Name: תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-28T17:15:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: למדו ליצור תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות לבחינת פגיעה עצבית. שיטה זו מאפשרת שימור הארכיטקטורה ההיפוקמפלית וכימות מוות נוירונלי באזורים CA1, CA3 והדנטט.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

הממומן על ידי NINDS, איגוד הלב האמריקני, איגוד אמריקאי לחקר הזדקנות, מצעד הפרוטות

1. הכנה לפני שמתחילים, להרכיב את מכשירי ניתוח הנדרש, דיסקציה התקשורת לתרבות, עכברושית 7 יום או גורים העכבר. הפרוטוקול זהה עבור העכבר ההכנות חולדה. (I) חומרים וציוד <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים הפעלה (אורך ישר 6 ", חתול # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרו לנתח מספריים, (אורך 4 ", חתול # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פחמן פלדה דומון מלקטת (חתול # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתנה "טרנספר" זכוכית pipettes (בחלק התחתון של פסטר פיפטה להסיר והחליקה קצה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרט Aclar פלסטיק לחתוך 2 "x 2" ריבועים (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי ספוגים 4 על ידי 3 ב (קנדל, חתול # 3157, מנספילד, MA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 30 מ"מ Millicell מוסיף קרום (0.4 מיקרומטר; Millipore, בדפורד, מסצ'וסטס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mcllwain המסוק רקמות עם להב פיפיות גילוח (המסוק McILwain רקמות, החברה Vibratome, סנט לואיס, מיזורי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ הפוך עם מצלמת CCD וניתוח תוכנה תמונה </li></ul> (Ii) בינוני Dissection (DM, 1 ליטר ב-pH 7.3) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מלח מאוזן של האנק </td><td> 1 בקבוקון (95.2 g/1L) (סיגמא: H2387) </td></tr><tr><td> NHCO 3 (4.2 מ"מ) </td><td> 350 מ"ג </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 2.83 גר ' </td></tr><tr><td> גלוקוז (33.3 mM) </td><td> 6.0 גרם </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (100x) </td><td> 10 מ"ל </td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (0.3%) </td><td> 300 מ"ג </td></tr><tr><td> MgSO 4-7H 2 O </td><td> 1.44 גר ' </td></tr></tbody></table> (Iii) תרבות בינוני (400 מ"ל) <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ממ (Invitrogen 11575-032) </td><td> 200 מ"ל </td></tr><tr><td> האנק *** מאזן של מלח (Invitrogen 24020-117) </td><td> 100 מ"ל </td></tr><tr><td> סוס בסרום (Invitrogen 26050-070) </td><td> 100 מ"ל </td></tr><tr><td> HEPES חיץ (1 מ '; Invitrogen 15630-080) </td><td> 5 מ"ל </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין (100x) </td><td> 4 מ"ל </td></tr><tr><td colspan="2"> *** הוסף 12.8 גרם גלוקוז לסולט מאזן 500 מ"ל של האנק לפני ביצוע בינוני תרבות </td></tr></tbody></table> (Iv) בעלי חיים חולדה הישנה 7 יום או גורים העכבר לאחר הלידה, בדרך כלל אחד בכל המלטה הניסוי. 2. ביום התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הכלים לנתיחה הסרט Aclar חייב להיות טבול ETOH 70% במשך 30 דקות לפני תחילת. פני השטח של מכסה המנוע לנתיחה, להב, וכן המסוק רקמה יש לחטא עם אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מספר (3-4) 6 גם תרבות צלחות רקמות; להוסיף 1 מ"ל בינוני לכל תרבות היטב, להוסיף קרום חדיר Millipore היטב כל אחד. מקום 6 גם צלחות של 37 ° החממה עד מוכן להעביר את הפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מספר (4-6) 60 מ"מ צלחות עם DM ומניחים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות לערוף עם מספריים לטבול 70% ETOH, במהירות לחשוף את המוח עם חתך saggital הגולגולת. מוציאים בזהירות את המוח ואת המקום מיד DM קר. מפריד אותה לשני חצאי ומקום לכל צד האונה המדיאלי על ספוג כיסוי 2-3 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם בעדינות והנח את הכדור אל הכיכר הסרט מקום Aclar על המסוק רקמות; לחתוך את המוח coronally ב סעיפים 350 מיקרומטר. בסיום, בעדינות לקחת את הכיכר Alcar עם האונה לצלול מחולק וב DM קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, להפריד את הסעיפים בהיפוקמפוס. עבור החולדה, צריך להיות 5 חלקים פורש מקורי להיפוקמפוס הזנב, ועל העכבר צריך להיות בסעיפים 3-4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את 6 גם צלחות עם קרום מוסיף מן הרקמה 37 ° התרבות בחממה. העברת פרוסות בהיפוקמפוס בנפרד על קרום חדיר בעזרת פיפטה העברת זכוכית. אם יותר מדי DM הוא שוחרר על הממברנה, להסיר עודף DM עם פיפטה פסטר. מקום חמש פרוסות בהיפוקמפוס על כל קרום. אפשר לפחות 3 בארות לכל מצב, או 15 פרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות תרבות ב 37 מעלות ב CO החממה 5% humidified במשך 12-14 ימים לפני תחילת ניסוי רעילות. בינוני התרבות ניתן לשנות פעמיים בשבוע. </li></ol> 3. גרימת וכימות פגיעה עצבית בהיפוקמפוס בתרבות Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12-14 ימים בתרבות, להוסיף 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​יודיד propidium (PI) לתקשורת ותרבות. צעד זה יאפשר להדמיה וכימות של מוות התאים הבזליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לכמת PIהקרינה subregion CA1 (ו / או CA3 משוננת או במקרה הצורך) של כל פרוסה בהיפוקמפוס להשיג מתכוון מדידות הקרינה לצרכן המייצג המוות של התאים הבזליים (המכונה זמן = 0 שעות, או T 0). לרכישת תמונה וכימות, אנו משתמשים בתוכנות OpenLab (אימפרוביזציה, בריטניה), אך רכישת תמונה אחרת ותוכנה ניתוח יכול לשמש כדי לכמת את עוצמת הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר רכישת התמונה של T 0 PI הקרינה, לגרום לפגיעה עצבית לפי שיטת הבחירה שלך (השתמשנו 10 מיקרומטר NMDA, חמצן, גלוקוז קיפוח, או LPS במשך שעה אחת כדי לגרום לרעילות עצבית 2,5). לאחר הגירוי רעילים, להחליף בינוני עם בינוני טרי המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן ולשמור פרוסות לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3, לכמת אומר לצרכן הקרינה של תנאי הניסוי ב 24 שעות, או טי 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישה זו התמונה, מיד לשנות בינוני ומוסיפים 10 מיקרומטר NMDA ו - 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​לצרכן ופרוסות דגירה לילה להשיג מוות עצבי מקסימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4, לכמת אומר הקרינה לצרכן של מוות עצבי מקסימלי, כהגדרתו T max. חישוב התא למוות אחוז כדלקמן: (ט 24 - T 0) / (T max-T 0). </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2106/2106fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1.) A (קו זמן הדור של פגיעה ניסיוני בהיפוקמפוס ובעקבות רכישת התמונה. (ב) נציג תמונות של פרוסות בהיפוקמפוס basally (ט 0), 24 שעות לאחר חשיפה 1 שעה 10 מיקרומטר NMDA (ט 24), ואחרי 24 שעות או 10 מיקרומטר נוסף NMDA כדי להשיג פגיעה מירבית העצבית (ט מקסימום).

<ol><li>Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).</li>
<li>McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+Function+of+the+PGE2+EP2+Receptor+in+Cerebral+Ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia.</a> J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).</li>
<li>Czapiga, M., Colton, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+microglia+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Function of microglia in organotypic slice cultures.</a> J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).</li>
<li>Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+non-glutamate+receptor+mediated+toxicity+caused+by+oxygen+and+glucose+deprivation+in+organotypic+hippocampal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures.</a> J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).</li>
<li>Wu, L., Wang, Q., Liang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Effects+of+prostaglandin+recetor+signaling+on+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letter%22%5BJournal%5D)">Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival.</a> Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).</li>
<li>Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+in+vitro%3A+Analysis+of+morphology+and+adhesion+molecule+expression+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Glia. 18, 319-319 (1996).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ישנן שתי נקודות חשובות לעקוב כדי להבטיח תוצאות לשחזור ועקבית כאשר משכפלים ניסויים. ראשית, חשוב לתת את גיל פרוסות בהיפוקמפוס עבור 12-14 ימים לפני ניסויים. עם בידוד פרוסה, יש תגובה microglial משמעותית, microglia להישאר פעיל במשך זמן מה, עם חזרה למצב מנוחה ענפה מתרחשת ביום 10 במבחנה 3,6. שנית, כלומר עוצמת הקרינה לצרכן הוא יחסי למספר תאים נפצעו 4. הקרינה נמדדת רצופות בשלוש נקודות זמן: (i) ב T 0, לפני NMDA או גירוי OGD כדי למדוד את רמות הבסיס ה...

תרבות organotypic בהיפוקמפוס slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

פרוסה Organotypic תרבות בהיפוקמפוס היא שיטה חוץ גופית כדי לבחון את המנגנונים של פגיעה עצבית שבו הארכיטקטורה הבסיסית והרכב של ההיפוקמפוס נשמר יחסית 1. מערכת תרבות organotypic מאפשר בדיקה של השפעות עצביות, astrocytic ו microglial, אבל כהכנה vivo לשעבר, אינו מתייחס להשפעות של זרימת הדם, או גיוס של תאים דלקתיים היקפי. לשם כך, שיטה זו התרבות משמש לעתים קרובות כדי לבחון פגיעה excitotoxic ו hypoxic לנוירונים פירמידה של ההיפוקמפוס, אך שימש גם כדי לבחון את התגובה הדלקתית. בזאת אנו מתארים את שיטות להפקת תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס מהמוח מכרסם לאחר הלידה, מתן גירויים רעילים כדי לגרום פגיעה עצבית, ו assaying וכימות מוות נוירונים בהיפוקמפוס.

תרבות organoptypic בהיפוקמפוס מודל פרוסה היא<em&gt; במבחנה</emמודל&gt; בעבר לבחון פגיעה עצבית במגוון של פרדיגמות. במאמר זה, אנו מתארים את שיטות להפקת תרבויות פרוסה וכימות הפגיעה העצבית.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

תרבית פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות היא שיטה במבחנה (in vitro) לבחינת מנגנונים של פגיעה נוירונלית, שבה הארכיטקטורה וההרכב הבסיסיים של...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות שניתן להשתמש בהן כדי למדל פגיעה נוירונלית בתגובה למגוון גירויים, כולל NMDA, אקסיטוטוקסיות, מחסור בחמצן או גלוקוז, או גירויים דלקתיים כגון ליפופוליסכריד או פפטיד amyloid beta. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד המוח לאחר הלידה וחיתוך של כל המיספרה ליצירת פרוסות קורונליות. השלב השני של הפרוצדורה הוא בידוד אזורי ההיפוקמפוס ותרביות שלהם על רכיבי ממברנה (membrane inserts) בלוחות של שש בארות. לאחר גידול הפרוסות, הן נצבעות ב-propidium iodide ורמת המוות הנוירונלי הספונטני מחושבת.לבסוף, הפרוסות מטופלות בחומר נוירוטוקסי ונצבעות מחדש כדי למדוד את תגובת הרעילות לטיפול. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את אחוז מות הנוירונים באזורי CA1, CA3 וה-dentate של ההיפוקמפוס בתנאים ניסיוניים שונים, באמצעות כימות של פלואורסצנציית propidium iodide תחת מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית נוירונים ראשונית, הוא שבחינת מנגנון הפגיעה הנוירונלית מתבצעת במידור שבו הארכיטקטורה הבסיסית של ההיפוקמפוס נשמרת באופן יחסי.והסוג השלישי כולל פעילות גופנית. מיקרוגליה ו-ROY נשמרים לפני תחילת הניתוח. הכנסו ממברנה חדירה של millipore לכל אחד.הוסיפו 1 mL של מצע תרבית לכל באער של מספר פלטות תרבית רק

the-organotypic-hippocampal-slice-culture-model-for-examining

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

סרטון זה מדגים שיטה להכנת תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות ממוחו של גור חולדות. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בנתיחת ההיפוקמפוס, החיתוך ותנאי התרבית הדרושים לקידום קיום התאים וצמיחתם בפרוסות ההיפוקמפוס, ובסופו של דבר ליצירת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות.

הכנת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות מההיפוקמפוס של גור חולדות

Coculture פרוסת מוח organotypic עם קרצינומה של תאים מאפשר לדמיין שינויים מורפולוגיים על ידי הקרינה וכן בתחום בהיר מיקרוסקופיה (וידאו) במהלך התהליך של פלישת תא קרצינומה של רקמת המוח. מערכת מודל זה מאפשרת גם להחלפת תאים וחידוש גישות ומציעה מגוון רחב של מניפולציות וניתוחים.

מערכת Coculture עם מוח פרוס Organotypic ו3D אליפטית של קרצינומה של תאים

פיתחנו מודל פרוסת מוח שבו ניתן להשתמש כדי לבחון מנגנונים מולקולריים מעורבים בפגיעה במוח בתיווך הפעלת יתר רעילה. טכניקה זו יוצרת רקמת מוח בוגרת קיימא ומפחיתה את המספרים של בעלי חיים הנדרשים לניסויים, תוך שמירה על המעגלים עצביים, אינטראקציות הסלולר, ותאי postsynaptic שלמים בחלקו.

הפעלת יתר רעיל גירוי של המוח כMicroslices<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של שבץ

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

פרוטוקול להכין תרביות פרוסות חופשיות מן המוח האנושי המבוגר מוצג. הפרוטוקול הוא וריאציה של שיטת תרבות הפרוסה הנפוצה בשימוש באמצעות מוסיף ממברנה. זה פשוט, חסכוני, ומומלץ להפעלת בחני לטווח קצר שמטרתו לפענח מנגנונים של נוירוניוון מאחורי הגיל הקשורים מחלות המוח.

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים ויכולים להיחשב מודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו מייצגת כלי מצוין לניטור הדינמיקה של פעילות ספונטנית, כמו גם להערכת ההתקדמות של תכונות נוירואינפלמטוריות לאורך כל מהלך אפילפטוגנזה.

מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

למדו ליצור תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות לבחינת פגיעה עצבית. שיטה זו מאפשרת שימור הארכיטקטורה ההיפוקמפלית וכימות מוות נוירונלי באזורים CA1, CA3 והדנטט.

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

גלה סרטונים נוספים