מיקוד של מבנים מוחיים עמוקים עם Microinjections עבור משלוח של תרופות, וקטורים ויראליים, או השתלת תאים
1 בדצמבר 2010
במאמר זה, אנו מציגים שיטה להפוך מחטים נימי זכוכית עם לומן 50 מיקרומטר. טכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את הנזק המוחי, ממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות ומאפשרת מיקוד מדויק לתוך המוח מכרסמים.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע הזרקות מיקרו מדויקות מאוד למבנים עמוקים במוח לצורך הובלה של תרופות, וקטורים ויראליים או השתלות תאים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ייצור מחטי קפילריה מזכוכית בעלות lumen של 50 micrometer. השלב השני של ההליך הוא מילוי של 50% מהמחט בשמן מינרלי באמצעות קפילריות והכנסת הבוכנה דרך הקצה הרחב של הצינור.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא טעינת המחט בחומר או בתרחיף התאים שברצונך להזריק. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא החדרת קצה המחט והזרקת החומר בקצב זרימה נמוך מאוד אל תוך מבנה עמוק במוח. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות דיוק גבוה במיקוד של חומרים במוח באמצעות מיקרו-הזרקות עם צינור קפילרי מזכוכית.
שלום, אני אוסקר גונזאלס מהמעבדה למדעי העצבים בבית הספר לפסיכולוגיה באוניברסיטת קולימה, מקסיקו. היום נראה לכם הליך לביצוע מיקרו-הזרקה באמצעות צינור קפילרי מזכוכית להחדרת תרופות למוח של עכבר. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור תאי גזע עצביים בבגרות.
אם כן, בואו נתחיל. שימוש במחטי קפילריה מזכוכית עם חלל פנימי (lumen) של 50 מיקרומטר להזרקות מיקרוסקופיות לתוך המוח מפחית משמעותית את הנזק המוחי, ממזער דיפוזיה פסיבית של תרופות ומאפשר דיוק במיקוד ההזרקה במוח של מכרסמים. לפני שניתן לבצע את ההזרקות המיקרוסקופיות, יש להכין את מחטי הזכוכית.
התחילו בהנחת צינורית זכוכית קפילרית לתוך אלקטרודה בעלת התנגדות גבוהה למשיכה של מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות. לאחר מכן, הפעילו את האלקטרודה של המכשיר. כדי לחמם את מרכז צינורית הזכוכית ולהרכיב אותה מקומית, מתוחו את צינורית הזכוכית לאורך הציר האורכי שלה במרחק ראשוני של שלושה עד חמישה מילימטרים, באופן המספיק כדי לגרום להפחתה בקוטר צינורית הזכוכית באזור הממוקד.
המשיכו במתיחת צינור הזכוכית עד לשבירה. חזרו על שלבים אלו כדי ליצור שתי מחטים בעלות חבית בודדת וזהות. כעת, הניחו את מחטי הזכוכית בתוך כבשן מיקרו (micro forge).
זווית של 30 מעלות מספיקה כדי לשייף את הקצה. לבסוף, הניחו את המחטים תחת המיקרוסקופ ובדקו שלשתיהן יש את הקוטר הפנימי הנכון. עבור רוב התרופות ההידרופיליות, קוטר פנימי של 30 עד 50 micrometer הוא אידיאלי עבור המחטים שהוכנו.
בואו נראה כיצד להשתמש בהן להזרקות מיקרוסקופיות. ראשית, מלאו את המחט שהוכנה בשמן מינרלי מהקצה הרחב ביותר. הניחו לשמן המינרלי להיכנס באמצעות קפילריות עד שיגיע לכ-50% מאורך צינור הקפילריה.
מרחו גריז לוואקום גבוה סביב הקצה הרחב ביותר של המחט והחדירו דרכו את הבוכנה. דחפו בעדינות את השמן המינרלי עד שטיפה קטנה תצא מקצה מחט הזכוכית. כעת, קבעו את המחט במחזיק של המיקרו-מזרק והתחילו בהכנת בעל החיים להזרקה.
ראשית, הניחו פד חימום על מחזיק בעלי החיים הסטריאוטקטי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים. בטמפרטורה של 37 °C, גלחו את ראשו של העכבר המורדם, ולאחר מכן מקמו אותו והדקו אותו בתוך המכשיר הסטריאוטקטי. באמצעות מוטות אוזניים ומחזיק שיניים, השתמשו בסכין כירורגית כדי לבצע חתך בעור מהאוזניים ועד לקו ה-Lambda של הגולגולת.
יש להבריק את הגולגולת באמצעות מקלון צמר כדי לייבשה ולהרחיק את העור משדה הניתוח. לאחר מכן, השתמש בקצה מחט הזכוכית כדי לסמן את קודקוד תפר ה-bgma וקבע שם את נקודת ההזרקה הראשונית. כעת, הגדר את הנקודה על הגולגולת שיש לקדוח בה על ידי הזזת צירי ה-x וה-Y של המכשיר הסטריאוטקטי מעל הגולגולת.
בעזרת מקדחה מיקרוסקופית למחקר, קדחו בזהירות חורים בקואורדינטות הנבחרות באמצעות פינצטה עדינה. הסירו בזהירות את שכבת העצם העמוקה ביותר והפריצו את קרום העטיפה של המוח (dura mater). תוכלו לראות מעט נוזל חוט השדרה (cerebral spinal fluid) דולף החוצה.
כדי לוודא שהמחט יכולה לעבור דרך החורים שקדוחו, הורד lang="he" באיטיות את מחט הזכוכית באמצעות ציר ה-Z של המכשיר הסטריאוטקטי. כעת, שאיב עם פיפטה 1 µL מהתרופה להזרקה והנח אותה על פיסת פרפום קטנה. הנח את הפרפום על הגולגולת.
שאבו את התרופה על ידי סיבוב גלגל המיקרו-מזרק, תוך בדיקה דרך המיקרוסקופ שהנוזל עולה אל תוך מחט הזכוכית. הסירו את ה-parafilm ואפסו את קואורדינטת האפס. כעת העבירו את המחט לקואורדינטות הנבחרות והורידו את התפס עד שקצה מחט הזכוכית נוגע בעדינות במשטח המוח, ואפסו את ה-Z.Coordinate.
החדירו את מחט הזכוכית אל פטמה של המוח (brain parenchyma) לעומק הרצוי. מזקו את התרופה באיטיות בקצב של כ-one nanoliter לשנייה. לאחר שהנפח הרצוי הוזרק, המתינו שתי דקות כדי לאפשר לתרופה להתפשט בתוך הפטמה, ולאחר מכן הוציאו את המחט בתנועה חלקה ואיטית.
לבסוף, הדביקו את הפצע הכירורגי והוציאו את החיה מהמכשיר הסטריאוטקטי. העבירו את החיה לכלוב מחומם מראש להתאוששות מההרדמה. כעת נציג מספר תוצאות של מיקרו-הזרקה.
lyin או Lysophosphatidylcholine הוזרקו לתוך ה-corpus callosum כדי לגרום לדמילניזציה של מסלולי החומר הלבן, במטרה למזער את הפגיעה המוחית הנגרמת מהמחט מזכוכית. הוזרקו 20 µL בלבד של lyin. הדמילניזציה באה לידי ביטוי בהיעדר ביטוי של myelin basic protein במסלולי החומר הלבן; הזרקה מדויקת מאוד הושגה, ומסלול מחט צר מאוד מזעיר את הפגיעה המוחית.
הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין מחטי זכוכית לביצוע הזרקות מיקרוסקופיות למבנים עמוקים במוח. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין את כל הציוד והחומרים לשימוש בחדר הניתוח. וזהו זה.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה ליצירת מחטי קפילריה מזכוכית עם לומן של 50-µm, המאפשרות הזרקות מיקרו מדויקות למבני מוח עמוקים. טכניקה זו ממזערת את הנזק למוח ומפחיתה דיפוזיה פסיבית של תרופות, מה שמאפשר הובלה ממוקדת במודלים של מכרסמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות של מיקרו-הזרקה
- מערכות להולכת תרופות
רקע
- הזרקות מיקרוסקופיות הן חיוניות להחדרה ישירה של חומרים אל המוח.
- שיטות מסורתיות עלולות לגרום לנזק מוחי משמעותי ולהספקה לא יעילה של תרופות.
- מחטי קפילריה מזכוכית מציעות פתרון לדיוק במיקוד.
- מחקר זה מתמקד בשיפור תהליך ההזרקה המיקרוסקופית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת מחטי קפילריה מזכוכית בעלות חלל פנימי (lumen) של 50-μm.
- שיפור הדיוק של הזרקת תרופות למבנים עמוקים במוח.
- צמצום הנזק המוחי במהלך תהליך ההזרקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור מחטי קפילריה מזכוכית בעלות lumen של 50 µm.
- מילוי המחט בשמן מינרלי כדי להקל על ההזרקה.
- טעינת המחט בחומר הרצוי או בתרחיף תאים.
- הזרקת החומר בקצב זרימה נמוך לאזורי מוח מטרים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת טרגוט מדויק של חומרים במוח.
- הפחתה משמעותית בנזקי המוח בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- העברה יעילה של תרופות, וקטורים ויראליים או השתלות תאים.
- יעילות מוכחת במודלים של מכרסמים.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה משפרת את הדיוק של מיקרו-הזרקות.
- היא מספקת שיטה מהימנה להחדרת תרופות במחקרים בנוירו-מדע.
- ניתן ליישם גישה זו על חומרים שונים, דבר המשפר את תוצאות הניסויים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הגשה מדויקת של סוכנים טיפוליים למבנים עמוקים במוח נותרת אתגר קריטי בפיתוח תרופות במדעי העצבים, ובמיוחד במודלים של בעלי חיים קטנים שבהם טראומה פרוצדורלית עלולה להטות את התוצאות. שיטת מיקרו-הזרקה זו משפרת את דיוק ההגעה למטרה על ידי מזעור נזקי רקמה הנגרמים מההזרקה ומזעור דיפוזיה פסיבית, ובכך היא משפרת את המהימנות של מחקרי התערבויות פרמקולוגיות וגנטיות. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אפשרות להגשה הדירה, בנפח נמוך, של תרופות, וקטורים ויראליים או השתלות תאים, תוך הפחתת השונות הביולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה מדויקת של היפותזות טיפוליות בגרעיני המוח העמוקים על ידי הפחתת השפעות לא רצויות הנובעות מטראומת ההזרקה.
- ערך תפעולי: תומך בהחדרה עקבית של תרכובות או כלים גנטיים לאורך מחקרים שונים, ובכך משפר את השחזוריות בתהליכי תיקוף של מטרות טיפוליות.
- ביטחון בחיזוי: ממזער שונות פרוצדורלית שעלולה להסוות תגובות פרמקולוגיות או ביולוגיות אמיתיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות עם עומס נגעים מינימלי לצורך סריקת תרכובות המשך במסלולים של ה-CNS.
- ערך תפעולי: מאפשר הזרקות סטנדרטיות בנפח נמוך (20–100 nl) המתאימות לפורמטים של בדיקות בדיוק גבוה הדורשים בקרה פרמקוקינטית קפדנית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתנת להתאמה לחומרים שונים (תרופות, וקטורים ויראליים, תאים) על ידי התאמת גודל חלל המחט, ובכך תומכת בקמפיינים של סריקה רב-מודאלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: משפר את נאמנות מודל המחלה על ידי הפחתת פגיעות מבלבלת הנובעת מהליכי הזרקה, ובכך משפר את הרלוונטיות התרגומית.
- ערך תפעולי: מאפשר התערבויות הדירות במחקרים אורכיים, ובכך תומך במשטרי מינון כרוני או בהשתלת תאים.
- קידום מותאם סיכונים: מגביר את הביטחון בנתוני מעורבות המטרה, ובכך מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) בתוכניות פרה-קליניות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של מולקולת העיסוק (lead optimization), כאשר הובלה מדויקת למערכת העצבים המרכזית (CNS) חיונית להערכת המודולציה של המטרה ומעורבות המסלול.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות במבני מוח עמוקים על ידי מתן אפשרות להחדרה מדויקת של גששים פרמקולוגיים או גנטיים.
- סריקה: מספקת מינון כמותי וניתן לשחזור להערכת תרכובות in vivo, דבר קריטי למחקרי תגובה למינון ותפוסת מטרה.
- אנליזה: מייצרת קריאות נקיות על ידי מזכור הרעש המושרה מהפרוצדורה, ובכך משפרת את גילוי האות במדידות של סממנים ביולוגיים או יעילות.
- מחקר תרגומי: מקדמת רציפות משלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי הבטחת החדרה עקבית עם טראומה נמוכה לאורך שלבי המחקר.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת סטנדרטית וניתנת להתאמה להחדרה למערכת העצבים המרכזית (CNS), הישמימה לפרויקטים ולשיטות עבודה מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית הנובעת מערטריפקטים של הזרקה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה בין מעבדות ומחקרים באמצעות הגדרת פרמטרי ההזרקה והכנת המחט.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת מספר המחקרים שנכשלו עקב שונות פרוצדורלית או השפעות חוץ-מטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד אמין יותר של סדרי עדיפויות למטרות CNS בהתבסס על נתונים פרמקולוגיים וגנטיים נקיים יותר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה, קואורדינציה סטריאוטקטית ויצירת מחטים באמצעות pipette puller ו-micro forge.
- תלוי בגישה למכשור ייעודי הכולל מסגרת סטריאוטקטית, מיקרו-מזרק ומיקרוסקופ להדמיית המחטים.
- מחייב סטנדרטיזציה של גודל חלל המחט (50 µm) ושל פרוטוקול המילוי (50% mineral oil) כדי להבטיח ביצועים עקביים בין משתמשים שונים.
- התאמה למערכות מודל שונות עשויה לדרוש התאמת קואורדינטות ותיקוף של עומק חדירת המחט.
- מגבלות מעשיות כוללות את המיומנות הטכנית הנדרשת למשיכת המחטים ולעיצוב הראש המשופע (beveling), וכן את הספיקה הנמוכה הגלומה במיקרו-הזרקה ידנית.
