Name: אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-05T17:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למדו שיטה לאינדוקציה טרנסאורתרלית של דלקת בדרכי השתן בעכברים באמצעות זני חיידקים וקטטריזציה עדינה. פרוטוקול זה מאפשר כימות זיהומים ומספק תוצאות ברות שחזור למחקר בזיהומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים ברצונם להודות ל-Shelly Xie ול-Jennifer Payne על סיועיהן הטכני המקצועי. עבודה זו התאפשרה הודות למענקים מה-Society of Pediatric Urology ומ-Stanford Pediatric Research Fund.

I. הכנה של צנתרים השופכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך כל שלפוחית ​​השתן העכבר כליה להיות שנדגמו, מקום 5-6 חרוזים נירוסטה (שלפוחית ​​השתן, בגודל 1.6 מ"מ או תערובת 0.9-2.0 מ"מ) או חרוזים זירקוניום אוקסיד (כליות בגודל 0.5 מ"מ) הגליל האחד cryovial, בהתאמה. החיטוי חרוז המכילים צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צינורות להתקרר לטמפרטורת הסביבה, להוסיף 200 מיקרוליטר של PBS סטרילי זה צינור נירוסטה חרוז המכילים ו 400 מיקרוליטר של PBS סטרילי זה צינור זירקוניום אוקסיד חרוז המכילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו מכינים קטטר השופכה כפי שתואר על ידי Hung ו Hultgren 13. החיטוי זוג נקי של שטוח ראש מלקחיים ומספריים קנס (איריס או סוג דומה) ולאפשר המכשירים להתקרר לטמפרטורת הסביבה. נגבו את פני השטח של ברדס למינרית לזרום עם אתנול 70%. בשכונה, חתך 30 ס"מ (בקירוב) קטע של צינורות פוליאתילן. בסביבה נקייה מחיידקים, במקום מחט סטרילית 30 מד (מחט ארוכה 1 / 2 אינץ') על מזרק 3 סמ"ק סטרילי. להרים קצה אחד של צינורות פוליאתילן לחתוך עם מלקחיים autoclaved והחלק את צינור אל המחט עד שהוא פוגש את הרכזת. חותכים את צינורות כך כ 2 ס"מ חורג קצה המחט. הסר את הקטטר מן המזרק ומניחים בצלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקטין את הסבירות של זיהום צולב, אנו לעשות אחד קטטר עבור כל עכבר. אחרי הכל צנתרים נעשים, לעקר מהם על ידי חשיפה בצלחת פטרי חשפו קרינה UV במשך 30 דקות לפחות. אל תסתכל ישירות על מנורות UV או לחשוף כל חלק של הגוף בשכונה בעוד מנורות מופעלים. לאחר החשיפה UV, צנתרים ניתן לאחסן לטווח ארוך בצלחת פטרי. אנו ממליצים איטום צלחת עם Parafilm כדי לעזור לשמור על סטריליות. </li></ol> השנייה. בעלי חיים הרכבת חיסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העכברים צריכים להגיע לפחות שבוע לפני מניפולציה ניסויית על מנת למנוע מתח המושרה גורמים סותרים. עכברים נקבה משמשים כי השופכה עכבר זכר קשה מאוד קטטר. CBA / J הוא מנוצל בדרך כלל, UTI-רגישים למתח עכבר מולדת. עכברים אמור לשמש בין 8 ל 12 שבועות של גיל, שכן זהו חלון של בגרות החיסונית לקראת ההזדקנות. ביום הראשון של הניסוי, לטבול את קצה לולאה inoculating סטרילי לתוך בקבוקון של מלאי חיידקים קפואים. לגרד inoculum קטן החוצה פס בצלחת אגר המתאים. באופן כללי, uropathogenic E. coli (UPEC) ו זנים אחרים ניתן לגדל לילה בשעה 37 על אגר (LB) לוריא-Bertani מעלות הסביבה האוויר. זנים UPEC לגדול כמו מוצק, לבן צהבהב שקוף מושבות על אגר LB. מיד להחזיר את מלאי החיידקים למקפיא. זני חיידקים Uropathogenic יכול להיות ארסית פחות לאורך זמן עם תרבויות חזר סדרתי. לפיכך, אנו ממליצים פסים צלחת אגר טרי עבור כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2 של הניסוי, לאחר אישור מורפולוגיה המושבה נכונה, לבחור אחת מן המושבות צלחות אגר ומניחים סמ"ק לפחות 5 התרבות מרק לילה. מרק LB יכול לשמש זני חיידקים uropathogenic ביותר (37 ° C, 200 סל"ד בתוך הסביבה האוויר). שמור את כמוסות רופף על צינורות תרבות מרק כדי לאפשר אוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 של הניסוי, לקחת 10% של התרבות מרק התרבות הראשון במרק לילה שוב (בדרך כלל 37 ° C ו סל"ד 200), כדי לשפר את סוג הביטוי אני פילי. תרבויות מרק סידורי לעזור כדי לייעל uropathogenicity בקטריאלי, שכן סוג אני פילי הוכחו להיות גורם קריטי עבור ארסיות uropathogens in vivo 1. שמור את כמוסות רופף על צינורות תרבות מרק כדי לאפשר אוורור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 של הניסוי, למדוד את OD 600 של התרבות מרק מיום 3. אם לא ידוע כבר זן חיידקי נבדק, לבצע פי עשרה ציפוי דילול סדרתי על לפחות 7 יומנים (דילולים הופיע עם PBS, תרבויות שבוצעו על אגר LB, 37 ° C הדגירה לילה) כדי לקבוע את הקשר בין OD 600 ו CFU / ml. ככלל אצבע, OD של 600 0.4-0.5 כלל מתאים CFU 1 2x10-7 ל 50 מיקרוליטר. לאחר מערכת היחסים בין OD 600 ו CFU / ml נקבע, ניתן להתאים את התרבות מרק ל OD 600 המתאים CFU הרצוי לכל העכבר 50 מיקרוליטר של PBS. עבודה חלק הציעו כי חיסון של 10 מיקרוליטר, במקום 50, המוביל ריפלוקס פחות לתוך kidneys6. עם זאת, רוב הפרסומים דיווחו על שימוש של 50 מיקרוליטר לכל עכבר. ככלל, טווחי CFU הרצוי בין 10 ו - 6 108 CFU / עכבר, אבל כל שילוב זן חיידקי / עכבר צריך להיבדק באופן אמפירי in vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח inocula לא ביטל מיד לאחר החדרה, עכברים יש לשלול מים במשך לפחות 30 דקות לפני אינדוקציה של הרדמה כללית. עוד תמרון המפתח הוא לגרום הרקה לפני הגיוס הרדמה ידי scruffing עכברים בעדינות לחיצה על abdom נמוךen. שני עד 2.5% isoflurane הוא מנה אינדוקציה בטוח 8-12 בן שבוע נקבות עכברים CBA, ואחריו הרדמה תחזוקה עם 1.8-2% isoflurane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרדמה מושגת, עכברים ממוקמים בעמדה פרקדן עם הראש שלהם הוכנס nosecone המחובר חמצן isoflurane המכילים. הבטן התחתונה היא עיסה לפנות את השתן משלפוחית ​​השתן. אם השלפוחית ​​ריקה יחסית, התמרון הזה לא עשוי להניב שתן. בבטן התחתונה חיץ הנקבים ספוגה אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק סטרילי 1 סמ"ק ללא מחט משמש כדי למשוך את inoculum חיידקי הרצוי. בשלב הבא, קטטר השופכה סטרילי ממוקם בסביבה נקייה מחיידקים, על המזרק. צינורות עודף לנתק את הקטטר עם זוג מספריים, כך שרק 1-2 מילימטרים של צינורות נותרים דיסטלי אל קצה המחט. ואז, המזרק הוא טפח ואת הבוכנה מדוכא עם המזרק זקוף כדי להסיר את כל הבועות. מנה של סיכה bacteriostatic ג'לי הוא ניתז על גבי צלחת פטרי סטרילית או את החלק הפנימי של עטיפת מזרק סטרילי. בקצה הקטטר (עם מזרק המצורף) הוא טבל את ג'לי. אם זני חיידקים מרובות נבדקות בניסוי אותו, להיזהר שלא להשתמש ירידה זהה של ג'לי לשמן צנתרים המכיל זנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סטריאופוני (0.8x טווח זום 5x) עבור ההגדלה, מכסה מנוע הדגדגן של העכבר הרדים הוא תפס בעדינות עם זוג נאה שיניים מלקחיים ביד הלא דומיננטי והעלה cephalad לחשוף את meatus השופכה ורוד עמוק ( איור 1). מזרק (עם קטטר המצורפת) הוא תפס ביד הדומיננטית עם אחיזת עיפרון בקצה הקטטר עוסקת meatus השופכה בזווית של 45 מעלות. מכסה המנוע הדגדגן נמתח לאורך ציר זמן של המזרק, ביעילות "טוען" את השופכה על הקטטר. תמרון זה חיוני מאז השופכה העכבר הוא מיותר. קטטר צריכה להחליק בקלות לתוך שלפוחית ​​השתן (עד הרכזת, איור 2), והוא יכול להיות סובב בעדינות כדי לעזור לנווט את קפלי מיותר של השופכה. לאחר קטטר הוא hubbed, המזרק ניתן להוריד עד שהוא מקביל עם ציר האורך של העכבר. היד הלא דומיננטית יכולים להוריד את המלקחיים כדי לעזור לייצב את המיקום של קטטר ו מזרק כמו היד הדומיננטית משמש לאט להזריק את inoculum (לפחות 5 שניות). אם הנוזל הוא ראה זורם סביב הקטטר במהלך ההזרקה, או שלפוחית ​​השתן מלאה או קטטר הוא בתוך הנרתיק (הזנב רק כדי השופכה). הזרקת יש להפסיק מיד את מיקומו של הקטטר לבחון היטב. אם הקטטר היה השופכה, העכבר לא ניתן לכלול בניסוי. מצד שני, קטטר במקומה בנרתיק יכול להיות מיקומו ואת הזריקה מחדש ניסו. לאחר ההזרקה, קטטר ואת המזרק היא נסוגה לאיטה מן העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקטין את הסיכוי של הרקה שלאחר חיסון מוקדם, שעשוי לפנות מנוהל חיידקים, ובכך להוביל רמות זיהום משתנה, חוקרים מסוימים לשמור על עכברים תחת הרדמה במשך 30 דקות לאחר inoculation10 transurethral. לאחר הניתוח, עכברים צריך להתאושש על שמיכה מחממת נקי עם תצפית רציפה כדי לאשר שובו של דפוסי נשימה נורמלי פעילות. לאחר חיות התאוששו באופן מלא את היכולת לזחול, הם עשויים להיות חזר מצעים המכילים בכלובים. </li></ol> ג. CFU מדידת ברקמה מאשרום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר פרסומים שונים UTI דיווחו על תוצאות של תרבות 6 שעות בשבוע אחד או יותר לאחר חיסון. נקודות זמן אופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי עבור שילוב זן חיידקי כל / עכבר. שתן מבוטלות מתקבל לתרבות ידי scruffing העכבר מעל צלחת פטרי סטרילית. השתן שנאסף יש לשמור על הקרח בכל עת. ניסיונות מרובים להשיג שתן בטלה על פני שעות רבות עשוי להיות נחוץ, שכן הרקה העכבר נפח תכופים, נמוך (3-10 מיקרוליטר לכל חלל), מתח תלויי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השגת דגימות שתן בטלה, אנו להקריב בעכברים באמצעות פריקה isoflurane ואת צוואר הרחם. הבטן היא פתחה בסביבה נקייה מחיידקים. אם דגימת שתן בטלה לא התקבל בהצלחה קודם לכן, כמות קטנה של שתן לעתים קרובות ניתן aspirated דרך הקיר שלפוחית ​​השתן באמצעות מחט מד מזרק 30 ו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת או שתי הכליות מוסרים, טחון לתוך לפחות 4 חתיכות (כל חתיכה צריכה להיות פחות מ 50 מיקרוגרם) על צלחת פטרי סטרילית, והניח לתוך חרוז זירקוניום / PBS המכילים cryovials על הקרח. שלפוחית ​​השתן מוסר, טחון לתוך לפחות 4 חתיכות, מכניסים נירוסטה חרוז / PBS המכילים cryovials על הקרח. רקמה / חרוזים / PBS המכילים cryovials ממוקמים כדור בלנדר homogenizer ואת רקמות הומוגני באמצעות "8" קביעת מהירות למשך דקה אחת. זה נפוץ כמה קטעי רקמות להישאר אחרי homogenization. כל עוד 5-10 מיקרוליטר של homogenate נוזלי ניתן pipetted, שברי מוצקהם לא בהכרח בעיה. אם הזמן הוא גדל homogenization עבור כמה דוגמאות, חשוב לעשות זאת במשך כל רקמות על מנת לשמור על עקביות של homogenization. אנו מנצלים כדור בלנדר homogenizer כי זה ימנע את האפשרות של זיהום צולב, היא מהירה יותר מאשר עיבוד דגימות בודדות אחד אחד באמצעות homogenizer רגיל, ואינו משמעותי החום דגימות להיות הומוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפחות שתיים או שלוש עשרה לקפל דילולים של שתן שנאספו homogenates רקמות צריכים להיעשות צלחת microtiter. בניסויים ראשוניים זה עשוי להיות נבון כדי להפוך לפחות שבעה פי עשרה דילולים. תרבות עד 100 מיקרוליטר של שתן, שלפוחית ​​השתן, ו / או homogenates כליה על אגר המתאים. מאז דגימות שתן עשוי להיות נפח מוגבל, ייתכן שיהיה צורך להביא כרכים שלהם 100 מיקרוליטר לפני ביצוע פי עשרה דילולים. אם זה נדרש, דילול ראשוני (לפני דילול פי עשרה) יהיה צורך בחשבון חישובים הסופי של התשואות חיידקי. אנחנו מעדיפים UPEC culturing על eosin-מתילן כחול או אגר MacConkey (הדגירה לילה בשעה 37 ° C), שכן התקשורת אלה סלקטיבית של אורגניזמים גראם שליליים. זנים UPEC גדלים על אגר MacConkey כמו umbilicated מרכזי, אדום ורוד מושבות בשל יכולתם להתסיס לקטוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לילה תרבות, לספור את CFU עבור כל צלחת. לקבלת דוגמיות בדילול סדרתי, הדילול צלחת ובה 50-100 מושבות נחשבת ספירה מדויקת ביותר. "חזרה" לחשב CFU לכל רקמה, מיליגרם של רקמות, או לכל מ"ל. </li></ol> IV. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Meatus השופכה (רקמה ורוד כהה) שנחשפו על ידי הרמת מכסה המנוע הדגדגן cephalad עם מלקחיים (מעבר גבי צילום) <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. צינתור השופכה. הדגדגן bifid ניתן לראות בדיוק מעל הקטטר. <img src="/files/ftp_upload/2070/2070fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. שלפוחית ​​השתן CFU ספירת 2 ימים לאחר ההדבקה transurethral של 8 שבוע הישן CBA / י נקבות עכברים עם uropathogenic E. coli. שלפוחיות היו הומוגני ו CFU / ml נקבע על ידי ציפוי דילול סדרתי על אגר MacConkey. יהלומים מצביעים CFU / ml עבור עכברים בודדים, הפס האופקי מציין CFU חציון / ml.

<ol><li>Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+of+type+1+pilus+expression+in+Escherichia+coli+to+ascending+urinary+tract+infections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice.</a> Infect Immun. 55, 373-380 (1987).</li>
<li>Rouschop, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urothelial+CD44+facilitates+Escherichia+coli+infection+of+the+murine+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract.</a> J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).</li>
<li>Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+mast+cells+to+bacterial+clearance+and+their+proliferation+during+experimental+cystitis+induced+by+type+1+fimbriated+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+LettM%22%5BJournal%5D)">Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli.</a> Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).</li>
<li>Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+flagella+is+coincident+with+uropathogenic+Escherichia+coli+ascension+to+the+upper+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).</li>
<li>Hvidberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+ascending+urinary+tract+infection+mouse+model+for+antibiotic+treatment+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+host+responses+to+Escherichia+coli+urinary+tract+infection+in+genetically+distinct+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains.</a> Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).</li>
<li>Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dynamics+of+type+1+fimbria+regulation+in+uropathogenic+Escherichia+coli+during+experimental+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection.</a> Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).</li>
<li>Bishop, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-regulated+exocytosis+of+Escherichia+coli+from+infected+bladder+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells.</a> Nat Med. 13, 625-630 (2007).</li>
<li>Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+responses+accelerate+bacterial+clearance+in+the+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder.</a> J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).</li>
<li>Hagberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascending%2C+unobstructed+urinary+tract+infection+in+mice+caused+by+pyelonephritogenic+Escherichia+coli+of+human+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin.</a> Infect Immun. 40, 273-283 (1983).</li>
<li>Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+urinary+tract+infection+by+intraurethral+inoculation+with+Escherichia+coli%3A+refining+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model.</a> J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).</li>
<li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+urinary+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li>
</ol>

לא הוצהרו ניגודי עניינים.

השראת זיהום בדרכי השתן של עכברים באמצעות הזרקה של חיידקים דרך השופכה היא פרוצדורה ותיקה אך תובענית מבחינה טכנית11. Hung ו-Hultgren פרסמו לאחרונה סקירה מצוינת של טכניקות להזרקה דרך השופכה לצורך השראת זיהום בדרכי השתן בעכברים13. במאמר זה, אנו שואפים להדגים באופן מעמיק יותר את הדגשים העדינים של גישה ניסויית זו.

מתחילים יכולים לתרגל את הטכניקה שלהם על ידי ביצוע לפרוטומיה בקו האמצע לחשיפת השלפוחית, הזרקת תמיסה מהולה של דיו סיני (1% ב-PBS), ובחינת השלפוחית לאיתור צביעה כחולה...

<table><tbody><tr><td>מבחנות קריו-וייאל, 2.0 ml פוליפרופילן (ללא פקקים)</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>640201</td><td></td></tr><tr><td>פקקים למבחנות קריו-וייאל, עם טבעת &amp;rsquo;O&amp;rsquo;</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>440011-N</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זירקוניום אוקסיד (0.5mm)</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פלדת אל-חלד (1.6mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB16</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חרוזי פלדת אל-חלד (0.9-2.0mm)</td><td>Next Advance</td><td>SSB14B</td><td></td></tr><tr><td>עכברים מסוג CBA/J, נקבות בנות 8-12 שבועות</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000656</td><td></td></tr><tr><td>סליין בבופר פוספט (NaCl 137mM, KCl 2.7mM, Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 4.3mM, KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1.4mM)</td><td>EMD Millipore</td><td>EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;) EM-5108-1 (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td></tr><tr><td>מצע LB agar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרק LB broth</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>NDC 10019-773-60</td><td></td></tr><tr><td>לולאות הזרקה</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-601</td><td></td></tr><tr><td>אבקת מצע Eosin-methylene blue (EMB) agar</td><td>Himedia Laboratories</td><td>MM022-500G</td><td></td></tr><tr><td>אבקת מצע MacConkey agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>212123</td><td></td></tr><tr><td>אבקת מצע LB agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>צינוריות פוליאתילן לא רדיואופקיות של Intramedic, PE10 [מידה פנימית 0.28 mm (0.011 inch); מידה חיצונית 0.61 mm (0.024 inch)]</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>מחטים בדרגה (gauge) 30, אורך 1/2 inch</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>מזרק טוברקולין 1 ml עם קצה Slip-Tip</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Luer-Lock בנפח 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309585</td><td></td></tr></tbody></table>

אינדוקציה transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

זנים חיידקיים עורו-פתוגניים רלוונטיים גודלים על אגר. באופן כללי, חיידקים עורו-פתוגנייםE. coliניתן לגדל זני (UPEC) וזנים אחרים למשך לילה על אגר Luria-Bertani (LB) ב-37°C באוויר סביבתי. זני UPEC גדלים כמושבות שקופות בצבע לבן-צהבהב על אגר LB. לאחר אישור מורפולוגיה מתאימה של המושבות, נבחרים מושבות בודדות לתרבית בציר. ניתן להשתמש בציר LB עבור רוב זני החיידקים העורופתוגניים. ניתן להשתמש בשתי תרביות רצופות של ציר LB למשך לילה כדי להגביר את הביטוי של pili מסוג I, גורם virulent מוגדר היטב עבור חיידקים עורופתוגניים. תרביות הציר מדוללות לריכוז הרצוי במי מלח פוספט (PBS). עכברות בנות 8 עד 12 שבועות מושמות תחת הרדמה באיזופלורן ומחדירות חיידקים דרך השופכה באמצעות מזרקים בכיול 30 G המכוסים בצינוריות פוליאתילן. אינוקולומים טיפוסיים, אשר חייבים להיקבע באופן אמפירי עבור כל שילוב של זן חיידקי/זן עכבר, הם 106עד 108cfu לכל עכבר ב-10 עד 50 µL של PBS. לאחר תקופת ההדבקה הרצויה (יום אחד עד מספר שבועות), נאספות דגימות שתן, השלפוחית ושתי הכליות. כל איבר נקטע לחתיכות קטנות, מונח ב-PBS ועובר הומוגניזציה במכשיר Blue Bullet homogenizer. תמיסות הומוגנאט של שתן ורקמות מדללות בסדרה ב-PBS ונזרעות על הגאר מתאים. למחרת, נספרות יחידות יוצרות מושבות.

סרטון זה ידגים שיטות להשראת זיהומים בדרכי השתן של עכברים בדרך התסתתית (transurethrally) ולכימות היקף הזיהומים שנוצרו.

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

זני חיידקים עוברי שתן רלוונטיים גדלים על אגר. בדרך כלל, ניתן לגדל E. coli עוברי שתן (UPEC) וזנים אחרים למשך לילה על...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשרות זיהום בדרכי השתן של עכבר באופן טרנס-ורטראלי (דרך השופכה). דבר זה מושג תחילה על ידי גידול זנים בקטריאליים רלוונטיים ודילול התרביות לריכוז הרצוי. השלב השני של הפרוצדורה הוא הזרקה של הזנים הבקטריאליים הרלוונטיים לשלפוחית השתן של העכבר באופן טרנס-ורטראלי.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא איסוף דגימות שתן וקצירת כליות ושלפוחית השתן. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הזרקה של שתן ושל דגימות הומוגניזציה של כליות ושלפוחית השתן לצלחות הגדלה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המעידות על זיהום מוצלח של דרכי השתן, בהתבסס על נוכחות של מושבות חיידקים בדגימות שהועלו לצלחות.שלום, אני מייקל שיא וברוכים הבאים למעבדה שלי במחלקה לאורולוגיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. אני אנו, גם אני ממעבדת שיא. היום נראה לכם הליך לקידוד קטטר דרך השופחא בעכבר.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור השראה של זיהום בדרכי השתן בעכברים. בואו נתחיל. תחת מCננת זרימה למינרית, חתכו מקטע של 30 סנטימטר של צינור פוליאתילן, והדקו מחט בכישור 30 על מזרק סטרילי של 3 cubic centimeter.השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להרים קצה אחד של הצינור החתוך והחליקו אותו על המחט עד שיגיע לבסיסה. חתכו את הצינור כך שכשני סנטימטרים יבלטו מעבר לקצה המחט. פעולה זו מסייעת במניעת פציעה של העכברים במהלך הצנתור.הוציאו את הקטטר מהמזרק והניחו אותו בתוך פטריית סטרילית. הכינו קטטר אחד עבור כל עכבר המיועד להדבקה. סטריליזציה של הקטטרים תתבצע באמצעות קרינת ultraviolet למשך 30 דקות לפחות.אטמו את הצלחת בעזרת פרפיל כדי לשמור על סטריליות הקטטר לאחסון לטווח ארוך. זרעו על צלחת אגר מתאימה תמיסת חידשול (inoculum) ממלאי קפואים של זן החיידקים הרלוונטי. כאן, תמיסת חידשול של U pathogenic E coli או UPEC נזרעת לצמיחה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.בחרו מושבות בודדות בעלות מורפולוגיה מתאימה, שבמקרה של UPEC הן מושבות צהבהבות, מוצקות ושקופות על מצע LB agar, והעבירו אותן ללפחות חמישה מיליליטרים של מרק נוזלי לתרבית לילה במענה ל-37 degrees Celsius עם ערבוב במהירות של 200 revolutions per minute. הוסיפו 10% מתרבית המרק הראשונה למצע טרי, וגדלו למשך לילה. שוב, כדי להגביר את ביטוי ה-type 1 pili, הקשור לפתוגניזות של החיידק in vivo, מדדו את ה-OD 600 של התרבית כדי לקבוע את מספר יחידות יוצרות המושבות.CFU מקוצרת ליחידות של CFU למילילטר של תרבית. דללו את התרבית עם one XPBS סטרילי כך שהריכוז הסופי יהיה בין 10⁶ ל-10⁸ CFU ב-10 עד 50 µL, כדי להבטיח שהמוחלקים לא יתרוקנו מיד. לאחר ההתקנה, מנעו מהעכברים גישה למים למשך 30 דקות לפני ההרדמה; החזיקו את העכבר בעורפו ולחצו בעדינות על הבטן התחתונה כדי לעודד השתנה.הנח את העכבר המורדם על גבו, כאשר ראשו מוכנס לתוך קונו של אף המחובר לחמצן המכיל isof fluorine. עסה את הבטן כדי לרוקן את שאריות השתן משלפוחית השתן. השתמש בבקבוק התזה כדי להספיג את הבטן התחתונה ואת הפרינאום (perineum) ב-70% ethanol.בשלב הבא, השתמשו במזרק סטרילי של מיליליטר אחד כדי לשאוב את התוסיף החיידקי. חברו קטטר סטרילי מוכן למזרק. השתמשו במספריים כדי לחתוך את הפיתול כך שייבלט רק מילימטר אחד עד שניים מעבר לקצה המחט.פעולה זו מסייעת למנוע פגיעה בעכברים במהלך ההחדרה של הקטטר; הקישו על המזרק ולחצו על הבוכנה. כדי להסיר בועות אוויר, שמנו את הקטטר על ידי טבילה בנקודה של ג'ל סיכוך אנטי-בקטריאלי. הקפידו להשתמש בנקודה נפרדת של ג'ל עבור כל זן חיידקי שייבדק תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי.השתמשו בפינצטה בעלת שיניים עדינות ביד הלא-דומיננטית כדי לתפוס בעדינות את המעטפת של הדגדגן ולהרים אותה, כך שייחשף ה-ATU הש兼ניק של השופכה ביד הדומיננטית. אחזו במזרק שעליו מחובר הקטטר. באחיזת עיפרון, הכניסו את קצה הקטטר לתוך ה-ATU השפניק של השופכה בזווית של 45 מעלות ביחס לבטנו של העכבר.במישור סגיטלי מרכזי. מותחים את קפלי הדגדגן לאורך הציר הארוך של המזרק. פעולה זו טוענת ביעילות את השופכה אל תוך הקתטר.הקטטר אמור להחליק בקלות אל תוך שלפוחית השתן במידת הצורך. סובבו בעדינות את הקטטר כדי לסייע בניווט דרך הכפלים העודפים של הש尿ה. כאשר הקטטר מונח עד למסב (hub), הורידו את המזרק במקביל לבטנו של העכבר.הניחו את הפינצטה והשתמשו ביד הלא-דומיננטית כדי לייצב את הקטטר ואת המזרק. הזריקו את האינוקולום באיטיות במשך חמש שניות לפחות. אם נראה נוזל זורם מסביב לקטטר במהלך ההזרקה, פירוש הדבר שהשלפוחית מלאה או שהקטטר נמצא בנרתיק.הפסיקו את ההזרקה ובדקו את מיקום הקטטר. במידת הצורך, מיקמו מחדש את הקטטר בשופכה. לאחר ההזרקה, הוציאו את הקטטר באיטיות.השאירו את העכבר תחת הרדמה למשך חצי שעה לאחר ההזרקה. כדי להפחית את הסיכון להפשטת השתן לאחר הניתוח, אפשרו לעכבר להתאושש על שמיכת חימום נקייה תחת השגחה רצופה כדי לאשר את החזרתם של דפוסי נשימה ופעילות נורמליים. לאחר התאוששות מלאה ויכולת זחילה, החזירו את העכבר לכלוב המכיל מצע.בהתאם לשילוב של זני החיידקים והעכברים, עשוי לחלוף זמן שבין שש שעות לשבוע עד להדבקה מלאה. לצורך הפיתוח, הניחו צלחת פטרי סטרילית על קרח עבור כל עכבר מודבק במהלך מספר שעות. אחזו את העכבר בעור הצוואר מעל הצלחת כדי לאסוף שתן לתרבית.50 µL של שתן אמורים להספיק. העבר באמצעות פיפט את השתן למבחנה למיקרו-צנטריפוגה, סגור אותה ושמור את השתן על קרח. תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, הנח עכבר שהורדם על גבו במגש ניתוח.רסס את הבטן ב-70% ethanol. השתמש במספריים כדי לבצע חתך של שלושה עד ארבעה סנטימטרים בעור ובדופן הבטן שמתחתיו. במידת הצורך, השתמש בסיכות כדי להרחיק את דופן הבטן מתוכני הבטן.אם ניסיונות קודמים לאיסוף שתן לא הצליחו, השתמש במחט במידה 30 ובמזרק כדי לשאוב שתן ישירות דרך דופן שלפוחית השתן. השתמש בפינצטה ובמספריים כדי להוציא את הכליות. העבר אותן לצלחת פטרי סטרילית וקטע כל אחת לפחות לארבעה חלקים, בגודל של כ-2 עד 3 מילימטרים כל אחד.העבירו כל מקטע של כליה למבחנה לקריו (cryo vial) המכילה חמישה עד שישה חרוזי זירקוניום אוקסיד סטריליים בקוטר 0.5 millimeters, ו-400 microliters של PBS סטרילי. שמרו את דגימות הכליות על קרח. השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי להסיר את שלפוחית השתן.קצץ את שלפוחית השתן באותה שיטה שבה נעשה עבור הכליות. העבר כל רבדי שלפוחית למבחנה לקריו (cryo vial) המכילה גלגלי פלדת אל-חלד בקוטר 1.6 millimeter ו-200 microliters של PBS סטרילי, ושמור את המבחנות על קרח. הנח את המבחנות בהומוגניזטור מסוג bullet blender ובצע הומוגניזציה לרקמה בהגדרת מהירות שמונה למשך דקה אחת לפחות.כידוע, לעיתים נותרים שברי רקמה לאחר הומוגנציה. יש לבצע הומוגנציה לכל הדגימות למשך אותו פרק זמן בתוך פלטת מיקרוטיטר. בצעו דילול סדרתי של פי 10 לשתן שנאסף ולהומוגנאט הרקמה עם קרח.מריחת PBS קר. סיום הדילול. צלחות אגר מתאימות גדלו במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 °C.ניתן לחשב לאחור את מספר ה-CFU לאיבר, למיליגרם רקמה או למיליליטר שתן על סמך מספר המושבות בכל צלחת. השתמשנו בטכניקות אלו כדי לחקור כיצד מוטציות בתגובות עקה בקטריאליות משפיעות על יכולתו של UPEC לגרום ל-UTI in vivo, וכן על העמידות לאנטיביוטיקה שניתנה לעכברים מזוהמים. טבלה זו מציגה את יכולתו של UPEC מסוג בר (wild type) להדביק את שלפוחית השתן של העכבר לאחר הזרקה דרך השופכה (transurethral inoculation).הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשרות באופן רב-מערכתי זיהומים בדרכי השתן בעכברים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להחדיר את הקטטר לעכברים בעדינות. טכניקה נכונה תסייע להחדרה קלה של הקטטר, אך היא עשויה לדרוש תרגול.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

transurethral-induction-of-mouse-urinary-tract-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Luyts, N., ואחרים. מעקב אורך של זיהומים בדרכי השתן וטיפול בהם בעכברים באמצעות הדמיית ביולומינצנציה. J. Vis. Exp. (2021).הסרטון הזה מדגים את ההשראה והמעקב אחר זיהום בדרכי השתן במודל עכבר באמצעות E. coli ביולומינסנציוני שהוזרק לשלפוחית השתן, שם מתרחשים הידבקות, פלישה ושכפול תוך-תאי של חיידקים. האור הנפלט מהאופרון הביולומינצנטי משמש כסמן בזמן אמת לעומס חיידקים במהלך התקדמות הזיהום.

המחשה של זיהום בדרכי השתן במודל עכבר באמצעות ביולומינסצנציה

מקור: קונובר, מ. ס. ואחרים, ג'. הקמה ואפיון של דלקות בדרכי השתן ו-CAUTI במודל עכבר. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את ההליך להרכבה והשתלת קטטר טרנס-שופכה בעכבר, ולאחר מכן חיסון חיידקי כדי לקבוע זיהום בדרכי השתן הקשור לקטטר ולחקור אינטראקציות בין מארח לפתוגן המתווכת על ידי ביופילם.

זיהום בדרכי השתן הקשור לקטטר במודל עכבר

מקור: קונובר, מ. ס. ואח', הקמה ואפיון של דלקות בדרכי השתן ו-CAUTI במודל עכבר. J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את גילוי קהילות חיידקיות תוך-תאיות (IBCs) ברקמת שלפוחית השתן של העכבר הנגועה ב-Escherichia coli המבטא β-גלקטוזידאז. לאחר קיבוע רקמות, פרמיאביליזציה וצביעה ב-X-gal, תאי IBC מופיעים כפונקטה כחולה תחת מיקרוסקופ ניתוח, מה שמאשר פלישה חיידקית במהלך זיהום בדרכי השתן.

המחשת קהילות חיידקים תוך-תאיות בשלפוחית כיס עכבר נגועה

בסרטון זה, אנו מתארים את הטכניקה לניהול תוך שלפוחית של חיידקים אורופתוגניים כדי ליצור מודל זיהום בדרכי השתן בעכברים. מודל זה יכול לשמש להבנת התפשטות זיהום חיידקי אורופתוגני בתוך מערכת השתן ואת המנגנונים הקובעים רגישות לזיהומים בדרכי השתן.

מודל יצירת דלקת בדרכי השתן: טכניקה למתן חיידקים אורופתוגניים בעכבר לפיתוח מודל דלקת בדרכי השתן

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום Escherichia coli אורופתוגני בשלפוחית השתן של עכבר נקבה באמצעות החדרת קטטר טרנס-שופכתי. החיידקים המוזרקים מצליחים לבסס זיהום בדרכי השתן בתוך שלפוחית השתן, ומספקים פלטפורמה רבת ערך לחקר מחלות הקשורות לבריאות הקשורות לדרכי השתן.

צנתור דרך השופכה וחיסון חיידקי ליצירת מודל דלקת בדרכי השתן בעכברים זכרים

הקמת מודל של דלקת בדרכי השתן בעכברות

היכולת למדל דלקות בדרכי השתן (UTI) היא חיונית על מנת להיות מסוגל להבין פתוגנזה חיידקית ולהוליד פיתוח של טיפולים חדשים. מטרת עבודה זו היא להדגים מודלים עכבריים של UTI ניסיוני ודלקת בדרכי השתן הקשורה לצנתר המסכמים ומנבאים ממצאים שנראו בבני אדם.

ההקמה ואפיון של UTI וCAUTI במודל עכבר

הדגם הוקמה של צנתור-transurethral של עכברים מאפשרת לימוד פתולוגיות בשלפוחית השתן, כולל זיהום בדרכי השתן, אך ניתן לבצע רק אצל נקבות. מודל חדש של זכר החדרה-transurethral, המובאים כאן, יאפשר מחקר באזור המסומן חזקה קליניים ואפידמיולוגיים ההבדלים בין המינים.

זיהום בדרכי השתן במודל בעלי חיים קטנים: צנתור-Transurethral של זכר ונקבה עכברים

החדרה-transurethral תהליך מאתגר, לא טוב תואר בספרות. מטרתו של כתב יד זה הוא לתיאור טכניקה עבור החדרת צנתר למסירה intravesical של נוזלים עם חומרים פעילים אל תוך שלפוחית השתן ו/או הערמונית בעכברים זכרים בוגרים של-transurethral.

הליך ההתקנה-transurethral עכבר זכר בוגר

מודל עכברי של חיסון אורופתוגני E. coli (UPEC) טרנס-urethral כדי ליצור מאגרי שלפוחית שתן תוך-תאיים סמויים וחשיפה שלפוחית השתן לאחר מכן ל - G. vaginalis כדי לגרום ל- UPEC UTI חוזר ונשנה מודגם. כמו כן הודגמו ספירה של חיידקים, ציטולוגיה של שתן, וקיבוע ועיבוד שלפוחית השתן באתרם לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

כתב יד זה מתאר את הניהול התוך-עבזי של חיידקים אורופתיוגניים עם לוקס אופרון כדי לגרום לדלקת בדרכי השתן בעכברים ואת אורך האורך שלאחר מכן בניתוח vivo של העומס החיידקי באמצעות הדמיית ביו-לומינציה.

מעקב אורך של דלקות בדרכי השתן והטיפול שלהם בעכברים באמצעות הדמיית ביו-לומינציה

למדו שיטה לאינדוקציה טרנסאורתרלית של דלקת בדרכי השתן בעכברים באמצעות זני חיידקים וקטטריזציה עדינה. פרוטוקול זה מאפשר כימות זיהומים ומספק תוצאות ברות שחזור למחקר בזיהומים.

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

גלה סרטונים נוספים