תא גלייה לימוד הטרוגניות השפעה על הצמיחה אקסון בשיטה Coculture חדש
6 בספטמבר 2010
בפרוטוקול זה, אנו תיאר שיטה חדשה ללמוד את השפעת ההטרוגניות תא גליה על צמיחת האקסון עם במבחנה שיתוף התרבות המערכת. קליפת המוח עכברוש ותאי גלייה היו בתרבית כדי מפגש ו cocultured עם מטוהרים מאוד הגבי עכברוש שורש עצב הגרעינים. תאים שונים להשפיע על גליה הידבקות נוירונים וצמיחה האקסון הושווה ישירות באותה תרבות. שיטה זו מספקת דרך חדשה ישירות ללמוד תא גלייה ההטרוגניות השפעה על הידבקות נוירון וצמיחה האקסון.
המטרה הכללית של הליך זה היא ללמוד את השפעת ההטרוגניות הגליאלית על צמיחת אקסונים של DRG ועל מוות תאי. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד התאים הגליאליים מקורטקס של חולדה רבנית רך-עלה (neonatal).
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת נוירוני ה-DRG המזוהים על גבי תאי הגליו. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא תצפית על צמיחת האקסונים בתאי הניורונים וביצוע צביעת תאים ואנליזת כימות. לבסוף, ניתן להפיק את התוצאות.
סרטון זה מראה כי צמיחת נוירונים של DRG מושפעת מתאי גליה הטרוגניים, באמצעות הקלטת time-lapse ומיקרוסקופיה של אימונופלואורסצנציה. שלום, אני מהמעבדה לדימיון עצבי (neuro Imagine) במחלקה לנוירולוגיה ב-UCRA. היום נראה לכם פרוצדורה לבחינת ההשפעה ההטרוגנית של תאי G על צמיחה בשיטה חדשה לתרבית תאי עצב.
במעבדה שלנו, אנו משתמשים בשיטה חדשה זו כדי לחקור את האינטראקציה בין נוירונים לתאי ggl. לכן, נבצע את המחקר. כדי להקים תרבית משותפת (co-culture) של תאי גליה ונוירונים של גנגליון השורש האחורי (DRGs), נתחיל בגידול תאי גליה תחת מכסה עקר (tissue culture hood). נניח בתחתית של פלטות תרבית סטריליות בעלות 24 בארות כיסויי זכוכית עגולים וסטריליים, נצפה את כיסויי הזכוכית בבארות של פלטת תרבית בעלת 6 בארות ב-polylysine ונדגיר למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
שטפו את כיסויי הזריקה (cover slips) ואת פלטות התרבית פעמיים במים מזוקקים והניחו להם להתייבש באוויר. לאחר מכן, טפטפו 200 µL או 2 mL של מצע DMEM modified Eagle או DMEM עם 10% fetal bovine serum או FBS לתוך כל באער בפלטה בעלת 24 באערים או 6 באערים, בהתאמה. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 5% carbon dioxide למשך היום הבא.
סטריליזציה של מנדף הדיסקציה עם זרימה חיובית. הדלק את נורת ה-UV למשך 20 דקות ולאחר מכן רסס את כל המשטחים תחת המנדף ב-70% ethanol והמתן 15 דקות לפני השימוש. התחל עם ראשיהם של שני גורי חולדה בגילאי P two עד P six שהורדמו באמצעות היפותרמיה.
לאחר מכן בצעו עקיפת ראש בבסיס ה-foramen magnum באמצעות מספרי ניתוח. פתחו את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי (sagittal suture) בעזרת מספרי איריס וקלפו את הגולגולת. הוציאו את המוח הקדמי והניחו אותו בתוך תמיסת levo wit's L 15 מקוררת, וחזרו על הפעולה עם הראש השני.
לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר בזהירות את הקרומים העמיקים (dura), קרומי הפיא (pia) ואת כלי הדם המכסים את המוח. בודד את הקורטקס ושטוף אותו מספר פעמים עם מצע L 15.
השתמש במספרי מיקרו-כירורגיה כדי לחתוך את הקורטקס לחתיכות קטנות. לאחר מכן, דגרי בתווך L 15 המכיל 0.125% trips ב-EDTA בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבר את גושי הרקמה לשפופרת של 50 ml המכילה 20 ml של DMEM עם 20% FBS.
הוסיפו DS עד לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה פסטורית שעברה חישול באש כדי לערבב את תמיסת הרקמה כ-20 פעמים להפרדת התאים. לבסוף, שטפו את התאים פעם אחת עם DMEM המכיל 10%FBS וקבעו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר.
לאחר מכן, זרעו את התאים בצפיפות של 5,000 עד 10,000 תאים לסנטימטר רבוע והדגירו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. החליפו את המצע פעמיים בשבוע כדי לבודד, לטהר ולתרבת DRGs. ראשית, הכינו פלטות של 24 בארות עם כיסויי זכוכית מצופים ב-polylysine כפי שהודגם קודם לכן.
הוסיפו 100 µL של מצע NVF לכל לבישה (cover slip) והדגירו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C עד למחרת. סטריליזציה של מנדף הזרימה הלמינרית תבוצע כפי שנעשה בעבר. לאחר מכן, התחילו עם עוברי חולדה בשלבי E 12 עד E 15, אשר בודדו מהרחם של חולדה בהריון שהורדמה באמצעות פחמן דו-חמצני תחת מיקרוסקופ סטריאו.
בודדו את השרירים בעמוד השדרה יחד עם גנגליוני השורש הגבי (dorsal root ganglia) המחוברים אליהם, והעבירו אותם לצלוחיות של 35 מילימטר המכילות מצע L 15 מקורר. באמצעות פינצטות למיקרו-כירורגיה, הפרדו בזהירות את ה-DRGs המחוברים מהשרירים בעמוד השדרה בתוך מצע L 15 מקורר, תוך הקפדה על אי-פגיעה ב-DRGs, וחתכו את האקסונים המחוברים.
בדרך כלל מבודדים בין 20 ל-30 DRGs משריר שדרה אחד כאשר כל ה-DRGs כבר בודדו מהשרירים. את כל ה-DRGs המבודדים מניחים ב-0.125% tripsin ב-EDTA ומדגירים למשך 20 דקות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide. שוטפים את התאים פעם אחת ב-DMEM עם 20% FBS, לאחר מכן מוסיפים DNAs ומעבירים בפיפט מספר פעמים באמצעות פיפט פסטו מלוטש באש ליצירת סספנסיה תאית אחידה, כפי שהודגם עם התאים הגליאליים. מבצעים שטיפה שנייה במצע MBF, סופרים את התאי וזורעים אותם על כיסויי הזכוכית המוכנים בפלטות של 24 בארות בריכוז של 5,000 תאים לבארה. מדגירים למשך לילה כדי לטהר את נוירוני ה-DRG.
18 עד 24 שעות לאחר הזריעה. החליפו את המצע במצע Neurobasal המכיל 20 µM 5-fluoro-2'-deoxyuridine. לאחר 72 שעות, החליפו מחצית מהמצע במצע Neurobasal ללא FUDR.
לאחר מכן, מחליפים את המצע מדי יומיים. כ-20 ימים לאחר זריעת תאי הגליא, הם יגיעו להסנכרון (confluence) ויהיו מוכנים לתרבית משותפת עם נוירונים 24 שעות לפני שילוב שני סוגי התאים.
החליפו את מצע תרבית תאי הגליה במצע MBF. הכינו תרחיף של תאים בודדים של DRGs מנוקים כפי שהודגם בעבר. קבעו את צפיפות התאים.
לאחר מכן, זרעו את הנוירונים על גבי התאי הגליאליים בצפיפות של 500 תאים לסנטימטר רבוע. ניתן לנתח את הישרדות הנוירונים ואת צמיחת הנויריטים על גבי התאי הגליאליים בנקודות זמן שונות באמצעות תוכנה לניתוח תמונות ואימונוכימיה עם נוגדנים ספציפיים לסוג התא. להלן דוגמאות לתאי גליאה ונוירונים של DRG שגודלו בנפרד וכקו-קלטורה; התאי הגליאליים הופכים למשכיחים (confluent) לאחר 20 ימים.
בתרבית. תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (phase contrast), היה ניכר כי תת-אוכלוסיות שונות של תאי גליא יוצרות דפוסי צמיחה ומורפולוגיות מובחנים. ובדיקת אימונו-ציטוכימיה העלתה כי אסטרוציטים חיוביים ל-GFAP מהווים יותר מ-90% מהתרבית.
בשימוש בשיטת הטיפול שלנו ב-FUDR למשך 72 שעות, רמת הניקיון של נוירוני DRG תגיע עד ל-99% תוך שישה ימים, והם יציגו את המורפולוגיה הייחודית שלהם עם צפיפות גבוהה של צמיחת נוריטים בתרבית משולבת של נוירונים ותאי גליה. צמיחת גופי תאי נוירוני DRG ונוריטים התרחשה בקלות על גבי תאי גליה בתוך ארבע שעות לאחר הזריעה; צמיחת גופי התאים והנוריטים הושפעה מתתי-אוכלוסיות של תאי גליה, היוצרות תת-מבני תבנית צמיחה מיוחדת שניתן לזהות בקלות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. ובאמצעות אימונו-ציטוכימיה, אראה לכם כיצד לגדל בתרבית משולבת נוירוני DRG עם תאי גליה כדי לחקור את השפעת ההטרוגניות של תאי הגליה על הצמיחה העצבית.
בעת ביצוע סשן זה, חשוב מאוד לזכור לטפל ברקמה בעדינות רבה ולשמור על התאים בתוך המדיום. לעולם אל תחשוף אותם לאוויר ותמנע מהם להתייבש. זהו כל הפרוטוקול.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבחינת השפעת ההטרוגניות של תאי גליה על צמיחת אקסונים באמצעות מערכת של תרבית משותפת (co-culture) in vitro. תאי גליה מקליפת המוח של חולדה גודלים בתרבית משותפת עם נוירונים מנוקייים של גנגליון השורש האחורי של חולדה, וזאת כדי להשוות את השפעתם על היצמדות נוירונים ועל צמיחת אקסונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- נוירוביולוגיה
רקע
- תאי גליה ממלאים תפקיד מכריע במערכת העצבים.
- הטרוגניות בין תאי גליה עשויה להשפיע על התנהגות נוירונלית.
- הבנת אינטראקציות אלו חיונית למחקר נוירוביולוגי.
- מודלים in vitro מספקים סביבה מבוקרת לחקר השפעות אלו.
מטרת המחקר
- לבחון כיצד סוגים שונים של תאי גליה משפיעים על צמיחת אקסונים.
- להעריך את השפעת ההטרוגניות של תאי גליה על היצמדות נוירונים.
- לפתח מערכת תרבית משותפת (co-culture) אמינה למחקרים עתידיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד תאי גליאה מקליפת המוח של חולדה רבנית רך-גולה.
- תרבית וטיהור של נוירונים מקשרי שורש אחוריים (DRG) של עובר חולדה רבנית.
- תרבית משותפת (Co-culture) של נוירוני DRG מטוהרים עם תאי גליאה.
- תצפית על צמיחת אקסונים והיצמדות תאים באמצעות צביעה וכימות.
תוצאות עיקריות
- נצפו הבדלים בצמיחת האקסונים בהתאם לסוג התא הגליאלי.
- תאים גליאליים השפיעו באופן משמעותי על היצמדות הנוירונים.
- מערכת השיתוף-תרבית הוכחה כיעילה לחקר אינטראקציות גליאליות-נוירונליות.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי תפקידה של ההטרוגניות הגליאלית בהתפתחות הנוירונלית.
מסקנות
- שיטה זו מאפשרת מחקר ישיר של השפעות תאי גלייה על נוירונים.
- הממצאים משפרים את ההבנה של האינטראקציות בין תאי גלייה לנוירונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מודל זה כדי לבחון יישומים טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת ההטרוגניות של תאי הגליה היא קריטית להפחתת סיכונים באימות מטרות לטיפול נוירולוגי, שכן תת-אוכלוסיות של אסטרוציטים משפיעות באופן שונה על צמיחת אקסונים ועל התנהגות נוירונלית. שיטת תרבית השיתוף (co-culture) הזו מאפשרת סריקה מכניסטית של אינטראקציות גליאליות-נוירונליות, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי זיהוי מיקרו-סביבות מאפשרות או מעכבות. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך הערכת האופן שבו שונות גליאלית משפיעה על פוטנציאל רגנרטיבי, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו בתוכניות לתיקון ה-CNS ולניוון עצבי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השוואת צמיחת אקסונים על תתי-אוכלוסיות שונות של אסטרוציטים תחת תנאים זהים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת מטוהרת וניתנת לשחזור לבידוד השפעות ספציפיות של גלייה על היצמדות נוירונים וצמיחת נוריטים.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות על ידי חשיפת האופן שבו הטרוגניות גליאלית מווסתת תגובות נוירונליות, ובכך מגבירה את הביטחון המכניסטי בבחירת מסלול הפעולה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מייצר שכבות מונו-גליאליות סטנדרטיות עם >90% אסטרוציטים GFAP+, המאפשרות זריעה עקבית של נוירונים וניתוח צמיחת אקסונים בשיטת time-lapse.
- פלט כמותי: מקל על צביעה אימונוכימית וכימות מבוסס תמונה של אורך ופיצול נוריטים, ובכך תומך בבדיקות תגובה למינון או בסריקה השוואתית.
- יכולת הרחבה: תואם לפורמט של פלטת 24 בארות, המאפשר בדיקה מקבילה של תנאי גליאה לצורך אופטימיזציה של הבדיקה וסריקת ריאגנטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה את ההטרוגניות הגליאלית של ה-CNS הנצפית בפגיעות ובמחלה, שבה שונות של אסטרוציטים משפיעה על כישלון רגנרטיבי.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה של אינטראקציה גליאלית-נוירונלית רלוונטית לבני אדם לבדיקת תרכובות מובילות.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר זיהוי מוקדם של השפעות עיכוב המתווכות על ידי גלייה, ובכך מפחית את שיעור הנשירה בשלבים מאוחרים בתוכניות לנוירו-רגנרציה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי תרכובות מובילות, כאשר נתונים על אינטראקציה גליאלית-נוירונלית מספקים מידע על השפעות התרכובות על צמיחת אקסונים במערכת הרלוונטית למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ויסות של צמיחת אקסונים המתווך על ידי גליות, ומבהיר תגובות נוירונליות ספציפיות למסלולים.
- סריקה: מספק קריאות כמותיות וסטנדרטיות של צמיחת נוריטים, המאפשרות השוואה בין תנאים גליאליים שונים או בין מועמדים טיפוליים.
- אנליטיקה: מייצר מדדי צמיחה והצמדה מדידים של אקסונים באמצעות אימונופלואורסצנציה ודימוי time-lapse, התומכים בהשוואה סטטיסטית של קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: מדמה שונות גליאלית הרלוונטית לפתולוגיה של מערכת העצבים המרכזית (CNS) בבני אדם, ומאפשר הערכה פרה-קלינית של מטרות בסביבה מיקרובית הטרוגנית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת תרבית משותפת (co-culture) הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להחלה על מטרות רבות של ה-CNS, סוגי גליות ומקורות נוירונליים שונים עבור תוכניות גילוי מתמשכות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי קישור תתי-אוכלוסיות של גליות לתוצאות שונות של צמיחת אקסונים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות טיהור גליאלי סטנדרטי, זריעה נוירונלית ולוחות זמנים מוגדרים לתרבית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי זיהוי תנאים גליאליים התומכים ברגנרציה או מעכבים אותה, ובכך מייעל את בחירת המטרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון על בסיס התאמה לסביבה הגליאלית המיקרוסקופית, ובכך משפר את יעילות ההון בפורטפוליו של ה-CNS.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאי עצב ותאי גליה ראשוניים, תרבית רקמה סטרילית ומיקרוסקופיה של אימונופלורסנציה.
- תלוי בלוחיות כיסוי מצופות polylysine, מצע neurobasal, FUDR ומערכות דימוי בניגודיות פאזה/פלורסנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה של הכנת התאים הגליאליים, טיהור הנוירונים ותזמון השיתוף-תרבית (co-culture) כדי להבטיח הדירות בין צוותים שונים.
- התאמה לתאי גליה או נוירונים המופקים מ-iPSC אנושיים עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרוטוקולי ההבשלה והטוהר.
- מוגבל עקב שונות ברקמות ראשוניות של מכרסמים והיעדר תתי-אוכלוסיות של מיקרוגליה או אוליגודנדרוציטים בהכנות גליאליות קורטיקליות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
1:34
Establishing a Glial Cell Culture
4:29
Isolation, Purification, and Cuturing of Dorsal Root Ganglion Neurons (DRGs) and Coculturing of DRGs with Glial Cells
7:29
Representative Cultures of Glial Cells, DRG Neurons, and Cocultures of Both Cell Types
8:36
Conclusion
1:03
Introduction
