פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

שלום, אני JA, עמית פוסט-דוקטורט במעבדה המסייעת ב-AL באוניברסיטה של רוצ'סטר. נדגים לכם את שיטת העיכול ההיברידי של Process Institute בחתכים של מוח קפוא טרי, לצורך זיהוי של שני תמלילי MRN בו-זמנית ברזולוציה של תא בודד. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות בתחום מדעי המוח, כגון שאלות הנוגעות לארגון האנטומי, התפקודי, המולקולרי והנוירוכימי של מעגלי מוח ספציפיים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי קרישתו של גן בנוירונים של מוח AV, ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון מכרסמים, וכן במגוון רחב של רקמות עצביות. כדי להתחיל בהליך זה, יש להמיס כמות מספקת של אבקת SDX G 50 עם RNAs במים.

ערבבו את התמיסה קצרות ואחסנו בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד חמש דקות. שלב זה מפריד את חרוזי ה-SDX מהדקסטרוז הנמצא באבקת sedex מסחרית לאחר שיקוע ה-Sedex G 50. הסירו את ה-sennet וחזרו על התהליך שלוש עד חמש פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, השביתו מחדש את תמיססת ה-SX G 50 בבופר TE ביחס של נפח בופר לנפח חרוזים של אחד ለአחד, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.

כעת, הכינו את העמודות. הכניסו צמר זכוכית שעבר עיקור באוטוקלב למזרק סטרילי של 1 ml ודחסו אותו באמצעות הבוכנה כדי ליצור שכבה דחוסה בתחתית. לאחר מכן, הכניסו את המזרק לפקעת פאלקון של 15 ml.

מלאו את העמודות בתמיסת Sedex G 50 באמצעות סנטריפוגה ב-1000 סל"ד למשך 30 שניות, תוך שימוש בסנטריפוגת Beckman המצוידת ברוטור זווית קבוע מדגם C 0 6 5 0. לאחר הסנטריפוגה, שטפו כל עמודה על ידי הוספה של 200 µl של בופר שטיפה לעמודות וסנטריפוגה למשך שתי דקות ב-1000 סל"ד.

כמו קודם לכן. לבסוף, יש להוסיף 200 µL של תמיסת חסימה לעמודה (column blocking buffer) לכל עמודה ולסבב במשך שתי דקות במהירות של 1000 rpm. חזור על שלב זה ארבע עד חמש פעמים כדי להגיע לשיווי משקל בעמודה.

אחסן את העמודות שהוכנו בטמפרטורה של 4 °C עד שגשש ה-RIBA יסומן ויהיה מוכן לניקוי. עבור פרוצדורת ה-C2 hybridization או ה-D FISH עם פלורסצנציה כפולה המוצגת כאן, מכינים שני גששני RNA, אחד מסומן ב-digoxigenin או DIG והשני בביוטין. התחל את סימון הגששנים על ידי הכנת תמיסות הסימון לגששני הריבו והדגרת תגובות הסימון במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. בסיום ההדגרה של שעתיים, הוסף לכל תגובת סימון 1 µL של TRNA בריכוז 20 µg/µL ו-39 µL של בופר חסימת עמודות.

לאחר מכן, הכין את עמודי ה-EDEX G 50 לטיהור הפרובים על ידי הוספת 50 µL של תמיסת חסימה (blocking buffer) לכל עמוד וסבב של שלוש דקות במהירות של 2000 rpm. חזור על שלב זה פעמיים עד שלוש פעמים כדי להגיע לשיווי משקל בעמודים. כאשר העמודים מוכנים, הנח מבחנת EEND orph חדשה בתחתית העמוד.

השלימו את הפסקת תמיסת הגשש לעמודת Sedex G 50 וסובבו למשך שלוש דקות במהירות של 2000 סיבובים לדקה. כדי לקבל 50 µL מטוהרים של תמיסת Ribo probe, העריכו את האיכות והניב של ה-ribo probe המסומן והמטוהר. לפני המעבר להיברידיזציה באמצעות קריוסטט, אספו שני או שלושה חתכי מוח על גבי שקופיות charge super frost plus.

עובי החיתוך צריך להיות 10 עד 12 מיקרון. ניתן לשמור את השקופיות בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. דגרו את החיתוכים בתמיסת 3% para formaldehyde קרה שהוכנה טריה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, שטפו קצרות את החתכים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, בצעו דהידרציה של החתכים באמצעות סדרה סטנדרטית של תמיסות אתנול בריכוזים של 70, 95 ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה. לאחר דהידרציה של החתכים, דגרו אותם בתמיסת אצטילציה שהוכנה טרי לפני 10 דקות.

לאחר מכן, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-two times SSPE. בשלו את החתכים לאחר האצטילציה פעם נוספת באמצעות סדרת האלכוהול הסטנדרטית כפי שהודגמה זה עתה. כעת התחילו את ההיברידיזציה עם גשש ה-ribo. מרחו נפח מספיק של תמיסת היברידיזציה על הרקמה, כסו את השקופיות בכיסויי זכוכית והניחו את השקופיות במחזיק שקופיות ממתכת.

הטבילו את מחזיק השקופיות באמבט שמן מינרלי בטמפרטורה של 65 °C למשך לילה. למחרת, הוציאו בזהירות את מחזיק השקופיות מאמבט השמן המינרלי ושטפו אותו קצרות בכלורופורם כדי להסיר עודפי שמן מהשקופיות.

הניחו את השקופיות בתמיסת SSPE ריכוז פי 2 למשך 5 עד 10 דקות כדי להסיר את זכוכית הכיסוי. לאחר הסרת זכוכית הכיסוי, העבירו את השקופיות לתמיסת SSPE חדשה בריכוז פי 2 והשאירו אותן למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר; בתחילת שלב דגירה זה, חממו מראש תמיסה של SSPE ריכוז פי 2 בתוספת 50% formamide לאותה טמפרטורה כפי שנקבע לשלב ההכלאה (hybridization). בסיום הדגירה של שעה אחת.

העבירו את השקופיות לתוך תמיסת SSPE בריכוז פי 2 שחוממה מראש והדגירו למשך 1.5 שעות. בתחילת שלב דגירה זה, חממו מראש תמיסת SSPE בריכוז 0.1 פי לאותה טמפרטורה שבה בוצע שלב ההיברידיזציה. השלימו את שטיפות הפוסט-היברידיזציה על ידי העברת השקופיות לתמיסת SSPE בריכוז 0.1 פי שחוממה מראש והדגירו למשך 30 דקות.

חזור על שטיפה זו פעם אחת. נתחי המוח מוכנים כעת לגילוי ולהדמיה של גששי ה-ribo שהתגבשו; הוסף 0.3% hydrogen peroxide ל-TNT buffer והדגה את השקופיות בתמיסה זו למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטוף את השקופיות ב-TNT buffer שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם באמצעות deco pen.

שרטטו מסגרת (well) סביב האזור המכיל את חתכי המוח. טפטפו 150 µL של תמיפת TNB buffer לכל 슬ייד והבאיו את החתכים בתמיסה זו למשך 30 דקות. ודאו שהחתכים אינם מתייבשים במהלך שלב זה.

בשלב הבא, יש להוסיף 150 µL של תמיסת TT NB המכילה נוגדן anti DIG המשורשר ל-peroxidase, ולאחסן את השקיפות בתא לחות למשך שעתיים. בתום דגירה של שעתיים, יש לשטוף את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות. בכל פעם יש להוסיף 150 µL של תמיסת עבודה של T IDE המשורשרת ל-Alexa 5 9 4 לכל שקופית, ולאחסן את השקיפות בתא לחות למשך שעה אחת.

בסיום שעה אחת, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות. בכל פעם, הדגירו את החתכים במי פחמימנים (hydrogen peroxide) בריכוז 0.3% בתמיסת בופר TNT למשך 10 עד 30 דקות. זמן ההדגרה בתמיסת מי הפחמימנים תלוי בשפע ה-mRNA ויש לבחון אותו לפני ביצוע ה-D fish.

לאחר מכן, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. גרעו 150 µL של בופר TMB לכל סלייד והשאירו את הסליידים בתא לח כדי ל-30 דקות. הסירו את עודפי תמיסת ה-TMB על ידי הטיית הסליידים.

הוסף 150 µL של תמיסת TMB המכילה נוגדן anin המשורשר ל-peroxidase, ואחסן את השקופיות בתא לחות למשך שעתיים. לאחר מכן, שטוף את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות. בכל פעם, מרח 150 µL של תמיסת עבודה של mite המשורשרת ל-Alexa 488 על השקופיות והדגר את החתכים למשך שעה אחת.

לאחר מכן, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך 10 דקות בכל פעם. כעת, לאחר ששתי הגששים של ה-ribo סומנו על ידי נוגדנים, דגרו את החתכים ב-150 µL של תמיסת מארח למשך שתי דקות. לאחר מכן, שטפו את החתכים בבופר TNT שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם, הוסיפו לחתכים מדיום קיבוע התואם לפלואורסצנציה, כגון Vector Shield או Prolong Antifade, כסו בזכוכית כיסוי ובחנו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

מיקרוגרפיות תמונה מייצגות אלו הן מניסוי דגי דגים עם חתכי מוח של פנזיבר (zebra finch), ספציפית מאזור ה-NCM, המקביל בציפורי שירה לקליפת המוח השמיעתית של יונקים. חתכי המוח עברו היברידיזציה עם שתי גששים, ריבו-גשש (ribo probe) ביוטיניליagainst par albumin, סמן עבור תת-אוכלוסייה של נוירונים מעכבים, וריבו-גשש מסומן ב-DIG המופנה נגד הגן התלוי-פעילות zinc, סמן מהימן לנוירונים המונעים על ידי שירה. חפיפה של שתי התמונות מראה אוכלוסיית תאים של נוירונים מעכבים המופעלים על ידי ניסיון שמיעתי.

חצי חצים מצביעים על תאים המסומנים באופן בלעדי עם הגשושית (probe) של ה-ribo עבור par. חצים של אלבומין מצביעים על תאים המסומנים באופן בלעדי עם הגשושית של ה-RIBA עבור אבץ, המייצגים נוירונים. תאים המבטאים את שני התמלילים המבוקשים מסומנים בכוכבית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על שולחן העבודה נקי ולהשתמש בתמיסות, פלסטיקה וזכוכית נקיים מזיהומים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות בו-זמנית שני מיני MA, ברזולוציה של תא בודד בחתכי מוח שהקפאו בטריות, כדי לחקור רגולציה משותפת של גנים במוח של חולדה. תודה לצפייה בסרטון. בהצלחה בניסוייכם.