הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

בנוהל זה נעשה שימוש בדימות עלים להערכת תנועת תאי השמור (guard cells) בתגובה לתאי חיידקים חיים. ראשית, החיידקים מורבים ממאגר גליצרין ומוכן תמיסת הדבקה (inoculum). לאחר מכן, נאספים עלים צעירים ובריאים והם נצבעים ב-propidium iodide.

העלים הצבועים נגזרים וחתיכות העלה מדגירות מעל תרחיף חיידקים. לבסוף, פני העלה נבחנו תחת המיקרוסקופ וניתן למדוד את פתחי השפירתיים. התוצאות שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראות שינויים בפתח השפירתיים בתגובה לחיידקים.

היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בקילופים של האפידרמיס, הוא שהעלה שנמצא במגע עם החיידקים הוא שלם, מה שמדמה את התנאים הטבעיים לחדירה חיידקית לתוך העלים. כדי להתחיל בהליך זה, זרעו זרעי Arabidopsis בתערובת של 1:1:1 של מצע גידול, ורמיקוליט ופרלייט. גדלו את הצמחים בתא גידול והשקו לפי הצורך.

הצמחים יהיו מוכנים לשימוש בעוד ארבעה עד שישה שבועות, כאשר יהיו להם עלים צעירים ופרושים באופן מלא לפני תחילת הפריחה (bolting). יומיים לפני תחילת הניסוי, הכינו מזרע של תרבית החיידקים. בודדו את ה-Pseudomonas ringe ממלאי גליצריל על מצע LB משופר, ודגרו למשך 24 שעות בטמפרטורה של 28 degrees Celsius.

השתמשו בתרבית טרייה להכנת האינוקולום ותמיד התחילו את צלחות התרבית ממלקחי גליצרין (glycerol stocks). מכיוון שהחיידקים הופכים לפחות וירולנטיים לאחר תרביות משניות, השתמשו בחיידקים שגדלו על הצלחת כדי להתחיל תרבית נוזלית של 10 מיליליטר של pseudomona singe. בבקתלת ארלנמאייר של 50 מיליליטר, דגרו את התרבית למשך לילה בטמפרטורה של 28 °C עם ניעור חזק עד שהיא תגיע לצפיפות אופטית (OD) ב-600 ננומטר בין 0.8 ל-1.

מדדו את ה-OD ב-600 ואספו את התאים באמצעות צנטריפוגציה ב-1,360 ×g למשך 10 דקות. השעו את התאים במים מזוקקים כך שה-OD הסופי יהיה 0.2. ערך OD זה תואם ל-10⁸ יחידות יוצרי מושבות (colony forming units) למילליליטר.

לאחר שהחיידקים מוכנים, יש להמשיך בהכנת העלים ובביצוע הבדיקה לצורך צביעתם. ראשית, הכינו תמיסת propidium iodide (PI) בריכוז 20 µM במים. 10 mL של תמיסה יספיקו לצביעת שלושה עלים קטנים בכל פעם.

הוציאו את הצמחים מתא הגידול, ובעזרת פינצטה, התאירו שלושה עלים צעירים שפיתחו פריסה מלאה. טבלו את העלים השלמים בתמיסת ה-PI למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוציאו את העלים ושטפו אותם קלות במים מזוקקים.

בשלב הבא, הניחו על זכוכית מיקרוסקופ עלה כאשר הצד התחתון פונה כלפי מטה. חתכו את העלה באמצעות להב תער חד לארבעה חלקים, תוך השמטת העורק המרכזי, כדי שהעלה יונח בצורה שטוחה על הזכוכית לצורך הדגרה של החיידקים עם העלים. הוסיפו 300 µL של תרחיף חיידקים מתחת לחלקי העלה שעל הזכוכית, וודאו שהצד התחתון של העלה נמצא במגע עם האינוקולום.

דגרו את הדגימות תחת אותם תנאים סביבתיים ששימשו להצמחת הצמחים. כאשר מגיע זמן התצפית על העלים תחת המיקרוסקופ, העבירו את חתיכות העלה לסרטית חדשה כאשר הצד התחתון פונה כלפי מעלה. שימו לב כי אין להשתמש בכיסוי זכוכית בעת הרכבת הסריטות.

ניתן לצלם את אותה דגימת עלה מספר פעמים במהלך הדגירה, וניתן להגדיר סדרת מדידות לאורך זמן בהתאם למטרות המחקר. כאן, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר לבדיקת העלים, צפייה במשטח התחתון של העלים לזיהוי הפלואורסצנציה של PI תוך שימוש באותן דגימות עלה, ולכידת תמונות של הפהים לאורך זמן. שמרו את התמונות לצורך מדידת רוחב מפתח הפה.

מדדו את רוחב מפתח הפיונית של לפחות 60 פיוניות עבור כל טיפול ובכל נקודת זמן. באמצעות דפדפן התמונות של LSM, חשבו את הממוצע ואת השגיאה התקנית של רוחב מפתח הפיונית. ניתן לחשב את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות באמצעות מבחן t של Student מזווג דו-זנבי (two-tailed paired wise students).

T-test כאן היא תמונה מיקרוסקופית טיפית של פני עלה של arabidopsis תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר. בתצוגת שדה בהיר, propidium iodide צובע את דופן התא של תאים חיוניים, מה שמגביר את הנראות של תאי השמירה ובנוסף מאפשר זיהוי של תאים שאינם פגומים. ניתן לראות במיקרוגרמות הללו מגוון של פתיחות stomatal PO, החל מסימטומים סגורים לחלוטין ועד לסימטומים פתוחים לרווחה.

סטומות סגורות לחלוטין מזוהות לפי צורתן של תאי השמירה. רוחב הפתח נחשב לאפס מיקרומטר עבור סטומות פתוחות. רוחב הפתח המוצג נמדד באמצעות קו ישר הנמתח על פני השטח הרחב ביותר של נקבובי הסטומה.

אלו הן תוצאות ניסוי טיפוסיות של בדיקת הדבקת עלים חיים. עלים של Arabidopsis דגרו בחשכה עם שלושה זנים שונים של pseudomonas Cy Ringe, כאשר רק החיידק P-S-T-D-C 3000 היה מסוגל לפתוח סתומיים (stomata) בחושך, כפי שנמדד לפי רוחב המפתח של 60 סתומיים שנבחרו באופן אקראי לכל זן חיידקים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האינטראקציות המתוכננות של חיידקים לחקור את מנגנוני התגובה המוקדמת לפתוגנים במיני צמחים.