ייצור של חומרים בזריקות נגזר ביולוגית של הנדסת רקמות שריר הלב

ג'לי מטריצה המופקים מרקמת פריקרד ומיוקרד שעברה דצולריזציה שומרים על רכיבי מטריצה חוץ-תאית טבעיים, כולל חלבונים, פפטידים וגליקוזאמינוגליקנים מגוונים. מטריצות רקמתיות אלו יכולות לשמש להנדסת רקמות. בסרטון זה, ג'לי מטריצה מיוצרים על ידי דצולריזציה של רקמת פריקרד כדי להפיק מטריצה חוץ-תאית שאינה תאית.

לאחר מכן, המטריצה החוץ-תאית מעובדת כדי ליצור גרסה נוזלית מומסת. לאחר מכן, המטריצה המומסת נבדקת במודל של בעל חיים קטן כדי לקבוע את היתכנותה כפיגום להזרקה. ניתוח היסטולוגי ואימונוהיסטוכימי מדגימים כי במצב של in vivo, החומר המוזרק יוצר פיגום סיבי נקבובי המאפשר חדירה של תאי כלי דם.

שלום, שמי סוניה זקי. אני סטודנטית לתואר מתקדם במעבדתה של ד"ר קרן כריסמן באוניברסיטת קליפורניה סן דייגו. היום נכין ECM מומס מרקמה שעברה דסלולריזציה ונבצע הדגמה של בדיקות in vivo ליישומים של הנדסת רקמות לבביות.

טכניקות אלו חשובות לפיתוח טיפול באמצעות ביו-חומר להזרקה עבור טיפול באי-ספיקת לב. את ההליך הכירורגי לאחר אוטם שריר הלב תדגים פאם שוט מקפין, נוירוכירורגית וטרינרית במעבדה שלנו. אז בואו נתחיל.

התחל את הפרוטוקול על ידי דצולריזציה של הרקמה כדי להותיר רק את המטריצה החוץ-תאית (ECM). ראשית, הנח פריקארד פוריני (porcine pericardium) בכלי כימי עם מים דה-יוניים ושטוף אותו באמצעות ערבוב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה, הנח את הרקמה ב-1× PBS המכיל 1% SDS ו-1% penicillin streptomycin, וערבב ברציפות למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר. למחרת, החזר את הרקמה למים דה-יוניים וערבב ברציפות למשך חמש שעות, תוך ניעור בתוך מבחנה של 50 milliliter עד להיעלמות כל הקצף.

צביעת המטין ואאוזין צריכה להראות את היעדרו של הגרעין ברקמה שעברה דה-צלולריזציה. העבירו את שאר הרקמה שעברה דה-צלולריזציה למבחנה קונית של 15 עד 50 milliliter. לאחר מכן, הניחו את הרקמה במקפיא של 80- degrees Celsius.

בצעו ליופיליזציה לדגימות הקפואות באמצעות ייבוש בהקפאה תחת לחץ נמוך מאוד וטמפרטורה נמוכה מאוד עד לייבוש מלא. בהתאם למערכת שבה נעשה שימוש ולתכולת המים של הדגימות, תהליך זה עשוי להימשך בין 12 ל-72 שעות. לאחר שהרקמה שעברה דסלולריזציה יבשה לחלוטין, העבירו אותה למטחנת Wiley Minim.

השתמשו ברשת של 40 gauge וטחנו את הרקמה לאבקה דקה. לאחר שמרבית הדגימה עברה דרך המסנן, הסירו את צנצנת האיסוף. דגימה זו תיקרא כעת אבקת מטריצה חוץ-תאית או אבקת ECM.

ניתן לבצע שלב ליופיליזציה שני בנקודה זו, אם לא ממשיכים מיד לשלב הבא. פעולה זו מבטיחה את דיוק המשקל שנרשם לצורך המסה של ה-ECM. שקלו את הכמות הרצויה של אבקת ה-ECM לתוך מבחנה סטרילית.

הוסף למבחנת הסינצילציה המכילה את אבקת ה-ECM תמיסת מימן כלורי מסוננת וסטרילית בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר של Pepcid, כך שריכוז ה-ECM יהיה 10 מיליגרם למיליליטר. הוסף מגנט ערבוב והנח את המבחנה על לוח הערבוב.

ערבבו ברציפות למשך 48 עד 60 שעות, תוך גירוד תקופתי של דפנות המבחנה באמצעות כף או שפכטל סטריליים של WHE. זאת כדי להבטיח עיכול מלא של אבקת ה-ECM. ככל שה-ECM יעכול, הוא יעבור למצב של תמיסה.

לאחר שה-ECM הומס, יש להניח את הדגימה על קרח ולהתאים את ה-pH ל-7.4 באמצעות נתרן הידרוקסיד וחומצה כלורית. לאחר התאמת ה-pH, יש להוסיף 10 times PBS כך שריכוז ה-PBS הסופי של התמיסה יהיה one times PBS. לדוגמה, אם יש בידיכם 900 microliters של תמיסת ECM, לאחר התאמת ה-pH, יש להוסיף 100 microliters של 10 times PBS.

קבעו את ריכוז תמיסת ה-ECM המומסת על ידי סיכום הנפחים שהתוספו לצורך ניטרול והנפחים שהוצאו לבדיקת ה-pH. לאחר מכן, הוסיפו PBS עד להגעה לריכוז הסופי הרצוי במקרה זה: Six milligrams per milliliter.

ביום הניתוח, הכין הזרקה של 75 µL של ECM מומס במזרק של 0.1 mL המצויד במחט בכיול 30 gauge. שמור על הרדמה של חולדה נקבה מסוג Harlan dolly מונשמת באמצעות 2.5% isoflurane. לאחר מכן, ודא את רמת ההרדמה על ידי ביצוע צביטה בבהוות.

הזריקו שלושה מיליליטר של תמיסת lactated ringer בהזרקה תת-עורית בבטן התחתונה לצורך הידרציה. לאחר מכן, הניחו את בעל החיים בתנוחת שכיבה על הגב (supine) על שולחן הניתוח והדביקו בעדינות את הגפיים בעזרת סרט הדבקה. השתמשו במכונת תספורת להסרת הפרווה מהבטן ושאבו את השיער שהסיר.

בצעו סדרה של הזרקות בנפח 50 µL של לידוקאין 2% לאורך אלכסון מהתהליך החרב (xiphoid process) לצד הימני התחתון של הבטן. לאחר מכן, קרצפו שלוש פעמים עם Betadine, החל מהמרכז ובתנועה כלפי חוץ. חזרו על פעולת הקרצוף עם אלכוהול איזופרופיל.

לאחר מכן, כסו את בעל החיים באמצעות סדין כירורגי עם חלון עגול מוכן מראש. הדקו אותו בעזרת סדין כירורגי. השתמשו בסכין מנתחים מספר 10.

בצעו חתך של שלושה עד ארבעה סנטימטרים מהתהליך החרבני (xiphoid process) אל הצד הימני התחתון של הבטן. אתרו את התהליך החרבני ובצעו דיסקציה אנכית כלפי מטה דרך השריר לכיוון ימין, תוך זהירות להימנע מפגיעה בכלי הדם הגדול שבצד ימין. לאחר מכן, השתמשו במספריים כדי לחתוך לטראלית דרך השריר כדי לחשוף את הסרעפת.

היזהרו להימנע מפגיעה בכבד באמצעות חוט תפירה Vicryl בדרגת עובי 3-0 ובאורך של 36 אינץ' וזוג פליירים להמוסטזה (hemostats). העבירו מחט אחת דרך התהליכים של עצם החזה (xiphoid process) ומשכו את חוט התפירה עד למחציתו. הדביקו את קצות החוט זה לזה וקבעו אותם לנקודה שמעל ומאחורי בעל החיים, תוך הרמת התהליכים של עצם החזה וחשיפת הסרעפת בעזרת חוט תפירה Vicryl נוסף בדרגת עובי 3-0 ובאורך של 36 אינץ'.

העבירו מחט דרך השריר הקרוב ביותר לתהליכ החרב (xiphoid process) ושוב, משכו אותה החוצה וקבעו את קצהה לנקודה אחרת מימין לשולחן הניתוח, כדי לחשוף באופן מלא את חלל הניתוח. לאחר מכן, בעזרת פינצטת מיקרו מסוג "שן חולדה" (rat tooth) קטנה, תפסו את מרכז הסרעפת, משכו אותה החוצה ובצעו חתך קטן מאוד בעזרת מספריים קהים. ברגע שחור זה ייווצר, הריאות יסוגו פנימה.

בצעו חתך אנכי של שני עד שלושה סנטימטרים דרך הסרעפת כדי לחשוף את הלב. לאחר מכן, הכניסו מקל ניקוי (swab) באורך של שלושה אינץ' לשמאלה של החלל ודחפו את הריאות הצידה. קבעו את מקל הניקוי במקומו באמצעות תפס מגבת.

בעזרת מקלון נוסף, הסיטו את הריאה הימנית כדי לאתר את שקיק הפריקרד. לאחר מכן, באמצעות פינצטה מיקרוסקופית ופינצטה משוננת גדולה, קרעו את שקיק הפריקרד כדי לחשוף את חוד הלב. אחזו בחוד הלב באמצעות הפינצטה המיקרוסקופית המשוננת הימנית והחדירו את המחט להזרקת המטריקס המומס, כאשר הצד המשופע פונה שמאלה.

במרחק של שליש מהשיא במקביל לפניט האפיקרדיאלי. יש להקפיד להימנע מהוריד הליבבי הגדול. מזריקים את ג'ל המטריקס המומס וממתינים מספר שניות לפני הוצאת המחט.

הרקמה צריכה להלבין באתר ההזרקה; יש לנגב את הדם מהחלל, ולהסיר את תפסן המגבת ואת התמצד המחזיק את הריאה הימנית באמצעות המוסטטים מיקרו-מעוקלים, ולקשור קשר ראשוני באמצעות חוט תפירה מסוג proline במידה 5-0 ובאורך 30 inch. לאחר מכן, השתמש בפינצטה מיקרו בעלת שיניים לסגירת הסרעפת בתפר רציף ובמחט קהה (tapered) לפני הסגירה המלאה. הכנס צינור שאיבה מסוג PE one 60 וסגור סביבו תוך שימוש במזרק של 10 milliliter כדי לרוקן את חלל החזה.

בעת הידוק התפר, הסרעפת צריכה להיות קעורה. הנמך את ריכוז הפלואורין ל-1%. הוצא את שני תפרי ה-Vicryl 3-0 המחזיקים את החלל פתוח. הרטב את השריר ונגב את העודפים באמצעות מקלון או גזה סטרילית.

השתמשו בחוט תפר חדש במידה 3-0 כדי לסגור את שכבת השריר באמצעות תפריים מקטעים. לאחר מכן, כבו את ה-isof fluorine. נקו את האזור והשתמשו בסיכות לסגירת העור.

לאחר מכן, מרחו משחה אנטיביוטית משולשת על אתר החתך. אפשרו לחולדה להתאושש תחת 100% oxygen. כאשר בעל החיים מתחיל לנשום באופן עצמאי מסביב למנשם, הוציאו את צינור הקנה.

ברגע שהחיה חוזרת לעמוד על רגליה, יש להעניק זריקה תת-עורית של 0.05 milligrams per kilogram של האנלגזיק buprenorphine hydrochloride, ולהחזירה לכלוב הביתי על מגבת סטרילית. רקמת לב של חולדות שהוזרקו להן ג'לים של מטריצה מסיסה נחתכה ונצבעה ב-hemat, toin, and eoin לצורך אנליזה רקמתית גסה בנקודות זמן שונות. בעקבות הניתוח בנקודות זמן מוקדמות, האזור המוזרק נראה כרשת סיבית ורודה שהתפשטה באופן אינטרסטיציאלי בנקודות זמן מאוחרות יותר.

חדירת תאים נצפית לאחר שבועיים. נראה פירוק של המטריקס המוזרק. אם ה-ECM סומן בביוטין לפני ההזרקה, ניתן להדמיאו באופן ישיר יותר על ידי צביעת הביוטין עם streptavidin המשולב עם HRP, כדי להדמיא צמיחה והיווצרות של כלי דם באזור הזרקת המטריקס.

השקופיות המוצגות כאן נצבעו בצביעה כפולה עם fitzy. הסלקטין הצמוד, הנקשר לתאי אנדותל, מוצג בירוק, ונוגדן antis smooth muscle actin מוצג באדום. ניתן לזהות תאי גזע גם בסמיכות לאזור ההזרקה.

כאן הם הוויזואליזציה באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית ל-C kit. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים ECM מומס מרקמה שעברה דצולריזציה ובדיקתו in vivo עבור יישומים של הנדסת רקמות לב. זכרו כי למרות שנעשה שימוש ברקמת פריקארד, ניתן להתאים את הפרוצדורה הכללית הזו לשימוש עם כל מקור רקמה.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.