אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

התסמינים של מחלת פרקינסון, כולל הפרעות מוטוריות ודיבור, נובעים מפעילות מופחתת של תאים מפרישי דופמין במוח. מערכת העצבים המעי ונורת הריח הם מבני העצבים החשופים ביותר והראשונים שנפגעו. מחלת פרקינסון נקשרה לחשיפה לחומרי הדברה.

על מנת לנתח את ההשפעות של חומרי הדברה על מערכת העצבים המעי, חומר ההדברה רון ניתן לעכברים על ידי גבאז' דרך הפה. לאחר מכן העכברים עוברים עירוי תוך לבבי עם 4% פרפורם, מוח אלדהיד ומערכת העצבים המעי. הרקמה מופקת, מוכנה ומכינה את החלבונים הקשורים למחלת פרקינסון.

תמונות בטא שלוש טובולין ואלפא סינוקלאין שנרכשו במיקרוסקופיה קונפוקלית מדגימות הצטברות של אלפא סינוקלאין בתוך נוירונים של מערכת העצבים המעי בבעלי חיים שנחשפו לחומרי הדברה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מתן מערכתי של רוטנון, הוא שבאמצעות טכניקה זו מובטח כי השפעת הרוטנון מוגבלת למערכת העצבים המעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחלת פרקינסון, כגון האטיולוגיה שלה והמנגנונים העומדים בבסיס התקדמותה.

ההשלכות של טכניקה זו מרחיבות את הטיפול במגדל ואבחון מחלת הפרקינסון מכיוון שהן יאפשרו פיתוח מטרות טיפוליות ושיטות אבחון חדשות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פתופיזיולוגיה של מחלת פרקינסון, ניתן ליישם אותה גם במערכות אחרות כגון חקר ההשפעה של רעלים סביבתיים אחרים על מערכת העצבים המעי, הסימפתטית והפאראסימפתטית כמו גם על דופן המעי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטות אלה יתקשו מכיוון שלוקח זמן לשלוט בגבאז'.

הרעיון של השיטות הללו עלה לי לראשונה כשקראתי על הקשר בין חומרי הדברה למחלת פרקינסון. היה מועיל גם לראות את כנס ה-CORA הגבוה בקונגרס הפרקינסון העולמי בברלין ב-2005. הדגמה שקטה של שיטה זו נחוצה.

השיטה לניהול ol עם הגוואג' קשה מכיוון שלעכברים יש אנטומיה שונה מבני אדם בצד השני, ניתוח התמונה נעשה עם שלבים מותאמים אישית לתמונות אלה. התחל את הפרוטוקול על ידי שקילת החיה. חשב את נפח הרוטנון המתאים.

יש צורך ב-0.01 מיליליטר לגרם ממשקל החיה, המתאים למינון של חמישה מיליגרם לק"ג. טען מזרק מיליליטר אחד עם תמיסת הרון, ולאחר מכן טען מזרק שני עם תמיסת הרכב. הרם את העכבר והחזק את זנב העכבר ביד אחת.

מתחו את עור הצוואר על ידי משיכתו בשתי האצבעות הראשונות של היד השנייה. לאחר שהראש מקובע בין שתי האצבעות, נשען אותו על כף היד והפוך אותו הפוך. תקן את הזנב.

בעזרת האצבעות הרביעית והחמישית, תוך שמירה על הראש לכיוון הגב, לחץ על החך כדי לפתוח את פיו של העכבר. הכניסו בעדינות את הגוואג' לפה. הזיזו לאט את הגוואג' לכיוון הקיבה עד להחדרת מלוא אורכו.

על מנת למנוע כניסת חומר לריאות, יש לתת את תמיסת ה-roone או הרכב על ידי לחיצה עדינה על התסחיף. בסיום, הוציאו לאט את הגוואג', החזירו את החיה לכלוב אחר עד שכל החיות מכלוב אחד סיימו. לאחר הטיפול העכברים מקבלים שפע תוך לבבי עם 4% אלדהיד פרפורם.

ב-PBS, המעיים נשאבים על ידי דיסקציה ומכניסים אותם ל-15% סוכרוז למשך הלילה. למחרת, הרקמה מועברת ל-30% סוכרוז ומודגרת שוב למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן מניחים את הרקמה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס ומאחסנים עד לשימוש באמצעות מעי קריוסטט 20 מיקרון.

חתכים מועברים למגלשות רוסט, הליכי חסימה וצביעה חיסונית. באמצעות אנטי בטא מבוצעים שלושה נוגדנים לטובולין ואנטיפה סינוקלאין. מומלץ שגורם חיצוני יבצע ניתוח עיוור של הנתונים.

כדי להתחיל בניתוח, פתח את תוכנת פיג'י. פתח את קובץ התמונה הקונפוקלי. לאחר מכן פצל את הערוצים כך שככל האפשר ניתן לעבוד על כל ערוץ באופן עצמאי.

סגור את הערוצים שלא ישמשו ובחר, נתח, הגדר, קנה מידה והגדר את גודל הפיקסלים לאחד. הגדר את המרחק הידוע ל-0.13 ולחץ על גלובלי. גודל התמונה יוצג כעת במיקרונים.

בחר ערוץ אלפא סינוקלאין ובחר גנגליון. מוודאים שהבחירה סוגרת את הגנגליון בכל הפרוסות. שכפל את התמונה כשהגנגליון נבחר רק תמונה בגודל הגנגליון תשוכפל.

לחיצה על עריכה נקה מחוץ לחלק התמונה מחוץ לאזור שנבחר יהפוך לשחור. שכפל את התמונה שוב כדי לקבוע את מידת ההצלחה של ההליך. אין להשתמש בתמונות בעלות יחס אות נמוך לרעשי רקע לניתוח תמונה.

בחר סף התאמת תמונה. לאחר מכן בחר אנטרופיה מקסימלית. לאחר מכן עברו על הפרוסות בתמונה החתוכה ובתמונה המקורית כדי לוודא שההליך עבר כשורה.

הסף הטרופי בוחר רמת אות עוצמה על סמך היסטוגרמה של התמונה, ורק הפיקסלים עם עוצמות גבוהות מסף זה יוצגו בתהליך בחירת תמונה לבן על שחור. לאחר מכן לחץ על חלק. שלב זה הופך את הקצוות המפוקסלים של התמונות לתהליך בחירה של קצוות חלקים.

לאחר מכן לחץ על בינארי ובחר הפוך לבינארי. התמונה תוצג כתמונה כפולה בשחור על גבי לבן כדי לבצע את השלב הבא בתמונה המשוכפלת, לחץ על ניתוח, ניתוח חלקיקים. לאחר מכן בחר הצג קווי מתאר ולחץ על סיכום.

יש להשאיר את שאר ההגדרה כברירת מחדל. פונקציה זו מזהה את המספר הכולל של פיקסלים עם אות ואת אלה המקובצים יחד את המשטח הכולל של פיקסלים עם אות. בנוסף מדווחים מספר קבוצות הפיקסלים והגודל הממוצע.

השוו ובחרו את הפרוסה עם השטח הכולל הגדול ביותר שמתאים היטב. הפרוסה תסומן. העתק את טבלת הנתונים עם משטח האלפא סינוקלאין הכולל, מספר התכלילים וגודל החלקיקים הממוצע.

הדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני של Excel או עם ביאורים במקום אחר. נחזור לפיג'י. מצא את הפרוסה הקודמת שנבחרה בערוץ הבטא טובולין ובחר בה.

בחר אזור גנגליון ולחץ על ניתוח. לאחר מכן בחר מדידה. טבלה נוספת תופיע המציגה את פני השטח הכוללים של הגנגליון.

חלץ את הנתונים מהטבלה לגיליון אלקטרוני של Excel ליד מדידת אלפא סינוקלאין או העתק אותם למקום אחר באמצעות Excel. חלקו את הפרמטרים השונים המתקבלים במדידת אלפא סינוקלאין על ידי משטח הגנגליון כדי לקבל את משטח האלפא-סינוקלאין הכולל ומספר ההכללה המנורמל על ידי גודל הגנגליון על מנת לנתח את ההשפעות של רון הפועל באופן מקומי על מערכת העצבים המעי, חמישה מיליגרם לק"ג של ריקבון חומרי ההדברה הידועים ניתנו על ידי גבאג' דרך הפה לשישה עכברים שחורים בני שנה C. הכרומטוגרמה המוצגת כאן מראה נוכחות של שיא ידוע של רוטן שעה לאחר המתן שולט בעכברים שטופלו ב-20 מיליגרם לק"ג רוטנון 10 וחמישה מיליגרם לק"ג רוטנון.

רמות רוטנון נקבעו עבור מיצוי דם ומוח וגזע המוח על ידי HPLC כפי שמוצג כאן. מתן של חמישה מיליגרם לק"ג רקוב דרך הפה אינו מביא לרמות מדידות בדם שעה, שעתיים או שלוש לאחר הטיפול כפי שנקבע על ידי H plc. הגרף הזה מראה רמות ריקבון במוח ובגזע המוח של עכברים שטופלו.

שעה לאחר מתן מיצוי של 10 מיליגרם לק"ג או פחות של רוטנון מראה, אין רמות רוטון בדגימות המוח או גזע המוח. שעה לאחר מתן קומפלקס מיטוכונדריה, הוערכה פעילות אחת בדגימות שריר ומוח של עכברים שטופלו בחודש וחצי. אין הבדל משמעותי בין הקבוצות שהראו שאין עיכוב של קומפלקס מיטוכונדריאלי אחד, ובכך מאשר שלא היה RONE באזורים אלה.

ניתוח מחלת הפרקינסון, מרכיב גוף לוי אלפא סינוקלאין לאחר מתן rone מאפשר קביעה מהימנה של כמות פני השטח הכוללת של אלפא סינוקלאין, נוכחות של תכלילי אלפא סינוקלאין ודפוס אלפא סינוקלאין בתא. איור זה מציג צביעת אנטי בטא שלושה טובולין, אלפא סינוקלאין ו-DAPI בקטעי תריסריון ואילאום כפי שניתן לראות כאן. טיפול של 1.5 חודשים עם מקק ידוע גרם לדפוס מנוקב מוגבר של אלפא סינוקלאין בתוך גרעיני מערכת העצבים המעי, אפילו אחד בהשוואה לביקורת של שלושה חודשים.

ניתן לראות דפוס זה הן באילאום והן בתריסריון. לאחר שלושה חודשי טיפול ניתן לראות היווצרות של תכלילי אלפא סינוקלאין גדולים יותר ניתן לראות צביעה אימונו-פלואורסצנטית באמצעות אנטי אלפא סינוקלאין, theof, flavin ו-DPI מדגימה צבירה של הצטברות גדולה יותר של אלפא סינוקלאין רק לאחר שלושה חודשים. ניסוי זה נותח באמצעות שיטות סגמנטציה אוטומטיות וסף מבוססות אנטרופיה.

בגרף משמאל, כל עמודה מייצגת את פני השטח הכולל של אלפא סינוקלאין למשטח הגנגליון. בגרף מימין, כל עמודה מייצגת את המספר הכולל של תכלילי אלפא סינוקלאין לכל משטח גנגליון שנלקח. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שמתן מקומי של רוטנון גורם לזרחון, הצטברות וצבירה של אלפא סינוקלאין עם גליוזיס בגרעיני מערכת העצבים המעי לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך דקה אחת לכל בעל חיים אם מבוצעת כהלכה.

בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב להכניס את הגוואג' בעדינות, ואם נמצאו מכשולים כלשהם, עדיף להוציא אותו ולהציג אותו שוב בעקבות ההליכים הללו. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו HPLC, כתמים חיסוניים וניתוח תמונה. זה יאפשר לנתח אזורים אחרים, את השפעות החומר, או אפילו את נוכחות החומר בדם לאחר התפתחותו.

טכניקה זו סללה את הדרך למדעני מוח לחקור את ההשפעות של נוירוטוקסינים סביבתיים על מערכת העצבים המעי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל ליישם את המד בצורה נכונה ולנתח את התמונות המגיעות מהאימונוכימיה. אל תשכח שעבודה עם רקוב יכולה להיות מסוכנת ביותר.

לכן, אנו ממליצים להשתמש בכפפות ומסכות בעת ביצוע הליך זה. ה.