Name: פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: למדו הכלאה פלואורסצנטית כפולה לזיהוי שני שעתוקי mRNA במקביל ברזולוציית תא בודד במדגמי מוח טריים קפואים. שיטה זו מאפשרת חקירת ארגון מעגלי מוח ותבניות ביטוי גנים בנוירונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה נתמך על ידי מענקים של NIH / NIDCD וקרן שמיט אל RP.

פרוטוקול זה פותח ומעודן מבוסס על תקן ב-situ שיטות רדיואקטיבי ולא רדיואקטיבי הכלאה, שפותח בעבר על ידי אותנו ואחרים כדי לזהות אחד או שני מינים תמליל ברקמת המוח 1-7. פרוטוקול המתואר להלן בעל אורך כולל של 2 או 3 ימים, תלוי במספר הפרעות פרוצדורליות שנבחרו על ידי משתמש הקצה. כל הצעדים המפורטים להלן הם להתנהל בטמפרטורת החדר, למעט השלב riboprobe הכלאה ופוסט הכלאה שוטף. הפתרונות ואת מאגרים חובה לכל השלבים הכרוכים בשיטה זו ניתן למצוא בסוף פרוטוקול זה. 1. רקמות הכנה חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף ולחלץ המוח של הנבדק במהירות, ולמקם אותו לתוך תבנית פלסטיק בגודל הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי בינוני רקמות המוח עם Tek-הטבעה במהירות למקום תבנית פלסטיק באמבטיה dry-ice/alcohol להקפאה מהירה. רקמה קפואים ניתן לאחסן -80 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cryostat, לאסוף 2 או 3 חלקים במוח לכל שקופית על Superfrost פלוס שקופיות טעונה. עובי סעיפים צריך להיות 10-12 מיקרומטר. שקופיות ניתן לאחסן ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol> 2. הכנת Sephadex G50 עמודות עבור טיהור Probe "עמודות Sephadex ניתן לרכוש ממקורות מסחריים, לעומת זאת, אנו מספקים להלן אלטרנטיבה בעלות נמוכה עבור הדור של עמודות, אשר יידרש לטיהור בדיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות מספקת של אבקת מימה G50 Sephadex עם מים RNase ללא DEPC שטופלו, (למשל, 2 גרם של אבקת ב 100 מ"ל מים DEPC שטופלו), פתרון בקצרה לערבב לאחסן בטמפרטורת החדר כדי לזרז Sephadex עודף G50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant (השכבה העליונה של המים) בעקבות משקעים G50 Sephadex. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך מעל 3-5 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, מחדש להשעות את הפתרון G50 Sephadex ב TE חיץ (1:1 יחס), ולאחסן בבית 4 ° C עד השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום autoclaved צמר זכוכית לתוך מזרק 1 מ"ל סטרילי ו לדחוס אותו עם הבוכנה כדי ליצור שכבה קומפקטית בתחתית, ולאחר מכן למקם את המזרק לתוך צינור פלקון 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את הפתרון של Sephadex G50 ב TE. מלאו את המזרק / טור עם הפתרון הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה העמודה במשך 30 שניות בסל"ד 1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על נוהל זה עד טור מלא כמעט לחלוטין עם Sephadex G50 חרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 200 μl של חיץ טור כביסה לעמודה ו צנטריפוגה זה 2 דקות בסל"ד 1000. בטל זרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 200 μl של חיץ טור חסימת לעמודה ומסובב אותו 2 דקות בסל"ד 1000. חזור על פעולה זו 4-5 פעמים צעד לאזן העמודה. עמודות ניתן לאחסן 4 ° C עד השימוש אם חתום Parafilm. </li></ol> 3. סימון טיהור Riboprobes להלן פירוט אנחנו דור וטיהור של riboprobe יחיד. עבור dFISH, הכנת כל בדיקה תכלול את המתודולוגיה זהה, פרט לכך אחד בדיקות תסווג digoxigenin (DIG)-tagged UTP ואילו אחרים עם ביוטין-tagged UTP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מרוכז (&gt; 150 ng / μl) וטיהר פתרון cDNA לינארית של עניין או ליצור תחושה (שליטה) או riboprobes antisense. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור מ"ל 1.5 microfuge, להוסיף 0.5-1 מיקרוגרם של מטוהרים תבנית cDNA, 2 μl של חיץ בדיקה 5X תיוג, 1 μl DIG של 10X (או ביוטין) תיוג לערבב, 0.5 μl של RNasin ו 1 μl של פולימראז RNA המתאים , ולהביא את הנפח הסופי של הפתרון μl 10 עם RNAse חינם (DEPC שטופלו) מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הפתרון באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף μl 1 של tRNA (מניות, 20 מיקרוגרם / μl), וכן 39 μl של חיץ טור חסימת לפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העמודה G50 Sephadex לטיהור בדיקה. לשם כך, להוסיף 50 חיץ חסימת μl לעמודה ומסובב אותו במשך 10 שניות בסל"ד 1000. חזור על פעולה זו 2-3 פעמים לאזן את העמודה (כלומר, 50 μl מלא להחיל בעמודה הם התאוששו לאחר מחזור של צנטריפוגה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת הפתרון בדיקה העמדה G50 Sephadex טור, שפופרת microfuge חדש בתחתית העמוד, ואת זה ספין 3 דקות בסל"ד 1000 כדי להשיג את מטוהרים 50 μl של פתרון riboprobe. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת איכות תשואה של riboprobe שכותרתו או באמצעות תקן פורמלדהיד-agarose RNA ג'ל או ספקטרופוטומטר. </li></ol> 4. פוסט קיבעון, acetylation ו הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של חלקים מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס ולאפשר טמפרטורת חדר לאזן. לאחר מכן, דגירה מקטעים פתרון קר טרי מתוצרת, paraformaldehyde 3% עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף מקטעים phosphate בופר סליין (PBS) פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש חלקים באמצעות סדרה אלכוהול רגיל (70, 95, ו - 100%; 2 דקות כל אחד), ולתת להם אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מקטעים פתרון acetylation עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את סעיפים 3 פעמים 2X SSPE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליבש חלקים שוב דרך הסדרה אלכוהול רגיל שתוארו לעיל, ולאפשר להם אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נפח נאותה פתרון הכלאה ולהוסיף גם riboprobes לפתרון (ריכוז בדיקה: 1 ng / μl בדיקה עבור כל אחד). נפח כולל של התמיסה ההכלאה נקבעת על פי מספר סעיפים להיות הכלאה (16 μl של הכלאה פתרון לכל קטע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל נפח נאותה של הפתרון הכלאה לשקופיות רקמות coverslip להבטיח כי לא שכבת בועות אוויר הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מחזיק שקופיות שקופיות מתכת. בעל לטבול באמבט שמן מינרלי נקבע על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ודא coverslips מתמודדים כלפי מעלה (כלומר, את ההיבט לרוחב של בעל שקופית צריך להיות במגע עם החלק התחתון של המיכל שמן מינרלי). </li></ol> 5. פוסט הכלאה רוחצת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר בזהירות את מחזיק השקופיות מהאמבטיה שמן מינרלי בקצרה לשטוף אותו כלורופורם כדי להסיר עודפי שומן מן השקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום שקופיות פתרון 2X SSPE 5-10 דקות. Coverslips צריך להתנתק שקופיות ואילו הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות פתרון חדש SSPE 2X, ולשמור אותם במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לתוך תמיסה המכילה 2X SSPE לפוראמיד בתוספת 50%. הטמפרטורה של פתרון זה צריך להתאים את טמפרטורת השתמשו בהליך הכלאה בין לילה. שמור שקופיות פתרון זה עבור 1.5 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת חלקים לפתרון 0.1X SSPE מראש התחמם לטמפרטורה באותו השלב הכלאה. דגירה סעיפים בפתרון זה למשך 30 דקות. חזור על שלב זה עבור 30 דקות נוספות. </li></ol> 6. איתור ויזואליזציה של Riboprobes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות למאגר TNT אשר מי חמצן 0.3% נוספה, במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקטעים TNT חיץ, 3 פעמים (10 דקות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות עט DAKO, לצייר היטב סביב האזור המכיל את החלקים במוח. חשוב לציין, יש להיזהר כדי להבטיח חלקים שאינם יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 150 μl של חיץ TNB להחליק כל אחד, דגירה סעיפים בפתרון זה למשך 30 דקות, בתא לח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון TNB עודף על ידי הטיית שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 150 μl של פתרון TNB המכיל-מצומדות peroxidase אנטי DIG נוגדן, ומחליק לאחסן בתא לח במשך שעה 2. ריכוז נוגדן צריך להיקבע בנפרד עבור כל תמליל של עניין לפני ביצוע dFISH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקטעים TNT חוצץ; 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 150 μl של אלקסה 594-מצומדות פתרון tyramide פועלים כל שקופית, ולאחסן אותם בתא לח במשך שעות 1. פתרון זה אמור להיות מוכן על פי ההוראות של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקטעים TNT חוצץ; 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים דגירה במאגר TNT אשר מי חמצן 0.3% נוספה עבור 10 - 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקטעים TNT חוצץ; 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 150 μl של חיץ TNB לכל שקופית, ולשמור אותם בתא לח למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון TNB עודף על ידי הטיית שקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של פתרון TNB המכיל-מצומדות peroxidase אנטי ביוטין נוגדן, ומחליק לאחסן בתא לח במשך שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקטעים TNT חוצץ; 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 150 μl של אלקסה 488-מצומדות פתרון tyramide עובד על השקופיות וחתכים דגירה עבור שעות 1. פתרון זה אמור להיות מוכן על פי המלצות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מקטעים TNT חוצץ; 3 פעמים, 10 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl של Hoechst פתרון (1:1000 ב-TNT החיץ) בסעיפים ולשמור אותם בתא לח דקות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הסעיפים TNT חוצץ; 3 פעמים, 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip חלקים בינוני עם הקרינה תואמת הרכבה (למשל, Vectashield או להאריך antifade). </li></ol> 7. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2102/2102fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. כאן אנחנו מראים תוצאות dFISH נציג להשיג במוח זברה פינק. המוצגים הם photomicrographs המתקבלים nidopallium caudomedial (מלח"י), אנלוגי ציפור שיר של קליפת המוח השמיעתית יונקים. חלקים במוח היו הכלאה עם riboprobe biotinylated נגד parvalbumin (A), סמן האוכלוסייה משנה של נוירונים מעכבים, ו-DIG שכותרתו riboבדיקה מכוונת נגד הפעילות תלויי גן zenk (ב), סמן אמין שיר מונחה נוירונים. ג) כיסוי של (א) ו - (ב) מראה אוכלוסיה של נוירונים מעכבים אשר מופעלים על ידי ניסיון שמיעתי. חצים וראשי חץ עולה תאים שכותרתו בלעדי עם כל אחד משני riboprobes ו כוכביות להראות נוירונים נציג במשותף להביע הן תעתיקים של עניין. בר סולם = 25 מיקרומטר.

<ol><li>Jin, L., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization: methods and applications.</a> J Clin Lab Anal. 11, 2-9 (1997).</li>
<li>Stoler, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Clin Lab Med. 10, 215-236 (1990).</li>
<li>Komminoth, P., Werner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+and+signal+amplification%3A+approaches+to+increase+the+sensitivity+of+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22+Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Target and signal amplification: approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization.</a> Histochem Cell Biol. 108, 325-3233 (1997).</li>
<li>Kessler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+digoxigenin%3Aanti-digoxigenin+%28DIG%29+technology--a+survey+on+the+concept+and+realization+of+a+novel+bioanalytical+indicator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">The digoxigenin:anti-digoxigenin (DIG) technology--a survey on the concept and realization of a novel bioanalytical indicator system.</a> Mol Cell Probes. 5, 161-205 (1991).</li>
<li>Panoskaltsis-Mortari, A., Bucy, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+with+digoxigenin-labeled+RNA+probes%3A+facts+and+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization with digoxigenin-labeled RNA probes: facts and artifacts.</a> Biotechniques. 18, 300-307 (1995).</li>
<li>Qian, X., Lloyd, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+signal+amplification+methods+for+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Recent developments in signal amplification methods for in situ hybridization.</a> Diagn Mol Pathol. 12, 1-13 (2003).</li>
<li>Mello, C. V., Jarvis, E. D., Denisenko, N., Rivas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+song-regulated+genes+in+the+brain+of+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of song-regulated genes in the brain of songbirds.</a> Methods Mol Biol. 85, 205-217 (1997).</li>
<li>Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+participate+in+the+brain%27s+response+to+birdsong+auditory+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons participate in the brain's response to birdsong auditory stimulation.</a> Eur J Neurosci. 20, 1318-1330 (2004).</li>
<li>Velho, T. A., Pinaud, R., Rodrigues, P. V., Mello, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-induction+of+activity-dependent+genes+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Co-induction of activity-dependent genes in songbirds.</a> Eur J Neurosci. 22, 1667-1678 (2005).</li>
<li>Tremere, L. A., Jeong, J. K., Pinaud, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+shapes+auditory+processing+in+the+adult+brain+by+regulating+inhibitory+transmission+and+plasticity-associated+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estradiol shapes auditory processing in the adult brain by regulating inhibitory transmission and plasticity-associated gene expression.</a> J Neurosci. 29, 5949-5963 (2009).</li>
<li>Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+two+mRNA+species+at+single-cell+resolution+by+double-fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization.</a> Nat Protoc. 3, 1370-1379 (2008).</li>
<li>Pinaud, R., Jeong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+fluorescence+in+situ+hybridization+in+the+study+of+gene+co-regulation+in+the+vertebrate+brain.+Methods+Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Duplex fluorescence in situ hybridization in the study of gene co-regulation in the vertebrate brain. Methods Mol Biol.</a> 611, 115-129 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השתמשנו בפרוטוקול זה כדי ללמוד כיצד המוח חוליות מאורגן neurochemically והן מבחינה תפקודית, ולקבוע כיצד התנהגותית הרלוונטיים השפעת גירויים חושיים מנגנון גנטי של נוירונים במוח מבוגר 80-10. השתמשנו בשיטה זו בהצלחה ברקמת המוח של עכברים, חולדות, ציפורי שיר, אבל צופים כי פרוטוקול זה יהיה להתאמה בקלות לחלקים במוח המתקבל מערך של בעלי החוליות, ואולי לא עצביים לרקמות. בקרות מפתח הנדרש להשגת תוצאות אמינות האות האופטימלי היה מפורט בהרחבה על ידי הקבוצה שלנו במקום אחר 11, 12.</s...

פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור חיץ כביסה: 10 mM טריס-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 מיקרוגרם / μl tRNA, SDS 0.1% במים 50 DEPC שטופלו מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טור חיץ חסימה: 10 mM טריס-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA במים 50 DEPC שטופלו מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TNT חיץ: 60 מ&quot;ל של טריס 1 M-HCl, 18 מ&quot;ל של 5 M NaCl ו - 1.8 מ&quot;ל של טריטון X-100 ב 600 מ&quot;ל מים DEPC שטופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TNB חיץ: 100 מ&quot;מ טריס-HCl, 8.3 מיקרוגרם / μl BSA, 0.15 מ NaCl ו - 3% Triton X-100 במים DEPC שטופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE חיץ: 10 mM טריס-HCl, pH 7.5 פלוס 1 mM EDTA, pH 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון acetylation: 2.7 מ&quot;ל של triethanolamine בתוספת של 0.5 מ&quot;ל אנהידריד אצטית ב 200 מ&quot;ל מים DEPC שטופלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Hybridization: לפוראמיד 50%, 2X SSPE, 2 מיקרוגרם / μl tRNA, 1 מיקרוגרם / μl BSA ו 1 מיקרוגרם / μl פולי במים DEPC שטופלו. הוא זקוק לכל סעיף 16 l. </li></ol>

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections

כאן אנו מתארים גירסה שונה של פלואורסצנטי כפול<em&gt; באתרו</em&gt; (DFISH) שיטה הכלאה מותאם לאיתור two mRNAs עניין טרי חלקים במוח קפוא. הקבוצה שלנו השתמשה בהצלחה גישה זו במחקר גנטי משותף תקנה. באופן ספציפי יותר, השתמשנו בשיטה זו dFISH לחקור את ארגון אנטומי, תכונות neurochemical, ואת ההשפעה של החוויה החושית במעגלים החושית המרכזית, ברזולוציה של תא בודד. פרוטוקול זה קיבל תוקף ברקמת המוח של עכברים, חולדות ציפורי שיר אך צפוי להיות להתאמה בקלות למינים חוליות אחרים, כמו גם מערך של אי - עצביים לרקמות. בסרט זה אנו מספקים הפגנה מפורט של הצעדים העיקריים של הליך זה.

פרוטוקול זה כרוך לא רדיואקטיבי<em&gt; ב-situ</em&gt; הליך הכלאה המאפשר זיהוי סימולטני של שני מינים התמליל, ברזולוציה של תא בודד, בסעיפים דק של המוח החולייתנים.

כאן אנו מתארים גרסה שונה של שיטת היברידיזציה פלואורסצנטית כפולה באתר (dFISH), שעברה אופטימיזציה לצורך זיהוי של שני mRNA רצויים בדגימות טריות של...

שלום, אני JA, עמית פוסט-דוקטורט במעבדה המסייעת ב-AL באוניברסיטה של רוצ'סטר. נדגים לכם את שיטת העיכול ההיברידי של Process Institute בחתכים של מוח קפוא טרי, לצורך זיהוי של שני תמלילי MRN בו-זמנית ברזולוציה של תא בודד. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות בתחום מדעי המוח, כגון שאלות הנוגעות לארגון האנטומי, התפקודי, המולקולרי והנוירוכימי של מעגלי מוח ספציפיים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קרישתו של גן בנוירונים של מוח AV, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון מכרסמים, וכן במגוון רחב של רקמות עצביות. כדי להתחיל בהליך זה, יש להמיס כמות מספקת של אבקת SDX G 50 עם RNAs במים.ערבבו את התמיסה קצרות ואחסנו בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד חמש דקות. שלב זה מפריד את חרוזי ה-SDX מהדקסטרוז הנמצא באבקת sedex מסחרית לאחר שיקוע ה-Sedex G 50. הסירו את ה-sennet וחזרו על התהליך שלוש עד חמש פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, השביתו מחדש את תמיססת ה-SX G 50 בבופר TE ביחס של נפח בופר לנפח חרוזים של אחד ለአחד, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.כעת, הכינו את העמודות. הכניסו צמר זכוכית שעבר עיקור באוטוקלב למזרק סטרילי של 1 ml ודחסו אותו באמצעות הבוכנה כדי ליצור שכבה דחוסה בתחתית. לאחר מכן, הכניסו את המזרק לפקעת פאלקון של 15 ml.מלאו את העמודות בתמיסת Sedex G 50 באמצעות סנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך 30 שניות, תוך שימוש בסנטריפוגת Beckman המצוידת ברוטור זווית קבוע מדגם C 0 6 5 0. לאחר הסנטריפוגה, שטפו כל עמודה על ידי הוספה של 200 µl של בופר שטיפה לעמודות וסנטריפוגה למשך שתי דקות ב-1000 סל"ד.כמו קודם לכן. לבסוף, יש להוסיף 200 µL של תמיסת חסימה לעמודה (column blocking buffer) לכל עמודה ולסבב במשך שתי דקות במהירות של 1000 rpm. חזור על שלב זה ארבע עד חמש פעמים כדי להגיע לשיווי משקל בעמודה.אחסן את העמודות שהוכנו בטמפרטורה של 4 °C עד שגשש ה-RIBA יסומן ויהיה מוכן לניקוי. עבור פרוצדורת ה-C2 hybridization או ה-D FISH עם פלורסצנציה כפולה המוצגת כאן, מכינים שני גששני RNA, אחד מסומן ב-digoxigenin או DIG והשני בביוטין. התחל את סימון הגששנים על ידי הכנת תמיסות הסימון לגששני הריבו והדגרת תגובות הסימון במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. בסיום ההדגרה של שעתיים, הוסף לכל תגובת סימון 1 µL של TRNA בריכוז 20 µg/µL ו-39 µL של בופר חסימת עמודות.לאחר מכן, הכין את עמודי ה-EDEX G 50 לטיהור הפרובים על ידי הוספת 50 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל עמוד וסבב של שלוש דקות במהירות של 2000 rpm. חזור על שלב זה פעמיים עד שלוש פעמים כדי להגיע לשיווי משקל בעמודים. כאשר העמודים מוכנים, הנח מבחנת EEND orph חדשה בתחתית העמוד.השלימו את הפסקת תמיסת הגשש לעמודת Sedex G 50 וסובבו למשך שלוש דקות במהירות של 2000 סיבובים לדקה. כדי לקבל 50 µL מטוהרים של תמיסת Ribo probe, העריכו את האיכות והניב של ה-ribo probe המסומן והמטוהר. לפני המעבר להיברידיזציה באמצעות קריוסטט, אספו שני או שלושה חתכי מוח על גבי שקופיות charge super frost plus.עובי החיתוך צריך להיות 10 עד 12 מיקרון. ניתן לשמור את השקופיות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. דגרו את החיתוכים בתמיסת 3% para formaldehyde קרה שהוכנה טריה למשך חמש דקות.לאחר מכן, שטפו קצרות את החתכים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, בצעו דהידרציה של החתכים באמצעות סדרה סטנדרטית של תמיסות אתנול בריכוזים של 70, 95 ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה. לאחר דהידרציה של החתכים, דגרו אותם בתמיסת אצטילציה שהוכנה טרי לפני 10 דקות.לאחר מכן, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-two times SSPE. בשלו את החתכים לאחר האצטילציה פעם נוספת באמצעות סדרת האלכוהול הסטנדרטית כפי שהודגמה זה עתה. כעת התחילו את ההיברידיזציה עם גשש ה-ribo. מרחו נפח מספיק של תמיסת היברידיזציה על הרקמה, כסו את השקופיות בכיסויי זכוכית והניחו את השקופיות במחזיק שקופיות ממתכת.הטבילו את מחזיק השקופיות באמבט שמן מינרלי בטמפרטורה של 65 °C למשך לילה. למחרת, הוציאו בזהירות את מחזיק השקופיות מאמבט השמן המינרלי ושטפו אותו קצרות בכלורופורם כדי להסיר עודפי שמן מהשקופיות.הניחו את השקופיות בתמיסת SSPE ריכוז פי 2 למשך 5 עד 10 דקות כדי להסיר את זכוכית הכיסוי. לאחר הסרת זכוכית הכיסוי, העבירו את השקופיות לתמיסת SSPE חדשה בריכוז פי 2 והשאירו אותן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; בתחילת שלב דגירה זה, חממו מראש תמיסה של SSPE ריכוז פי 2 בתוספת 50% formamide לאותה טמפרטורה כפי שנקבע לשלב ההכלאה (hybridization). בסיום הדגירה של שעה אחת.העבירו את השקופיות לתוך תמיסת SSPE בריכוז פי 2 שחוממה מראש והדגירו למשך 1.5 שעות. בתחילת שלב דגירה זה, חממו מראש תמיסת SSPE בריכוז 0.1 פי לאותה טמפרטורה שבה בוצע שלב ההיברידיזציה. השלימו את שטיפות הפוסט-היברידיזציה על ידי העברת השקופיות לתמיסת SSPE בריכוז 0.1 פי שחוממה מראש והדגירו למשך 30 דקות.חזור על שטיפה זו פעם אחת. נתחי המוח מוכנים כעת לגילוי ולהדמיה של גששי ה-ribo שהתגבשו; הוסף 0.3% hydrogen peroxide ל-TNT buffer והדגה את השקופיות בתמיסה זו למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטוף את השקופיות ב-TNT buffer שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם באמצעות deco pen.שרטטו מסגרת (well) סביב האזור המכיל את חתכי המוח. טפטפו 150 µL של תמיפת TNB buffer לכל 슬ייד והבאיו את החתכים בתמיסה זו למשך 30 דקות. ודאו שהחתכים אינם מתייבשים במהלך שלב זה.בשלב הבא, יש להוסיף 150 µL של תמיסת TT NB המכילה נוגדן anti DIG המשורשר ל-peroxidase, ולאחסן את השקיפות בתא לחות למשך שעתיים. בתום דגירה של שעתיים, יש לשטוף את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות. בכל פעם יש להוסיף 150 µL של תמיסת עבודה של T IDE המשורשרת ל-Alexa 5 9 4 לכל שקופית, ולאחסן את השקיפות בתא לחות למשך שעה אחת.בסיום שעה אחת, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות. בכל פעם, הדגירו את החתכים במי פחמימנים (hydrogen peroxide) בריכוז 0.3% בתמיסת בופר TNT למשך 10 עד 30 דקות. זמן ההדגרה בתמיסת מי הפחמימנים תלוי בשפע ה-mRNA ויש לבחון אותו לפני ביצוע ה-D fish.לאחר מכן, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. גרעו 150 µL של בופר TMB לכל סלייד והשאירו את הסליידים בתא לח כדי ל-30 דקות. הסירו את עודפי תמיסת ה-TMB על ידי הטיית הסליידים.הוסף 150 µL של תמיסת TMB המכילה נוגדן anin המשורשר ל-peroxidase, ואחסן את השקופיות בתא לחות למשך שעתיים. לאחר מכן, שטוף את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות. בכל פעם, מרח 150 µL של תמיסת עבודה של mite המשורשרת ל-Alexa 488 על השקופיות והדגר את החתכים למשך שעה אחת.לאחר מכן, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. כעת, לאחר ששתי הגששים של ה-ribo סומנו על ידי נוגדנים, דגרו את החתכים ב-150 µL של תמיסת מארח למשך שתי דקות. לאחר מכן, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם, הוסיפו לחתכים מדיום קיבוע התואם לפלואורסצנציה, כגון Vector Shield או Prolong Antifade, כסו בזכוכית כיסוי ובחנו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.מיקרוגרפיות תמונה מייצגות אלו הן מניסוי דגי דגים עם חתכי מוח של פנזיבר (zebra finch), ספציפית מאזור ה-NCM, המקביל בציפורי שירה לקליפת המוח השמיעתית של יונקים. חתכי המוח עברו היברידיזציה עם שתי גששים, ריבו-גשש (ribo probe) ביוטיניליagainst par albumin, סמן עבור תת-אוכלוסייה של נוירונים מעכבים, וריבו-גשש מסומן ב-DIG המופנה נגד הגן התלוי-פעילות zinc, סמן מהימן לנוירונים המונעים על ידי שירה. חפיפה של שתי התמונות מראה אוכלוסיית תאים של נוירונים מעכבים המופעלים על ידי ניסיון שמיעתי.חצי חצים מצביעים על תאים המסומנים באופן בלעדי עם הגשושית (probe) של ה-ribo עבור par. חצים של אלבומין מצביעים על תאים המסומנים באופן בלעדי עם הגשושית של ה-RIBA עבור אבץ, המייצגים נוירונים. תאים המבטאים את שני התמלילים המבוקשים מסומנים בכוכבית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שולחן העבודה נקי ולהשתמש בתמיסות, פלסטיקה וזכוכית נקיים מזיהומים.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות בו-זמנית שני מיני MA, ברזולוציה של תא בודד בחתכי מוח שהקפאו בטריות, כדי לחקור רגולציה משותפת של גנים במוח של חולדה. תודה לצפייה בסרטון. בהצלחה בניסוייכם.

double-fluorescence-in-situ-hybridization-in-fresh-brain-sections

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה תאים תמונה שכותרתו fluorescently למחצה עבה פרוסות המוח. על ידי תיקון, חיתוך, ואת אופטית ניקוי רקמת המוח אנו מתארים כיצד הדמיה epifluorescent או confocal רגיל יכול לשמש כדי לחזות תאים בודדים ורשתות נוירונים בתוך רקמת העצבים ללא פגע.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר.  J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד להעביר באופן ספציפי אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית C57BL/6 באמצעות אלקטרופורציה ברחם. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות לטרנספקציות של אזורים המתפתחים לקליפת המוח, ההיפוקמפוס, התלמוס, ההיפותלמוס, גרעין המחיצה הצדדית והסטריאטום.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופ אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים לאחר הטבעה של Epon באמצעות חלבון פלואורסצנטי הנקרא mScarlet. שיטה זו יכולה לשמור על הפלואורסצנטיות ועל מבנה העל בו זמנית. טכניקה זו מקובלת על מגוון רחב של יישומים ביולוגיים.

הטבעת אור מתאם ומיקרוסקופ אלקטרונים

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

מחקר זה מציג פרוטוקול פשוט לעיבוד רקמות הכולל עריפת ראש, קיבוע, קריוסקציה, צביעה פלואורסצנטית, צביעה חיסונית והדמיה, שניתן להרחיב להדמיה קונפוקלית ורב-פוטונית. השיטה שומרת על יעילות דומה לדיסקציות מורכבות, ועוקפת את הצורך במיומנויות מוטוריות מתקדמות. ניתוח תמונה כמותי מספק פוטנציאל חקירה נרחב.

הקפאה ישירה של ראשי דרוזופילה לצביעה פלואורסצנטית משופרת של המוח וצביעה חיסונית

למדו הכלאה פלואורסצנטית כפולה לזיהוי שני שעתוקי mRNA במקביל ברזולוציית תא בודד במדגמי מוח טריים קפואים. שיטה זו מאפשרת חקירת ארגון מעגלי מוח ותבניות ביטוי גנים בנוירונים.

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

גלה סרטונים נוספים