Name: אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: למדו שיטת מתן רוטנון דרך הזנה ישירה לקיבה וניתוח צביעת אימונוהיסטוכימיה לאיתור צבירי אלפא-סינוקלאין במערכת העצבים המעיים. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות חומרי הדברה על מחלת פרקינסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברי פדרו דה לה מסה קרן נתמך העבודה הזאת.

1) מינהל Intragastric של Rotenone <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את הנפח הכולל של פתרון rotenone / רכב הצורך. במקרה זה 0.01 מ"ל לגרם משקל בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת מזרק 1 מ"ל עם נפח של פתרון מחושב בעבר rotenone (0.625 מ"ג / מ"ל ​​rotenone, carboxymethylcellulose 4% ו 1.25% כלורופורם) או פתרון הרכב (carboxymethylcellulose 4% ו 1.25% כלורופורם). במקרה זה מתאים במינון מ"ג / ק"ג 5 rotenone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את העכבר, מחזיק בזנבו של עכבר ביד אחת, למתוח את העור של הצוואר ע"י משיכת אותו עם שתי האצבעות הראשונות מצד שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ראש קבוע בין שתי אצבעות, משעינה אותם על כף היד ולהפוך אותו הפוך. תקן את הזנב באמצעות האצבעות הרביעית והחמישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על הראש לכיוון הגב, לחץ על החיך לפתוח את הפה של העכבר. בעדינות להכניס את gavage בפה. חשוב להשתמש במחט gavage ולא מחט רגילה. לאט לאט להזיז את gavage לכיוון הבטן רחוק מספיק. זה ימנע מקבל חומר הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניהול הפתרון rotenone או הרכב בעדינות על ידי לחיצה על תסחיף. כאשר יושלם, לאט לחלץ את gavage. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את גב חיה בכלוב אחר עד שכל החיות מכלוב אחד נעשים. </li></ol> 2) Immunostaining נהלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הטיפול, עכברים מורדמים באמצעות Ketamin 100 מ"ג / ק"ג und Xylazin 10 מ"ג / ק"ג ו - ip perfused intracardially עם Paraformaldehyde 4% ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אומץ המחולצים מכן על ידי לנתיחה, והושמו סוכרוז 15% בין לילה. למחרת, הרקמה מועברת סוכרוז 30% ו מודגרות שוב לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה ממוקם אז רקמות-Tek ומאוחסנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cryostat, 20 מיקרון המעי חתכים מועברים שקופיות Superfrost. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת immunostaining ההליכים באמצעות נוגדנים נגד βIII-טובולין ואנטי אלפא synuclein מבוצעות אז 9 שתואר לעיל. </li></ol> 3) תמונה Alpha-synuclein הכללה ניתוח מומלץ כי אדם חיצוני מודעים מוצא "תמונות מבצעת את הניתוח. לפיכך, הנתונים צריכה להיות מוסדרת. ניתוח התמונה בוצעה באמצעות תוכנה פיג'י. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה confocal. ואז, לפצל את הערוצים כך אפשר לעבוד על כל ערוץ בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הערוצים שלא הולך להיות שימוש ובחר נתח&gt; הגדרת קנה המידה לקביעת גודל פיקסל 1. הגדר את המרחק ידוע 0.13 (זה יהיה תלוי המטרה לבין ההחלטה בשימוש) ולחץ על העולמית. הגודל של התמונה תוצג כעת ב מיקרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אלפא synuclein ערוץ ובחר הגנגליון, ודא כי הבחירה סוגר את מרכז העצבים של כל הפרוסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה לעיתונות&gt; שכפל לשכפל את התמונה. עם הגנגליון שנבחר, רק תמונה בגודל של הגנגליון יהיו כפולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על Edit&gt; Clear בחוץ. החלק של התמונה מחוץ לאזור הנבחר יהפוך שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכפל את התמונה שוב כדי לקבוע צעדים מאוחר יותר כמה טוב ההליך הלך. תמונות שיש להם אות לרעש גבוה יחס הרקע לא אמור לשמש לניתוח התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &lt;תמונה התאם סף&gt; ולאחר מכן בחר MaxEntropy. ואז לעבור מעל את פרוסות בתמונה קצוץ המקורית על מנת להבטיח כי ההליך יתנהל כשורה. סף entropic בוחר אות עוצמת רמת מבוסס על היסטוגרמה את התמונה רק את אלה פיקסלים עם עוצמות גבוהות מהסף הזה יוצג לבן מעל התמונה השחורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תהליך, ואז ללחוץ על חלקות. צעד זה הופך את הקצוות pixeled של תמונות קצוות חלקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תהליך, ואז ללחוץ על בינארי, ובחרו לעשות בינארי. התמונה תוצג כמו שחור לבן מעל התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכפל תמונה לביצוע הצעד הבא על התמונה המשוכפלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על Analyze&gt; נתח חלקיקים. לאחר מכן בחר הצג: מתאר ולחץ על סכם. שאר ההגדרות יש עלים של ברירת המחדל. פונקציה זו מזהה את המספר הכולל של פיקסלים עם אות ואלה מקובצים יחד. השטח הכולל של פיקסלים עם אות ועוד מספר קבוצות של פיקסלים בגודל ממוצע מדווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה ובחר את הפרוסה הגדולה ביותר זה מתאים היטב. פרוסה יסומנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את טבלת נתונים עם המשטח אלפא synuclein הכולל, מספר תכלילים ואת גודל החלקיקים מתכוון. הדבק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני של Excel או המבואר במקום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל פיג'י ולמצוא את הפרוסה שנבחרו קודם לכן בערוץ-β טובולין, ובחר בה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור הגנגליון ולחץ על נתח ולאחר מכן בחר מדוד. שולחן נוסף יופיע מראה אתהשטח הכולל של הגנגליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את הנתונים מהטבלה לגיליון Excel ליד מדידה אלפא synuclein או להעתיק אותו למקום אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות Excel, לחלק את פרמטרים שונים המתקבלים במדידה אלפא synuclein על ידי השטח הגנגליון לקבל סך אלפא synuclein השטח הכללת מספר מנורמל לפי גודל גנגליון. </li></ol> 4) נציג תוצאות כאשר פרוטוקול הממשל gavage מבוצע כהלכה את הנוחות עבור החיה הן מינימליות. טיפול באמצעות ריכוז rotenone מאפשר השפעה מקומית של rotenone על ENS ללא רמות rotenone בדם שום עכבות של קומפלקס שרירים או מוח המיטוכונדריה אני גם אחרי 1.5 חודשים של טיפול (ראה איור 1). אם ניתוח התמונה מבוצעת כהלכה ניתוח קפדני של דפוס אלפא synuclein צריך להיות אפשרי. זה נותן מידע אמין על הסכום הכולל של אלפא synuclein (השטח הכולל), אלפא synuclein דפוס בתא (מספר תכלילים) ואת הנוכחות של אלפא synuclein תכלילים (גודל הכללה) (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. תפקוד מוטורי ב rotenone העכברים שטופלו ללא זיהוי של rotenone בדם או במערכת העצבים המרכזית. , תקן (50 ng / mL) ו chromatogram דגימות מוח של 20, 10 ו - 5 מ"ג / ק"ג העכברים שטופלו. B ו-C, כימות של רמות rotenone בדם (B) CNS (C). B, בדם 1 , 2 ו - 3 שעות לאחר הטיפול. העכברים חולקו לשלוש קבוצות (n = 3) ו שטופלו 2.5, 5, 10 ו - 20 מ"ג / ק"ג rotenone (n = 3), 300 μL של דם הופק שעות 1, 2 ו -3 לאחר מתן rotenone ונקווה יחד ניתוח HPLC. C, עכברים שטופלו למשך שבוע פעם ביום עם 5 (n = 3), 10 (n = 3) ו -20 (n = 1) מ"ג / ק"ג, rotenone המוח המוח חולצו 1 ו - 2 שעות לאחר הממשל האחרון לקראת ניתוח HPLC. D, קומפלקס פעילות המיטוכונדריה אני בדגימות שריר המוח של 1.5 חודש העכברים שטופלו. <img src="/files/ftp_upload/2123/2123fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Rotenone מנוהל מקומית גורם אלפא synuclein, זירחון הצטברות צבירה עם דבקת בגרעיני ENS. (ברים בהיקף 20 מיקרומטר). A, B, C, אנטי βIII-טובולין, אלפא synuclein והכתים DAPI תריסריון (B) מעי ( A, C) סעיפים. חץ ב ', 1.5 חודשים בטיפול המושרה דפוס גדל אלפא synuclein punctate בתוך הגרעינים enteric מערכת העצבים בהשוואה שולטת 3 חודשים (A). חץ ב-C, 3 חודשים היווצרות טיפול המושרה של אלפא synuclein תכלילים גדול (O&gt; 6 מיקרומטר). D, מכתים immunofluorescence באמצעות אנטי אלפא synuclein, Thioflavine S ו DAPI. חץ ב ד ', רק 3 חודש העכברים שטופלו הראה צבירה של אלה אלפא synuclein הצטברויות גדולות יותר. E, ה', ה'', ניתוח התמונה צעדים כימות. E, למשל תמונה של המשמש כימות מראה הגנגליון ENS immunostained נגד אלפא synuclein מראה תכלילים שונים. ה ', למשל הדימוי המתקבל לאחר פרוטוקול ניתוח התמונה. E'', חפיפה בין כמה תכלילים המקורי (ירוק) ועל ייצוג המתקבל לאחר ביצוע פרוטוקול (קווים צהובים). מהשדה, כימות של הניסוי שמוצג AC נעשה באמצעות פילוח אוטומטי אנטרופיה שיטות מבוססות thresholding. Single-כוכבית, P &lt;0.05, פעמיים כוכבית, P &lt;0.01. F, כל עמודה מייצגת סך אלפא synuclein משטח / הגנגליון פני השטח. G, כל עמודה מייצגת את המספר הכולל של אלפא synuclein תכלילים / משטח גנגליון. כל הגרפים מראים ממוצע ± SEM

<ol><li>Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+alpha-synuclein+immunoreactive+inclusions+in+Meissner%27s+and+Auerbach%27s+plexuses+in+cases+staged+for+Parkinson%27s+disease-related+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology.</a> Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).</li>
<li>Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+an+immunohistochemical+study+of+Lewy+body-containing+neurons+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system.</a> Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).</li>
<li>Wakabayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+occurrence+of+Lewy+bodies+in+the+dorsal+vagal+nucleus+in+a+patient+with+late-onset+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism.</a> J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).</li>
<li>Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+lesions+in+dorsal+horn+layer+I%2C+involvement+of+parasympathetic+and+sympathetic+pre-+and+postganglionic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons.</a> Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).</li>
<li>Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+in+the+development+of+Parkinson%27s+disease-related+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology.</a> Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).</li>
<li>Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risk+of+Parkinson%27s+disease+with+exposure+to+pesticides%2C+farming%2C+well+water%2C+and+rural+living%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living.</a> Neurology. 50, 1346-1350 (1998).</li>
<li>Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+exposure+to+agricultural+work+and+pesticide+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals.</a> Neurology. 42, 1328-1335 (1992).</li>
<li>Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+antecedents+of+young-onset+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease.</a> Neurology. 43, 1150-1158 (1993).</li>
<li>Pan-Montojo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+Parkinson%27s+disease+pathology+is+reproduced+by+intragastric+administration+of+rotenone+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice.</a> PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).</li>
<li>Sherer, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+toxicity+in+rotenone+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).</li>
<li>Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin-induced+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Toxin-induced models of Parkinson's disease.</a> NeuroRx. 2, 484-494 (2005).</li>
<li>Inden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+of+mouse+nigrostriatal+dopaminergic+system+induced+by+repeated+oral+administration+of+rotenone+is+prevented+by+4-phenylbutyrate%2C+a+chemical+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone.</a> J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).</li>
</ol>

פרנסיסקו הפאן Montojo יש יישום פטנט עבור דגם זה בעל החיים (מספר יישומים PCT / EP 2009/005688).

הממשל Intragastric שבוצעה בעבר 12. עם זאת, על פי כתב היד של Inden, rotenone היה מנוהל מומס מלח 0.5% carboxymethylcellulose נתרן (CMSS) לבד. Rotenone הוא חומר liphophylic גבוהה. לכן, rotenone לא יכול להיות מומס CMSS 0.5% בלבד ויהיה להאיץ אם נעשה כך. השימוש כלורופורם יוצר ההשעיה rotenone מופץ באופן שווה הימנעות משקעים. יתר על כן, עקב ריכוז גבוה של חומרי הדברה ב CMSS, נפח הסופי של פתרון מנוהל גם הוא ירד משמעותית. לפיכך, צמצום סיבוכים בממשל. <p class="jove_content" styl...

<table><tbody><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>גרמניה</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>גרמניה</td></tr><tr><td>קרבוקסימתילצלולוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5678</td><td>גרמניה</td></tr><tr><td>קנולות להזנה (Gavage) 1,2 mm x 60 mm</td><td>Unimed</td><td></td><td>שווייץ</td></tr><tr><td>LSM 510</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://pacific.mpi-cbg.de</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אוראלית של rotenone באמצעות gavage וניתוח מקדימה של alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

ב (PD) ומחלת פרקינסון המטופלים, את הפתולוגיה הקשורה כדלקמן דפוס אופייני מעורבים בין היתר 1,2 enteric העצבים (ENS) מערכת, את הנורה חוש הריח (OB), הגרעין מנוע הגבי של התועה (משרד הרישוי) 3, intermediolateral גרעין של 4 חוט השדרה ואת nigra substantia, שסיפק את הבסיס ביים את neuropathological של המחלה 4,5. ENS ו OB הם מבנים העצבים חשופים ביותר הראשונים להיות מושפעים. מעניין, פ&quot;ד כבר הקשורים לחשיפה לחומרי הדברה 6-8. כאן אנחנו מראים בפירוט שתי שיטות השתמשו במחקר הקודם שלנו 9. כדי לנתח את ההשפעות של rotenone משחק מקומי על ENS, אנו rotenone מנוהל באמצעות gavage כדי שנה אחת C57/BL6 עכברים ישנים. Rotenone היא שימוש נרחב בחומרי הדברה, כי בתוקף מעכב קומפלקס המיטוכונדריה אני 10. זה lipophylic מאוד ונספג היטב את מערכת העיכול 11. התוצאות שלנו הראו כי הממשל של 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג של rotenone לא לעכב קומפלקס המיטוכונדריה אני בפעילות השריר או המוח. לפיכך, טוען כי באמצעות שיטת הממשל שלנו rotenone לא לחצות את מערכת hepatoportal והיה פועל אך ורק על ENS. כאן אנו מציגים שיטה לנהל הדברה באמצעות gavage ואת פרוטוקול ניתוח תמונת להשתמש כדי לנתח את ההשפעות של חומרי הדברה ב הצטברות אלפא synuclein ב ENS. החלק הראשון מציג שיטה המאפשרת ניהול intragastric של חומרי הדברה (rotenone) בריכוז המדויק הרצוי. השיטה השנייה מראה חצי אוטומטי ניתוח התמונה פרוטוקול לנתח אלפא synuclein הצטברות של ENS באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

מחלת פרקינסון כבר קשור לחשיפה לחומרי הדברה. כאן אנו מציגים שיטה כדי לספק חומרי הדברה באמצעות צינור קיבה בריכוז הרצוי שיטה לנתח את ההשפעה שלהם הצטברות אלפא synuclein במערכת העצבים enteric.

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

במטופלים עם מחלת פרקינסון (PD), הפתולוגיה הנלווית עוקבת אחר תבנית אופיינית הכוללת, בין היתר, את מערכת העצבים האנטרית (ENS) 1,2, ...

התסמינים של מחלת פרקינסון, הכוללים ליקויים בתפקוד המוטורי ובדיבור, נובעים מפעילות מופחתת של תאים מפרישי דופמין במוח. מערכת העצבים האנטרית והבצילול ריח הם המבנים העצביים החשופים ביותר והראשונים להיות מושפעים. מחלת פרקינסון נקשרה לחשיפה לחומרי הדברה.על מנת לנתח את השפעותיהם של חומרי הדברה על מערכת העצבים האנטרית, מוזן חומר ההדברה roone לעכברים באמצעות זריקה פומית (oral gavage). לאחר מכן, העכברים עוברים פרפוזיה תוך-לבבית עם 4% paraform, aldehyde של המוח ומערכת העצבים האנטרית. הרקמה מופקת, מוכנה ונצבעת אימונוהיסטוכימית עבור חלבונים הקשורים ל-PD.תמונות של Beta three tubulin ו-alpha synuclein שהושגו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מדגימות הצטברות של alpha synuclein בתוך נוירונים של מערכת העצבים האנטרية בבעלי חיים שנחשפו לחשוף לחומרי הדברה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מתן סיסטמי של rotenone, הוא שבשימוש בטכניקה זו מובטח שהשפעתו של rotenone תוגבל למערכת העצבים האנטרية. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחלת פרקינסון, כגון האטיולוגיה שלה והמנגנונים העומדים בבסיס התקדמותה.להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול והאבחנה של מחלת פרקינסון, שכן היא תאפשר פיתוח של מטרות טיפוליות ושיטות אבחנה חדשות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון מחקר של השפעת רעלים סביבתיים אחרים על מערכות העצבים האנטריות, הסימפתטיות והפרא-סימפתטיות, וכן על דופן המעי. באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטות אלו יתקלו בקשיים, שכן נדרש זמן מסוים כדי לשלוט בביצוע ה-gavage.הרעיון לשיטות אלו עלה בדעתי לראשונה כאשר קראתי על הקשר בין חומרי הדברה למחלת הפרקינסון. כמו כן, היה מועיל לצפות בוועידה של CORAs במסגרת הקונגרס העולמי לפרקינסון בברלין בשנת 2005. יש צורך בהדגמה שלמה של שיטה זו.השיטה למתן ol באמצעות זונד קיבתי (gavage) היא קשה מכיוון שלעכברים יש מערכת אנטומית שונה מזו של בני אדם; מצד שני, ניתוח התמונות בוצע באמצעות שלבים מותאמים אישית עבור תמונות אלו. התחילו את הפרוטוקול בשקילת בעל החיים. חשבו את הנפח המתאים של rotenone.נדרש 0.01 milliliters לכל גרם ממשקל בעל החיים, דבר התואם למינון roone של חמישה milligram ל-kilogram. מלא מזרק של one milliliter בתמיסת roone, ולאחר מכן מלא מזרק שני בתמיסת ה-vehicle. הרם את העכבר והחזק את זנבו ביד אחת.מתחו את עור הצוואר על ידי משיכה באמצעות שתי האצבעות הראשונות של היד השנייה. ברגע שהראש מקובע בין שתי האצבעות, הישענו אותו כנגד כף היד והפכו אותו למצב הפוך. קבעו את הזנב.בעזרת האצבעות הרביעית והחמישית, תוך שמירה על הראש לכיוון האחור, לחצו על החיך כדי לפתוח את פיו של העכבר. הכניסו בעדינות את קנולת ההזנה (gavage) אל תוך הפה. הזיזו את הקנולה באיטיות לכיוון הקיבה עד להחדרת אורכה המלא.כדי למנוע חדירה של חומר לריאות, הניחו את תמיסת ה-roone או את הנשאי (vehicle) על ידי לחיצה עדינה על הבוליס. עם סיום הפעולה, הוציאו באיטיות את סונדת ההזנה (gavage) והחזירו את החיה לכלוב אחר עד לסיום הטיפול בכל בעלי החיים מאותו כלוב. בעקבות הטיפול, העכברים יעברו פרפוזיה תוך-לבבית עם 4% paraform aldehyde.ב-PBS, המעיים מופקים על ידי דיסקציה ומונחים ב-15% sucrose למשך הלילה. למחרת, הרקמה מועברת ל-30% sucrose ומודגרה שוב למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הרקמה מושמת במקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ונשמרת עד לשימוש. באמצעות קריוסטט, נחתכים פרוסות מעי בעובי של 20 micron.חתכים רוחביים מועברים לשקופיות, ולאחר מכן מבוצעים הליכי חסימה וצביעה אימונוהיסטוכימית. השלבים מבוצעים באמצעות נוגדנים ל-beta three tubulin ו-Antifa synuclein. מומלץ שגורם חיצוני יבצע ניתוח עיוור של הנתונים.כדי להתחיל בניתוח, פתחו את תוכנת Fiji. פתחו את קובץ תמונת המיקרוסקופ הקונפוקאלי. לאחר מכן, הפרידו את הערוצים כדי שיהיה ניתן לעבוד על כל ערוץ באופן עצמאי.סגרו את הערוצים שאינם בשימוש ובחרו ב-analyze, לאחר מכן הגדירו את ה-set, ה-scale, וקבעו את גודל הפיקסל ל-one. הגדירו את ה-known distance ל-0.13 ולחצו על global. כעת יסומן גודל התמונה במיקרונים.בחרו את הערוץ של alpha synuclein ובחרו את הגנגליון. ודאו שהבחירה מקיפה את הגנגליון בכל הפרוסות. שכפלו את התמונה כאשר רק הגנגליון נבחר; תשוכפל תמונה בגודלו של הגנגליון בלבד.לחצו על עריכה; השטח שמחוץ לאזור הנבחר בתמונה יהפוך לשחור. שכפלו את התמונה שוב כדי לקבוע עד כמה הפרוצדורה הצליחה. אין להשתמש לניתוח תמונות בתמונות בעלות יחס נמוך בין האות לרעש הרקע.בחר ב-image adjust threshold. לאחר מכן בחר ב-max entropy. לאחר מכן עבור על הפרוסות בתמונה החתוכה ובמקורית כדי לוודא שהתהליך בוצע כהלכה.סף הטרופיק (tropic threshold) בוחר רמת אות של עוצמה על בסיס ההיסטוגרמה של התמונה, ורק פיקסלים עם עוצמה הגבוהה מסף זה יוצגו בתהליך בחירה של תמונה לבנה על רקע שחור. לאחר מכן לחצו על smooth. שלב זה הופך את הקצוות הפיקסליים של התמונות לקצוות חלקים בתהליך הבחירה.לאחר מכן לחצו על binary ובחרו ב-Make binary. התמונה תוצג כתמונה בשחור על רקע לבן; כדי לבצע את השלב הבא על העתק של התמונה, לחצו על analyze ולאחר מכן על analyze particles. לאחר מכן בחרו ב-show outlines ולחצו על summarize.את שאר ההגדרות יש להשאיר כברירת המחדל. פונקציה זו מזהה את המספר הכולל של פיקסלים עם אות ואת אלו המקובצים יחד כשטח הפנים הכולל של פיקסלים עם אות. בנוסף, מדווחים מספר קבוצות הפיקסלים והגודל הממוצע.השוו ובחרו את הפרוסה בעלת השטח הכולל הגדול ביותר המתאימה באופן טוב. הפרוסה תסומן. העתיקו את טבלת הנתונים עם שטח הפנים הכולל של alpha synuclein, מספר התוך-כלות (inclusions) וגודל החלקיקים הממוצע.הדביקו את הנתונים בגיליון Excel או רשמו אותם במקום אחר. חזרו ל-Fiji. אתרו את הפרוסה שנבחרה קודם לכן בערוץ ה-beta tubulin ובחרו אותה.בחר את אזור הגנגליון ולחץ על analyze. לאחר מכן בחר ב-measure. תופיע טבלה נוספת המציגה את השטח הכולל של הגנגליון.חלץ את הנתונים מהטבלה לגיליון אלקטרוני של Excel בסמוך למדידת ה-alpha synuclein או העתק אותם למקום אחר באמצעות Excel. חלק את הפרמטרים השונים שהתקבלו במדידת ה-alpha synuclein בשטח הגנגליון כדי לקבל את סך ה-alpha-synuclein למשטח ואת מספר ההכלילה (inclusion number) מנורמל לפי גודל הגנגליון, וזאת כדי לנתח את ההשפעות של rotenone הפועל באופן מקומי על מערכת העצבים האנטרית. מינון של 5 mg/kg של קוטב ההדברה rotenone ניתן באמצעות זריקה פומית (oral gavage) לעכברי C 57 black six בני שנה. הכרומטוגרמה המוצגת כאן מראה נוכחות של שיא (peak) של rotenone שעה לאחר המתן. עכברי ביקורת טופלו ב-20 mg/kg של rotenone ו-5 mg/kg של rotenone.רמות Rotenone נקבעו עבור תמציות של דם, מוח וגזע המוח באמצעות HPLC כפי שמוצג כאן. מתן של חמישה מיליגרם לקילוגרם של rotenone באמצעות הזנה פומית (oral gavage) אינו מוביל לרמות מדידות בדם שעה, שעתיים או שלוש שעות לאחר הטיפול, כפי שנקבע באמצעות HPLC. גרפיקה זו מראה את רמות ה-rot במוח ובגזע המוח של עכברים שטופלו.שעה לאחר מתן מינון של 10 מיליגרם לקילוגרם או פחות של rotenone, לא נמצאו רמות של rotenone בדגימות של המוח או גזע המוח. שעה לאחר המתן, נמדדה פעילות של mitochondrial complex one בדגימות שריר ומוח של עכברים בני 1.5 חודשים שקיבלו טיפול. לא נמצא הבדל משמעותי בין הקבוצות, דבר המעיד על היעדר עיכוב של mitochondrial complex one, ובכך אושש כי לא היה rotenone באזורים אלו.ניתוח של alpha synuclein, מרכיב גוף לוי במחלת הפרקינסון, לאחר מתן rone, מאפשר קביעה מהימנה של הכמות הכוללת של alpha synuclein על פני השטח, נוכחות של הכלות (inclusions) של alpha synuclein, ותבנית ה-alpha synuclein בתא. איור זה מציג צביעה של anti beta three tubulin, alpha synuclein ו-DAPI בחתכים של התריסון (duodenum) והמעי העקום (ileum), כפי שניתן לראות כאן. טיפול של 1.5 חודשים ב-roach known גרם להגברת תבנית נקודתית (punctate pattern) של alpha synuclein בתוך גנגליונים של מערכת העצבים האנטרלית, אפילו בהשוואה לקבוצות ביקורת של שלושה חודשים.ניתן לראות תבנית זו הן באילאום והן בתרישקה. לאחר שלושה חודשי טיפול, ניתן לראות היווצרות של הכללות alpha synuclein גדולות יותר; צביעה אימונופלורסצנטית באמצעות anti alphas synuclein, theof, flavin ו-DPI מדגימה הצטברות של משקעי alpha synuclein גדולים יותר רק בשלושה חודשים. ניסוי זה נותח באמצעות שיטות של סגמנטציה אוטומטית וסף מבוסס אנטרופיה.בגרף משמאל, כל עמודה מייצגת את סך השטח של alpha synuclein ביחס לשטח הגנגליון. בגרף מימין, כל עמודה מייצגת את המספר הכולל של הכללות alpha synuclein לכל שטח גנגליון שנדגם. יחד, נתונים אלו מעידים כי מתן מקומי של rotenone משרה פוספורילציה, הצטברות ואגרגציה של alpha synuclein עם גליוזיס בגנגליונים של מערכת העצבים האנטרית. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בדקה אחת לבעל חיים, אם היא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להחדיר את קטטר ההזנה (gavage) בעדינות, ובמקרה של היתקלות במכשולים, עדיף להוציאו ולהחדירו שוב בהתאם להנחיות אלו. ניתן לבצע שיטות נוספות כגון HPLC, צביעה אימונוהיסטוכימית ואנליזה של תמונות. הדבר יאפשר לנתח אזורים אחרים, את השפעות החומר, או אף את נוכחות החומר בדם לאחר פיתוחו.טכניקה זו סללה את הדרך עבור מדעני מוח לחקור את השפעותיהם של נוירוטוקסינים סביבתיים על מערכת העצבים האנטרית. לאחר צפייה בסרטון זה, תוכלו להשתמש במד המידה בצורה נכונה ולנתח את התמונות המתקבלות מהאימונוכימיה. זכרו כי עבודה עם חומרים רקובים עלולה להיות מסוכנת ביותר.לפיכך, אנו ממליצים להשתמש בכפפות ובמסכות בעת ביצוע פרוצדורה זו.

oral-administration-rotenone-using-gavage-image-analysis-alpha

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים הזרקה של סיבי אלפא-סינוקלאין לעכבר כדי לגרום לדלקת עצבית. הסיבים מוזרקים תוך צפקית לעכבר מהונדס המבטא חלבוני אלפא-סינוקלאין שעברו מוטציה. עם הגעתם למערכת העצבים המרכזית, הסיבים נכנסים לנוירונים וגורמים לצבירה של החלבונים שעברו מוטציה. הצברים התפשטו לתאי עצב שכנים, מיקרוגליה ואסטרוציטים. זיהוי הצברים מעורר תאי מיקרוגליה לגרום לדלקת עצבית, ולפגוע בנוירונים.

השראת דלקת עצבית בעכברים באמצעות הזרקת סיבי אלפא-סינוקלאין

מתואר ELISA המציע גישה כמותית חדשנית. הוא מגלה באופן ספציפי α-סינקליין הקשור למחלה (αSD) במודל עכבר מהונדס (M83) של סינקלינופתיה באמצעות מספר נוגדנים נגד צורת ה-αS המפוספסת ב-Ser129 או החלק ה-C-סופי של החלבון.

איתור של α-סינוקלאין קשורים למחלות על ידי ELISA משופר במוח של עכברים הטרנסגניים ביתר A53T אדם מוטצית α-סינוקלאין

כתב יד זה מתאר כיצד העברת גנים מקומיים בתיווך וקטור ויראלי מספקת דרך אטרקטיבית לבטא טרנסגנים במערכת העצבים המרכזית.  הפרוטוקול מתאר את כל השלבים החיוניים לביצוע הזרקת וקטור ויראלי בחומר השחור של החולדה כדי לפתח מודל בעלי חיים מבוסס וקטור ויראלי למחלת פרקינסון.

פיתוח של מודל עכברוש מבוסס אלפא-synuclein עבור מחלת פרקינסון באמצעות הזרקת stereotactic של וקטור ויראלי הקשורים מוקטורים

הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק או הלשון של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, המבטאים אלפא-synuclein אדם עם מוטצית A53T משפחתית בלוציפראז גחלילית, יכול לגרום בנוירופתולוגיה, כולל neuroinflammation , במערכת העצבים המרכזית שלהם.

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

כאן אנו מציגים שיטה אוטומטית לקביעה כמותית למחצה של מספר נוירון דופאמין בסובסטנציה חולדה nigra pars compacta.

קביעה כמותית למחצה של צפיפות נוירון דופאמין בסבסטנציה ניגרה של מודלים מכרסמים באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי

במאמר זה, אנו מציגים כיצד להשתמש במערכת ניקוד של שבע נקודות כדי לכמת באופן עקבי שינויים במורפולוגיה של נוירון דנדריט דופאמין ב- C. elegans. מערכת זו מיועדת לנתחים של בדיקות ניוון עצבי דופאמין באמצעות מודלים גנטיים, כימיים ומבוססי גיל של הפרעות ניווניות.

כימות רמות של נוירון דופאמין שינוי מורפולוגי ניוון ב elegans Caenorhabditis

עבודה זו מנתחת את המינון הווקטורי ואת זמן החשיפה הנדרשים כדי לגרום לדלקת עצבית, ניוון עצבי ופגיעה מוטורית במודל פרה-קליני זה של מחלת פרקינסון. וקטורים אלה המקודדים את α-סינוקלאין האנושי מועברים לתוך הסובסטנטיה ניגרה כדי לשחזר את הפתולוגיה הסינוקליינית הקשורה למחלת פרקינסון.

ניתוח מודל העכבר של מחלת הפרקינסון המושרה על ידי וקטורים ויראליים הקשורים לאדנו המקודדים α-סינוקלאין אנושי

מוצגת שיטת זלוף נוחה הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר. זיהוי אימונופלואורסצנטי של α-סינוקלאין זרחני מודגם במודל עכברי של מחלת פרקינסון. עבודה זו גם מתארת באופן מקיף את ההעתקה, הנתיחה, הקפאת/הטבעת רקמות ושלבי חתך קפואים.

שיטת פרפוזיה טרנסקרדיאלית הניזונה מכוח הכבידה לניתוח היסטולוגי של מערכת העצבים המרכזית של העכבר

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למתן תוך-אפי של צברי α-סינוקלאין. שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפשטות α-סינוקלאין מרירית חוש הריח לפקעת הריח במחלת פרקינסון.

טכניקה למתן תוך אפי של אגרגטים α-סינוקלאין

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול electroporate ברחם לבין קליפת המוח להיפוקמפוס ב E14.5 בעכברים. כמו כן, אנו מראים כי מדובר בשיטה בעלת ערך ללמוד דנדריטים הקוצים שני אזורים מוחיים.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

למדו שיטת מתן רוטנון דרך הזנה ישירה לקיבה וניתוח צביעת אימונוהיסטוכימיה לאיתור צבירי אלפא-סינוקלאין במערכת העצבים המעיים. שיטה זו מאפשרת חקר השפעות חומרי הדברה על מחלת פרקינסון.

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

גלה סרטונים נוספים