Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאפיין פנוטיפים של שינה ומקצב צירקדי ב-drosophila על ידי בדיקת מקצבים יומיים של פעילות לוקומטורית. זאת מושגים על ידי יצירת זבובים טרנסגניים, השגת מוטנטים ספציפיים או ביצוע הכלאות נחוצות להכנת בעלי החיים לניסוי. כשלב שני, יש להכין מבחנות פעילות מזכוכית המכילות מקור מזון, אשר ישמשו כסביבת המחיה של הזבובים במהלך הניסוי.

לאחר מכן, זבובים בני יום עד חמישה ימים מוכנסים לתוך מבחנות פעילות, אשר נטענות בתוך מסכי פעילות DAM כדי לנטר מקצבי פעילות מוטורית. באמצעות מערכת ה-DAM מתקבלים תוצאות המראות פגמים ושינויים בפרמטרים של שינה ומקצבים צירקדיים, בהתבסס על ניתוח של מקצבי פעילות מוטורית יומית באמצעות תוכנות כגון far sex ו-insomniac. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הצירקדית, כגון אילו חלבונים ומנגנוני בקרה מעורבים ביצירת מקצבים תקינים, ולדוגמה, כיצד גורמים סביבתיים כמו אור וטמפרטורה מווסתים מקצבים התנהגותיים דרך מסלולים מולקולריים ספציפיים.

מערכת לניטור פעילות לוקומטורית כוללת ציוד רב, כגון מכשירי ניטור ייעודיים, אינקובטורים סביבתיים בעלי יכולת בקרת תאורה יומית, מכשירים לאיסוף נתונים, מחשבים וחומרה היקפית כגון חיווט. יש לבחור חדר חשוך בעל אוורור טוב ובקרת טמפרטורה עבור מערכת ניטור הפעילות הלוקומטורית, וזאת כדי למנוע עומס יתר על האינקובטורים ומניעת כשלים אפשריים בשמירה על הטמפרטורה. יש לאטום את החדר ממקורות אור חיצוניים. אין צורך לעבוד בחשיכה מוחלטת, שכן המערכת הצירקדיאנית של זבוב הפירות אינה רגישה לאור אינפרא-אדום.

לפיכך, במקרים בהם עלינו לראות בחדר חשוך, נשתמש פשוט בפנס סטנדרטי המכוסה במסנן אדום שנרכש, ובספק כוח בלתי פסיק (UPS) כיחידת גיבוי לשעת חירום בעלת הספק וואט מספיק להנעת רכיבי מערכת ניטור הפעילות. במקרה של נחשול מתח או הפסקת חשמל בבניין, חברו את יחידת הגיבוי של ה-UPS למעגל הגיבוי לשעת חירום של הבניין, אם קיים כזה. אם המערכת השולטת בתאורה בתוך האינקובטור אינה מוסדרת ישירות על ידי האינקובטור, מספיק לחבר את האינקובטור לחשמל לגיבוי ללא UPS, שכן אובדן חשמל למשך מספר שניות לא ישפיע על טמפרטורת התא.

בשלב הבא, הגדירו מחשב, PC או Macintosh, המוקדש באופן מלא לאיסוף נתונים ו/או לבקרת האינקובטורים. סדרו ידנית את רשת קווי הטלפון בצורה מסודרת מסביב למדפי האינקובטורים בעלי הבקרה הסביבתית, כדי לאפשר חיבור וניתוק קלים של הפעילות. הגדירו מספר קווי טלפון כך שהם יתכנסו לקו ראשי אחד שיוצא מהאינקובטור ומתחבר למחשב; חברו את מכשירי הניטור בתוך האינקובטורים למחשב באמצעות יחידת ממשק ספק כוח, המשמשת להזנת הניטור של הפעילות באמצעות קו הטלפון.

לבסוף, חסמו מקורות אור אפשריים מנורות LED של מכשירים אלקטרוניים או מדלת דגרה שאינה אטומה כראוי באמצעות סרט דביק חזק או בד שחור. זאת כדי להבטיח שמקצבים חופשיים (free running rhythms) יימדדו בהיעדר אור לא רצוי. חיוני להעריך פנוטיפים אלו באמצעות חיות בקרה מתאימות שגודלו באותם תנאים סביבתיים והם בני אותו גיל.

בנוסף, קיים דימורפיזם מיני במקצביות הצירקדיות. הפרקטיקה המקובלת היא להשתמש בניסויים אלו בזבובים זכרים בוגרים, שגודלו בטמפרטורה של 25 °C וגילם בין יום לחמישה ימים, מאחר שפעילות הנחת ביצים בנקבות תשפיע על המדידה המדויקת של הפעילות המוטורית. כאשר בוחנים פרמטרים צירקדיים ושל שינה ומנוחה בזבובים מוטנטיים ספציפיים, מומלץ לבצע הכלאה חוץית (outcross) של המאגר המוטנטי עם זן הטיפוס הפראי בעל אותו רקע גנטי.

לדוגמה, W 1118 או yw. מאחר שאין שחלוף בזכרי דרוזופילה, עדיף לבצע את ההכלאה החוצה על ידי הצלבת נקבות מוטנטיות עם זכרים מסוג בר. זרע הן את זבובים מסוג בר (בקרה) והן את הזבובים המוטנטיים בו-זמנית במצע מזון סטנדרטי לדרוזופילה למשך כ-10 עד 14 ימים לפני ניסוי מקצב הפעילות המוטורית. עם בקיעת הצאצאים, אסוף זכרים בני יום עד חמישה ימים והפר אותם לשימוש בניסויים.

מבחנות פעילות מייצגות את בית הגידול של הזבוב. במהלך הניסוי, אלו הן מבחנות זכוכית דקות בקוטר של five millimeter המכילות חומרי מזון בקצה אחד וסגורות בחוט צמר או בפקק פלסטיק בקצה השני. עדיף להשתמש במבחנות פעילות שהוכנו לאחרונה.

בדרך כלל הם מוכנים מספר ימים עד שבוע לפני תחילת הניסוי. מכיוון שניתן להשתמש במבחנות פעילות מזכוכית מספר פעמים, הליכי ההכנה הבאים מתארים שימוש במבחנות פעילות ששימשו בעבר ואינן נקיות כנקודת התחלה. אם אתם משתמשים במבחנות פעילות חדשות, פשוט דלגו לשלב האוטוקלביזציה של המבחנות כפי שמוצג בהמשך.

הסר את הפקקים מצינורות הפעילות המשומשים והנח אותם בתוך כוס כימית גדולה מזכוכית. הצינורות צריכים למלא רק עד מחצית מהכוס. מלא את הכוס במי ברז, תוך כדי וידוא שכל הצינורות שקועים במים.

חממו במיקרוגל את הכלי המלא בנבובות זכוכית עד שהמים יגיעו לרתיחה מלאה וסוערת. בעת המסת השעווה ומזון האגר, יש לנקוט במשנה זהירות כיוון שהמים חמים. הוציאו את הכלי מהמיקרוגל וערבבו את הנבובות בעזרת שפכטל או כלי פלסטיק.

פיפט של 10 מילימטר כדי לאפשר לשעווה הכלואה לצוף למעלה. לאחר מכן, חזור על שלב החימום במיקרוגל. הוצא את הכוס מהמיקרוגל והמתן עד שתתקרר.

הנחת הכלי בחדר הקירור תאיץ את התהליך. ככל שהמים יתקררו, השעווה תצטבר על פני המים ותתמצק בהדרגה. הסיר את השעווה המומצקת באופן ידני.

פעולה זו אמורה להסיר את רוב השעווה מהמבחנות. העבירו את מבחנות הפעילות לכלי זכוכית חדש עם מי ברז טריים וחזרו על תהליך החימום במיקרוגל והסרת השעווה. מכיוון שרוב השעווה הוסרה בשלב הקודם, אין צורך להמתין להתגבשות השעווה.

שפכו פשוט את המים מהכלי והעבירו את המבחנות לכלי חדש. יש לנקוט בזהירות מכיוון שהמים עדיין חמים. חזרו על תהליך החימום במיקרוגל בפעם האחרונה.

שפכו את המים מהביקר והמתינו עד ששפורי הפעילות יתקררו. לאחר מכן, העמידו את שפורי הפעילות בצורה אנכית בתוך ביקרים מזכוכית בנפח 250 milliliter או 500 milliliter. ודאו שהם אינם דחוסים מדי.

עקרו אותם באמצעות אוטוקלאב במחזור ייבוש, או פשוט ייבשו את המבחנות בתנור ייבוש כדי להכין את המצע להטענה לתוך מבחנות הפעילות. הכינו תמיסה של 5% sucrose ו-2% bact to agar במים מזוקקים או במי ברז, ועקרו את התמיסה באוטוקלאב. ניתן להשתמש במצע לאחר העיקור באופן מיידי או לאחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך תקופה ממושכת.

באופן אידיאלי, המזון למילוי מבחנות הפעילות צריך להיות בטמפרטורה של כ-65 degrees Celsius. השתמשו בפיפט של 10 milliliter כדי להעביר את תמיסת המזון הנוזלית לאורך הדופן הפנימית של כוס הביקר, ומלאו את המבחנות עד שהן מלאות בשליש מגובהן מהבסיס למעלה. נערנו את הביקר בעדינות בתנועות סיבוביות כדי לוודא שכל המבחנות מלאות באופן אחיד בתמיסת המזון.

המתינו עד שהמזון יתמצק לחלוטין, בטמפרטורת החדר או ב-4 °C. לאחר שהעיבוי בתוך מבחנות הזכוכית ייעלם, ניתן להוציא את המבחנות מהכלי. כדי להוציא את מבחנות הפעילות מהכלי, דחפו את המבחנות לכיוון תחתית הכלי וסובבו אותן בו-זמנית, כך שהמזון שהתמצק בתוך המבחנות יופרד מתחתית הכלי.

הוצא את המבחנות מהביקר, רצוי כקומה אחת. לאחר מכן, נקה את המבחנות אחת אחת בעזרת נייר סופג כדי להסיר שאריות מזון עודפות מהמשטח החיצוני של המבחנות. הנח את המבחנות בצד בתוך מכל נקי.

קחו מחמם בלוקים מעבדתי כללי ללא מחזיק המבחנות וכסו בזהירות את באר החימום. בעזרת מספר שכבות של נייר אלומיניום חזק, הוסיפו גרגרי פראפין לבאר החימום המרופדת באלומיניום להמסה, אחזו במבחנות מהקצה שאינו במגע עם המזון וטבלו את קצה המזון בשעווה המומסת. טבלו את חלק השעווה בכלי ביקר מזכוכית מלא במים קרים כדי להאיץ את התגבשות השעווה. חזרו על הפעולה.

טבילה חד-פעמית של צינורות השעווה במים תמנע מהם להידבק זה לזה. ניתן להשתמש בצינורות באופן מיידי או לאחסנם במיכל אטום בארבע מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. אחסון ממושך מעבר לשבוע יוביל לייבוש יתר של המזון.

אם המבחנות מאוחסנות בטמפרטורה של 4 °C, יש לחמם אותן לטמפרטורת החדר על ידי השארתן על משטח העבודה לפני השימוש. לפני העמסת הזבובים למבחנות הפעילות, הפעילו את האינקובטורים שבהם ימוקמו מסכי הניטור של הפעילות. כווננו את הטמפרטורה באמצעות בקרים של האינקובטור והגדירו את משטר האור והחושך באמצעות בקר התאורה של מערכת ה-DAM או באמצעות מערכת בקרת התאורה של האינקובטור, בהתאם לתכנון הניסוי הרצוי.

בשלב הבא, הרדימו את הזבובים באמצעות פחמן דו-חמצני. לאחר מכן, באמצעות מברשת צבע עדינה, העבירו בעדינות זבוב בודד לתוך מבחנת פעילות. אחזו במרכזו של קטע חוט בודד באורך של כחצי אינץ' באמצעות פינצטה עדינה, והכניסו את החוט לקצה של מבחנת הפעילות שאינו מכיל מזון כדי לסגור את הפתח ולמנוע מהזבוב לברוח במהלך הניסוי.

תוך מתן אפשרות למעבר אוויר לתוך המבחנה, השאירו את המבחנה מונחת על צדה עד שהזבוב יתעורר. כדי למנוע מהזבוב להידבק למזון, הכניסו את המבחנות לתוך מסכי הפעילות. בדגם החדש והקומפקטי יותר של מסכי Tri Kinetics, יש לקבע את המבחנות באמצעות גומיות כדי להבטיח שקרן האינפרא-אדום תעבור במרכז המבחנה. לבסוף, הניחו את מסכי הפעילות בתוך האינקובטורים וחברו אותם למערכת איסוף הנתונים באמצעות כבלי הטלפון, ובדקו את החיבור.

השתמש בתוכנת האיסוף של מערכת ה-DAM כדי לוודא שכל הצגים מחוברים כראוי וכי נתונים נאספים מכל אחד מהם. כעת, לאחר שהזבובים הוכנסו לצינורות הפעילות ומערכת ניטור הפעילות הלוקומוטורית מוכנה, ניתן להקליט את הנתונים. הזבובים מסונכרנים ומותאמים (entrained) על ידי חשיפתם למשטר האור, החושך או ה-LD והטמפרטורה הרצויים במשך יומיים עד חמישה ימים מלאים.

תנאי הסנכרון הנפוצים ביותר הם מחזור אור-חושך של 12 שעות אור ו-12 שעות חושך בטמפרטורה של 25 °C. לצורך חקר מקצבים צירקדיים ביחס לפרוטוקול זה, הזמן שבו הדולקים האורות באינקובטור מוגדר כ-ZT 0, וכל שאר הזמנים נמדדים ביחס לערך זה. תחת תנאי LD סטנדרטיים של 12:12, זבובים מסוג *Drosophila melanogaster* מראים בדרך כלל שני פרקי פעילות: אחד המתרכז סביב ZT 0 המכונה שיא הבוקר, ואחר סביב ZT 12 המכונה שיא הערב. מקצבי פעילות לוקומוטורית בריצה חופשית נמדדים תחת תנאי חושך וטמפרטורה קבועים לאחר תקופת הסנכרון.

ניתן לשנות את הגדרת מחזור התאורה בכל עת במהלך שלב החשיכה ביום האחרון של ld, כך שהיום הבא של הניסוי ייחשב כיום הראשון של dd. איסוף נתונים במשך שבעה ימים של DD מספיק כדי לחשב את המחזוריות הצירקדית ואת האמפליטודה או את עוצמת המקצב של הזבובים. באופן כללי, גודל מדגם של לפחות 16 זבובים נחוץ כדי לקבל תקופות ריצה חופשית (free running periods) מהימנות עבור גנוטיפ מסוים.

בסיום הניסוי, נתונים בינאריים גולמיים שנאספו באמצעות תוכנת מערכת ה-DAM יורדים למכשיר אחסון נתונים נייד, כגון התקן USB. הנתונים הבינאריים הגולמיים מעובדים באמצעות DAM file scan 1 0 2 x ומסוכמים למקצבים של 15 ו-30 דקות בעת ניתוח פרמטרים צירקדיים, או למקצבים של דקה אחת עד חמש דקות בעת ניתוח שינה.

פרמטרי מנוחה. נכון להיום, חמש דקות רצופות של חוסר פעילות הן ההגדרה הסטנדרטית של מנוחת שינה ב-drosophila. עם השלמת פרוטוקול זה, ניתן להשתמש באותה מערכת נתונים כדי להשוות בין הפרמטרים הצירקדיים ופרמטרי השינה של בעלי החיים בניסוי ובביקורת עבור הפרמטרים הצירקדיים.

ניתן להפיק גרפי השראה הממחישים פעילות לוקומוטורית יומית או פעילות ממוצעת של זבובים לאורך מספר ימים בתנאי LD או DD באמצעות fast x oph melanogaster. באופן כללי, זבובים מראים שני פרקי פעילות, אחד המתרכז סביב ZT zero המכונה שיא הבוקר, ואחר סביב ZT 12 המכונה שיא הערב. שני פרקי פעילות אלו נשלטים על ידי השעון האנדוגני וניתן להבחין בהם גם בתנאי DD של ריצה חופשית. ניתן להבחין בקלות בשינויים בעיתוי של שיאי פעילות אלו בגרפי השראה, ואלו עשויים להעיד על שינוי בתכונות השעון האנדוגני.

תכונה נוספת המעידה על תפקוד תקין של השעון הביולוגי היא העלייה הצפויה בפעילות המוטורית הנצפית במחזורי LD, המתרחשת לפני המעברים בפועל מחשיכה לאור או מאור לחשיכה. התנהגות זו נצפית בבירור בזבובים מסוג בר (wild type), אך היא חסרה ואריתמית במוטנטים מסוג per zero. במוטנט זה.

השיאים שנצפו בבוקר ובערב בתנאי LD הם תגובות בהלה גרידא עקב שינויים פתאומיים בתנאי האור והחושך. זבובים חסרי שעון ביולוגי אינם מצפים לשינויים סביבתיים אלא פשוט מגיבים אליהם. אובדן המקצב ההתנהגותי בולט הרבה יותר בתנאי DD ובדרך כלל בא לידי ביטוי באובדן מוחלט של שיאי הפעילות הלוקומוטורית של הבוקר או הערב, כפי שנראה בזבובים מסוג per zero.

בנוסף לגרפי השראה, ניתן לייצג נתוני פעילות מוטורית כגרף כפול עבור כל זבוב בודד או גנוטיפ של זבוב, שבו נתונים של יומיים מוצגים ברצף על כל שורה, כאשר הפרופיל של היום האחרון פותח את השורה הבאה של יומיים של פעילות. לדוגמה, LD 1 ו-LD 2 מוצגים בשורה הראשונה של גרף ה-ACTO. השורה הבאה מתחילה בחזרה על LD 2, ואחריה מופיעים LD 3 וכן הלאה.

בהתאם לפורמט זה, נתוני הפעילות המוטורית לאורך כל הניסוי מוצגים ב-ACTO gram; יתרון אחד של ACTO grams על פני גרפים של רדוקציה הוא ששינוי באורך המחזור של מקצבי הפעילות היומיים ניתן להבחנה בקלות, בנוסף ליצירת גרפי אינדוקציה ו-ACTO grams.

ניתן להזין נתוני פעילות לוקומטורית מתנאי ה-DD לתוכנת far X כדי לחשב את אורך המחזור באמצעות מספר תוכניות שונות, כולל cycle P לניתוח פרמטרי שינה ומנוחה, אשר מוגדרים כחמש דקות רצופות של חוסר פעילות. ניתן לנתח נתונים שהוקלטו מבדיקות פעילות לוקומטורית ולבחון פרמטרי שינה מרובים באמצעות insomniac, תוכנה המבוססת על MATLAB; ניתן לחשב את אחוז הזמן שהזבובים מבלים בשינה במרווחי זמן שונים. לדוגמה, אחוז השינה בכל שעה או בכל 12 שעות.

פרמטרי שינה נפוצים יותר שניתן לבחון כוללים את אורך פרק המנוחה הממוצע, המהווה מדד למידת קונסולידציית השינה ויכול להמחיש את איכות השינה. מדד נוסף הוא ספירת פעילות בזמן ערנות, המהווה מדד לקצב הפעילות כאשר הזבובים ערים. פרמטר זה מסייע להבחין בין זבובים שמושפעים באמת בשינה ובהתנהגויות מנוחה, לבין זבובים שחולים או היפראקטיביים.

לדוגמה, זבובים שפשוט חולים עשויים להיראות כמי שישנים יותר כיוון שהם אינם ניידים באותה מידה. עבור זבובים אלו, פעילות הערנות שלהם תהיה נמוכה יותר ביחס לבעלי הבקרה. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה כיצד לאפיין פנוטיפים של שינה ומקצבים צירקדיים ב-drosophila באמצעות בדיקה. מקצבים יומיים של פעילות לוקומטורית.