Tri-שכבתית Electrospinning לחקות ארכיטקטורה העורקים באמצעות שפת Polycaprolactone, אלסטין, קולגן ו: מחקר ראשוני

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון כיצד שינויים בתכונות החומר של שכבות שונות עשויים להשפיע על התכונות המכניות הכוללות של השתל. מטרה זו מושגת על ידי הכנת תמיסות פולימר טבעיות וסינתטיות כדי לספק פרמטרי אלקטרו-ספינינג (electro spinning) אופטימליים. כשלב שני, יש לשלב את התמיסות ביחסים ספציפיים, אשר יספקו את השינוי הרצוי בתכונות החומר.

בשלב הבא, בצעו ספין-אלקטרו (electro spin) של התמיסות על גבי מנדריל גלילי כדי ליצור מבנה רב-שכבתי בעל תכונות מכניות משתנות. התוצאות שהתקבלו מראות שינויים בתכונות המכניות בהתבסס על ציות (compliance), חוזק קרע, שימור תפרים, בדיקת מתיחה חד-צירית וניתוח מתמטי. שלום, שמי מייקל מקלויר.

היום אדבר איתכם על ייצור של שתלים וסקולריים בעלי מבנה של שלוש שכבות באמצעות אלקטרוספינינג (electrospinning). אחד היתרונות המרכזיים של הטכניקה שלנו על פני טכניקות אחרות, כגון שתלים וסקולריים בעלי שכבה אחת, הוא היכולת לדייק את תכונות החומר בתוך שכבות בודדות, ובכך להשפיע על תכונות החומר המכניות הכוללות. לפני ביצוע האלקטרוספינינג, יש להפיק קולגן מעור בקר (bovine corium) בני שישה חודשים באמצעות תהליך המבוסס על חומצה אצטית. קולגן מופק זה עובר לאחר מכן טהרה באמצעות סדרה של תהליכי המסה, שקיעה ודיאליזה. יש לאסוף לפחות 500 milligrams של קולגן ליופיליז된 לצורך הליך האלקטרוספינינג.

בשלב הבא, באמצעות מבחנה לסנצילציה של 20 מיליליטר, הכינו תמיסה של polycaprolactone בריכוז 100 מיליגרם למילליליטר על ידי מדידה של 150 מיליגרם של גרגרי מונומר והמסה שלהם ב-50 מיליליטר של 1 1 1 3 3 3 hexa fluoro, two propanol. באותו הליך, הכינו שבעה מיליליטר של elastin בריכוז 200 מיליגרם למילליליטר, ושבעה מיליגרם למילליליטר של collagen. לאחר מכן, השתמשו בחמש מבחנות סנצילציה וערבבו בכל מבחנה נפח כולל של חמישה מיליליטר של תמיסות PCL, elastin ו-collagen ביחסי הנפח הבאים: 98 ל-2 ל-0 של PCL, elastin ו-collagen, המייצגים את ה-arterial intima; 45 ל-45 ל-10, 55 ל-35 ל-10 ו-65 ל-25 ל-10 של PCL, elastin ו-collagen, המייצגים את ה-arterial media; ו-70 ל-0 ל-30 של PCL, elastin ו-collagen עבור ה-arterial adventis.

כעת, באמצעות מחט בעלת קצה קהה בכיול 18 gauge ובנפח של שלושה מיליליטר, טענו שלושה מיליליטר של תמיסה למשאבת מזרקים. עבור התכונות החומריות האינדיבידואליות של כל תמיסת PCL Elastin collagen, הגדירו את קצב ההזרקה ל-4 milliliters per hour עבור נפח כולל של שלושה מיליליטר.

תמיסות אלו יעברו תהליך של טspinning חשמלי (electro spinning) על מנדריל מלבני כדי לתכנן השתמרים רב-שכבתיים עם תמיסות פולימר של PCL, אלסטין וקולגן. קצב ה-electro spinning ישתנה בהתאם למעבר ולשכבה המסתובבת; תמיסות הפולימר עבור האינטימה יעובדו בקצב של ארבעה מיליליטר לשעה ובנפח של 0.5 מיליליטר, ולאחריהם מעבר המשלב בין מזרקי האינטימה והמדיה תוך שימוש ב-0.2 מיליליטר ובקצב electro spinning של שני מיליליטר לשעה לכל אחד. לאחר מכן, יש לסגור את מזרק האינטימה ולבצע electro spinning לשכבת המדיה בנפח של 0.6 מיליליטר ובקצב של ארבעה מיליליטר לשעה.

לאחר מכן, בצעו מעבר בין מזרקי המדיה וה-adventis באמצעות 0.2 milliliters של תמיסת פולימר בקצב של שני milliliters לשעה לכל אחד. לבסוף, הפסיקו את פעולת מזרק המדיה והמשיכו בביצוע electro spinning ל-adventis למשך 0.4 milliliters בקצב של ארבעה milliliters לשעה. לאחר ה-electro spinning, השתמשו ב-50 millimolar EDC על כל דגימה והמתינו 18 שעות לקשירה צולבת (cross-linking) לפני המשך הבדיקות.

כדי לבחון פרמטרים של מתיחה חד-צירית בחומרים שיוצרו בסיב אלקטרו-ספוני (electrospun), ראשית יש להשרות את גליון הסיבים ב-15 milliliters של PBS בריכוז 1x למשך 24 שעות בצלחת פטרי. לאחר מכן, באמצעות מחלץ בצורת עצם כלב (dog bone punch) עם אורך מדידה של 7.5 millimeters ורוחב של 2.5 millimeter בנקודה הצרה ביותר, יש להוציא שש דגימות מהסדין הסיבי. צורה זו תבטיח את כשל החומר בנקודה הצרה ביותר שלו.

בשלב הבא, באמצעות מערכת בדיקה MTS Bionics 200, בדקו את דגימות ה-BUN של האלקטרודות עם תא כוח של 100 N וקצב התארכות של 10 מילימטר לדקה. השתמשו בתוכנת הבדיקות כדי לחשב את המאמץ המקסימלי (peak stress), המודולו והמתיחה בשבירה עבור כל מוצר חומר בנפרד. כדי לבדוק את עמידות התפרים של השתמרים רב-השכבתיים, אספו שישה דגימות צינוריות שונות של ספוג אלקטרוד בקוטר של שני מילימטר ובאורך של שלושה מילימטר, והשרו את הדגימות בצלחת פטרי עם 1x PBS למשך 24 שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C.

לאחר מכן השתמשו בתא עומס של 50 N ובקצב מתיחה של 150 millimeters per minute. כדי לבחון את עמידות התפרים באמצעות מערכת ה-MTX bionic 200, מקמו חמישה PDs מסחריים מסוג zero. Two violet monofilament.

בצעו תפר במרחק של שני מילימטרים מקצה הדגימה, תוך שימוש בקליפר למדידה, והמישכו עד שהתפר נמשך דרך השתל; רשמו את העומס המקסימלי בגרמים-כוח (gram's force) באמצעות TestWorks גרסה 4. כדי לבחון את חוזק הפיצוץ (burst strength) של השתלים המיוצרים באלקטרוספינינג, אספו שש דגימות צינוריות שונות נוספות המיוצרות באלקטרוספינינג בקוטר של שני מילימטרים ובאורך של שני עד שלושה סנטימטרים, והשרו אותן ב-PBS למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ההשריה, התאימו את הצינור מעל פטמה בקוטר 1.5 מילימטר המחוברת למכשיר, ואבטחו אותה באמצעות תפר משי 2-0 על ידי קשירת קשר כירורגי סביב קצה השתל והפטמה; לאחר מכן, הכניסו אוויר למערכת בדיקת הפיצוץ והגבירו את הלחץ בקצב של 5 mmHg לשנייה עד לפיצוץ הצינורות.

אספו נתונים על חוזק התגבשות (burst strength) כלחץ במילימטרים של כספית שבהם נקרעים השפופרות. לבסוף, העריכו את הגמישות הדינמית (dynamic compliance) על ידי השגת שש הש Transplant-ים של שפופרות בעלות קוטר של שני מילימטרים, שנלקחו משש הש Transplant-ים שונים שיוצרו בשיטת electrospun, ונחתכו לאורך של שלושה סנטימטרים. השרו את הדגימות ב-PBS למשך 24 שעות.

בטמפרטורה של 37 °C. התאימו את השתלים על פטמה בקוטר 1.5 מילימטר שיוצרה בהתאמה אישית, והדקו אותם באמצעות תפר משי 2-0 על ידי קשירת קשר מנתח. הניחו את השתלים בביוראקטור להנדסת רקמות חכמה באמצעות גירוי מכני שפותח על ידי Tissue Growth Technologies.

מלא את הביוראקטור ב-500 milliliters של PBS בטמפרטורה של 37 °C. הגדר את הביוראקטור לספק שינוי לחץ מחזורי של 1 hertz לחלק הפנימי של השתל, ובדוק שלושה רמות לחץ שונות של 90/50, 120/80 ו-150/110 millimeters of mercury עבור לחצים סיסטוליים ודיאסטוליים. כאשר פרוטוקולי ה-electro spinning מבוצעים כהלכה, המוצר הסופי צריך להיות צינור רך ללא תפרים כפי שניתן לראות כאן, ללא סימנים ראשוניים של דלמינציה בין השכבות.

צינור עם דלמינציה מוצג כאן לצורך השוואה. תמונה זו מספקת מידע על ערכי בדיקת מתיחה חד-צירית (UNI axial tensile test) עבור מאמץ שיא משיקי ומעוות עד לשבירה עבור שכבות אינטימה, מדיה ואדוונטיציה בודדות המכילות תערובות ספציפיות של PCL, אלסטין וקולגן. המגמות מצביעות על עלייה במאמץ השיא ובמודול המשיקי עם העלייה בתכולת ה-PCL, בעוד שהמעוות עד לשבירה פוחת. תוצאות שימור התפרים מוצגות כאן, כאשר E-P-T-F-E מראה את שימור התפרים הגבוה ביותר, והתערובת 65 ל-25 ל-10 היא הקרובה ביותר לסטנדרט של וריד ous המוצג כקו מקווקו; עורית פמורלית של חזיר שאינה חיונית ו-E-P-T-F-E נבדקו לצורך השוואה.

לחץ הפריצה, כפי שמוצג בגרף זה, מראה כי לחומרים של 55 ל-35 ל-10 ושל 65 ל-25 ל-10 יש את לחץ הפריצה הגבוה ביותר. נתון זה דומה ל-1,600 millimeters of mercury שדורש המכון האמריקאי לתקנים לאומיים (American National Standards Institute) עבור כל השתלי כלי דם המיועדים למסחירה. לבסוף, בדיקות גמישות (compliance) שנקבעו באמצעות רדאר פנימי בשלושה לחצי דם עורקיים ממוצעים שונים, מצביעות על כך שתוספת של PCL בשכבה המדיאלית בלבד עלולה לגרום לירידה הדרגתית בגמישות עבור כל שלושת סוגי הלחצים הפיזיולוגיים. החלק הקריטי ביותר במחקר זה הוא תהליך החקיקה.

בעת שימוש ביחס של שלושה לאחד בין הקלט לפלט, עלולה להתרחש הפסד מטען בפתח הדיזה. אם הדבר קורה, גם הבלט הקשור לפולימר שעובר כעת טspinning חשמלי עלול להקטן. דבר זה עלול לגרום לסיבים רטובים מרותכים ולהפרדה (delamination) בין שלוש השכבות.

לפיכך, פוטנציאל חשמלי עקבי הוא חיוני בעת ביצוע טכניקת electric spinning ליצירת graft וסקולרי תלת-שכבתי.