שהלב נמצא במיקום הנכון בתוך הבדיקה, כוונן את זרימת המשאבה הטפילית על מנת להשיג לחץ זלוף של 80 מילימטר כספית.
שמור על לחץ הזלוף על ידי הפעלת מנגנון ההחזקה בבקר המשאבה. אפשר תקופת שיווי משקל של 15 עד 20 דקות ללב. במהלך תקופת שיווי המשקל, התאם את נפח בלון ה-LV כדי להשיג לחץ דיאסטולי סופי של שמונה עד 10 מילימטרים של כספית.
לאחר מכן בצע אופטימיזציה של פרמטרי הספקטרומטר על מנת להשיג את אות הזרחן הטוב ביותר האפשרי. כוונן את מכשיר ה-NMR על ידי הגדרת דופק הרדיו, כך שהתדר שבו גרעין הזרחן מהדהד. לאחר מכן שים את הדגימה כדי להפוך את השדה המגנטי להומוגני לאחר תקופת שיווי המשקל.
התחל ברכישה מרובה של P 31 NMR Spectra. תקופת הרכישה עבור כל ספקטרום תלויה בעוצמת השדה של המגנט, בגודל הדגימה וביחס האות לרעש הנדרש לניסוי ספציפי. כאן מתקבלים ספקטרום באמצעות מגנט של 14 טסלה על ידי ממוצע האות המתקבל מ-256 פולסים בתדר רדיו של 20 מיקרו-שניות עם זווית היפוך של 60 מעלות ועיכובים של 2.0 שניות.
ניסוי זה ידרוש כ-10 דקות. מדד טיפוסי לתפקוד הלב, הלחץ המפותח של LV מתקבל על ידי הפחתת הלחץ הדיאסטולי הסופי או EDP מהלחץ הסיסטולי. בעכבר רגיל C 57 שחור שש, הלחץ המפותח בלב LV הוא בדרך כלל בין 100 ל-110 מילימטרים של כספית בלחץ דיאסטולי קבוע של שמונה עד 10 מילימטרים של כספית.
עקומות עיצוב מייצגות מוצגות מעכברי ביקורת ורצועות אבי העורקים. התפקוד הסיסטולי מיוצג על ידי לחץ מפותח LV על נפחי LV הולכים וגדלים כפי שנקבע על ידי נפח בלון ה-LV. תפקוד דיאסטולי מיוצג על ידי EDP על פני נפחי LV הולכים וגדלים.
ספקטרום תמ"ג P 31 של לב עכבר מבודד מספק אותות של PHOSPHOCREATINE או PCR, שלושת הפוספטים מ-TP ופוספט אנאורגני או pi. כאן, שיא ה-PI קטן יחסית. זה אופייני ללב שופע אירובי המסופק עם פירובט או חומצות שומן.
בנוסף לגלוקוז בתקופות של איסכמיה, שיא זה עולה בעוד שיא ה-PCR יורד. זה עתה הראיתי לכם כיצד להכין לב עכבר לזלוף כך שניתן יהיה למדוד גם את תפקוד הלב וגם את האנרגיה בו זמנית במהלך הניסוי. חשוב לוודא שהלב חדור כראוי.
אחרת, נתוני ה-NMR שלך לא יהיו אמינים. אז זהו. תודה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול לתהליך פרפוזיה של לב חשוף בשיטת Langendorff בשילוב עם ספקטרוסקופית 31P NMR, המאפשרת מדידה דינמית של האנרגטיקה הלבבית. השיטה מאפשרת ניטור סימולטני של תכולת הפוספטים בעלי אנרגיה גבוהה והתפקוד הלבבי בלב עכבר מבודד.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- פיזיולוגיה לבבית
- ביוכימיה
- ספקטרוסקופית NMR
רקע
- פרפוזיה בשיטת Langendorff היא טכניקה המשמשת לחקר תפקוד הלב.
- ספקטרוסקופית 31P NMR מספקת תובנות לגבי מטבוליזם של האנרגיה ברקמות הלב.
- שיטה זו מאפשרת הערכה בזמן אמת של האנרגטיקה הלבבית.
- הבנת האנרגטיקה הלבבית חיונית להערכת בריאות הלב ומחלות.
מטרת המחקר
- לצפות בתפקוד הלבבי ובאנרגטיקה שלו בלב עכבר מבודד.
- להעריך את ההשפעה של מצעים שונים על הביצועים הלבביים.
- לפתח פרוטוקול אמין למחקרים עתידיים על האנרגטיקה הלבבית.
שיטות ששימשו
- הכנת מאגר Krebs-Henseleit עם גלוקוז ופירובט.
- החדרת בלון מלא מים לחדר השמאלי לצורך ניטור הלחץ.
- שימוש בצינור NMR בקוטר 10 מ"מ להערכת האנרגטיקה הלבבית.
- כיול מתמרים לחץ וחישני NMR למדידות מדויקות.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח ופרפוזיה של לב העכבר.
- ניטור בזמן אמת של לחץ החדר השמאלי ולחץ הפרפוזיה.
- מדידה דינמית של פוספטים בעלי אנרגיה גבוהה במהלך הניסוי.
- תובנות לגבי הקשר בין זמינות המצעים לתפקוד הלבבי.
מסקנות
- הפרוטוקול משלב ביעילות הערכות פיזיולוגיות וביוכימיות.
- הוא מספק כלי חשוב לחקר האנרגטיקה הלבבית במסגרות מחקר.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על מתודולוגיה זו כדי לחקור את בריאות הלב.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables simultaneous assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts, providing a physiologically relevant system for evaluating molecular modifications in cardiovascular disease models. By integrating Langendorff perfusion with 31P NMR spectroscopy, researchers can obtain real-time, quantitative readouts of high-energy phosphate metabolites alongside hemodynamic parameters, supporting mechanistic de-risking in target validation and preclinical screening workflows. The approach enhances predictive confidence by linking molecular alterations to functional and metabolic phenotypes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring how genetic or pharmacological interventions affect cardiac energetics and function in intact, beating hearts.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous monitoring of LV developed pressure and phosphocreatine/ATP levels under physiological or pathologic stress.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds or genetic modifications that preserve energetic homeostasis during ischemia/reperfusion or high-workload challenges.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline cardiac function and metabolite levels in a reproducible, Langendorff-perfused format.
- Quantitative Outputs: Generates simultaneous, real-time measurements of hemodynamic function (LV pressure) and biochemical energetics (PCr, ATP, Pi) for multi-parametric assay development.
- Scalability & Reuse: The isolated heart platform can be adapted across disease models (e.g., aortic banding, transgenic models) to enable consistent, cross-project evaluation of cardiac safety and efficacy signals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly assesses the functional and energetic significance of molecular modifications in transgenic models of cardiac pathology, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-phase target validation with preclinical evaluation by providing a quantitative, physiologically anchored readout of cardiac health.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria by detecting early energetic dysfunction that may predict late-stage clinical failure in cardiovascular programs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization to preclinical assessment, offering a reusable platform for evaluating cardiac liability and target engagement in disease-relevant systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to measurable changes in cardiac energetics and contractile function.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through controlled perfusion conditions, real-time pressure monitoring, and consistent NMR spectral acquisition.
- Analytics: Delivers quantitative, multi-parametric readouts (LV developed pressure, end-diastolic pressure, PCr/ATP ratios, Pi shifts) that allow objective comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by maintaining physiological relevance while enabling biochemical interrogation of metabolic pathways in intact hearts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, cross-functional capability applicable to cardiovascular, metabolic, and mitochondrial toxicity programs across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating molecular changes with direct measurements of cardiac function and high-energy phosphate metabolism.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized buffer preparation, temperature control, pressure transducer calibration, and NMR shimming procedures.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic or metabolically disruptive compounds early, reducing late-stage attrition in cardiovascular drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets and leads by providing early insight into energetic reserve and stress resilience in disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in isolated heart perfusion, NMR spectroscopy, and pressure transducer calibration.
- Dependent on access to high-field NMR spectrometers (e.g., 14T) and specialized perfusion hardware compatible with magnet bore constraints.
- Necessitates cross-team standardization between physiology, pharmacology, and NMR analytics teams for consistent data acquisition and interpretation.
- Adaptation considerations include model-specific adjustments to perfusion pressure, balloon volume, and substrate composition based on disease phenotype or genetic background.
- Practical limitations include signal-to-noise constraints in low-abundance metabolite detection and the need for rigorous exclusion of ischemic artifacts during setup.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:59
Introduction
1:25
Experimental Set-up
4:33
Isolated Heart Preparation
9:43
Representative Results of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy
7:41
Assessment of Cardiac Function and Energetics Using 31P NMR Spectroscopy
11:09
Conclusion
![חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F63188.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A46%253A50.867Z&w=384&q=75)
