הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

בפרוצדורה זו נעשה שימוש בדימוי עלים להערכת תנועת תאי שמירה בתגובה לתאי חיידקים חיים. ראשית, החיידקים מורבים מתוך מאגר גליצרין ומוכן תמיסת接ing (inoculum). לאחר מכן, נאספים עלים צעירים ובריאים והם נצבעים ב-propidium iodide.

העלים הצבועים נגזרים וחלקי העלה מדגריים על פני תרחיף חיידקי. לבסוף, פני העלה נבחנים תחת המיקרוסקופ וניתן למדוד את פתחי הסטומטות. התוצאות שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראות שינויים בפתח הסטומטות בתגובה לחיידקים.

היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בקליפות אפידרמיס, הוא שהעלה הבא במגע עם החיידקים נשאר שלם, דבר המדמה את התנאים הטבעיים לחדירה חיידקית לעלים. כדי להתחיל בהליך זה, זרעו זרעי Arabidopsis על תערובת של 1:1:1 של מצע גידול, ורמיקוליט ופרלייט. גדלו את הצמחים בתא גידול והשקו אותם לפי הצורך.

הצמחים יהיו מוכנים לשימוש בעוד ארבעה עד שישה שבועות, כאשר יהיו להם עלים צעירים ופרושים במלואם לפני שלב התיתור. יומיים לפני תחילת הניסוי, יש להכין מריחה של תרבית החיידקים. יש לבצע מריחה של Pseudomonas ringe ממאגר גליצרול על מצע LB משופר, ולהדגיר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 28 °C.

השתמשו בתרבית טרייה להכנת האינוקולום ותמיד התחילו את פלטות התרביות ממלאי גליצרין. מכיוון שחיידקים הופכים לפחות וירולנטיים לאחר תרביות משנה, השתמשו בחיידקים שגדלו על הפלטה כדי להתחיל תרבית נוזלית של 10 milliliter של pseudomona singe. בבקת Erlenmeyer של 50 milliliter דגרו את התרבית למשך לילה ב-28 degrees Celsius עם ניעור חזק עד שהיא תגיע לצפיפות אופטית או OD ב-600 nanometers שבין 0.8 ל-1.

מדדו את ה-OD ב-600 ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה ב-1,360 ×g למשך 10 דקות. השעיקו את התאים במים מזוקקים כך שה-OD הסופי יהיה 0.2. ערך OD זה תואם ל-10⁸ יחידות יוצרות מושבות (CFU) למילליליטר.

כאשר החיידקים מוכנים, המשיכו להכין את העלים ולבצע את הבדיקה לצורך צביעת העלים. ראשית, הכינו תמיסת propidium iodide, או PI, בריכוז 20 µM במים. 10 mL של תמיסה מספיקים לצביעת שלושה עלים קטנים בכל פעם.

הוציאו את הצמחים מתא הגידול ובעזרת פינצטה, התירעו שלושה עלים צעירים שהתרחבו במלואם. טבלו את העלים השלמים בתמיסת ה-PI למשך חמש דקות. לאחר מכן הוציאו את העלים ושטפו אותם קצרות במים מזוקקים.

בשלב הבא, הניחו על זכוכית כיסוי עלה כאשר הצד התחתון פונה כלפי מטה. חתכו את העלה בעזרת להב תער חדה לארבעה חלקים, תוך השמטת העורק המרכזי, כדי שהעלה יונח בצורה שטוחה על זכוכית הכיסוי לצורך אינקובציה של החיידקים עם העלים. הוסיפו 300 µL של תרחיף חיידקים תחת חלקי העלה על זכוכית הכיסוי, וודאו שהצד התחתון של העלה נמצא במגע עם האינוקולום.

דגרו את הדגימות תחת אותם תנאים סביבתיים ששימשו לגידול הצמחים. כאשר מגיע הזמן לתצפית על העלים תחת המיקרוסקופ, העבירו את חלקי העלה לזכוכית כיסוי חדשה כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה. שימו לב כי אין להשתמש בזכוכית כיסוי בעת הרכבת הדגימות על הזכוכית.

ניתן לדגום את אותו דגימת עלה למספר הדמיות במהלך הדגירה, וניתן לקבוע סדרת זמן בהתאם למטרות המחקר. במקרה זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר לבחינת העלים, צפייה במשטח התחתון של העלים לזיהוי הפלואורסצנציה של PI תוך שימוש באותן דגימות עלה, ולכידת תמונות של הסטומות לאורך זמן. שמרו את התמונות לצורך מדידת רוחב מפתח הסטומה.

מדדו את רוחב מפתח הפיונית של לפחות 60 פיוניות עבור כל טיפול בכל נקודת זמן. באמצעות דפדפן התמונות של LSM, חשבו את הממוצע ואת השגיאה התקנית עבור רוחב מפתח הפיונית. ניתן לחשב את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות באמצעות מבחן t של Student למדגמים מזווגים דו-זנבי (two-tailed paired wise students).

T-test כאן היא תמונה מיקרוסקופית טיפוסית של פני עלה של arabidopsis תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר. בתצוגת שדה בהיר, propidium iodide צובע את דופן התא של תאים חיוניים, ובכך מגביר את הנראות של תאי השמירה ובנוסף מאפשר זיהוי של תאים שאינם פגועים. ניתן לראות במיקרוגרפים אלו טווח של פתיחות פתחים סטומטליים PO, החל מפתחים סגורים לחלוטין ועד פתחים פתוחים לרווחה.

פתחים (stoma) סגורים לחלוטין מזוהים על פי צורת תאי השמירה. רוחב הפתח נחשב לאפס מיקרומטר עבור פתחים סגורים. רוחב הפתח המוצג נמדד באמצעות קו ישר שנמתח לרוחב האזור הרחב ביותר של נקבוביות הפתח.

אלו הן תוצאות ניסוי טיפוסיות של בדיקת החדרת פתוגנים לעלה חי. עלי Arabidopsis דגרו בחושך עם שלושה זנים שונים של pseudomonas Cy Ringe, ורק החיידק P-S-T-D-C 3000 היה מסוגל לפתוח סטומות בחושך, כפי שנמדד על ידי רוחב הפתח של 60 סטומות שנבחרו באופן אקראי לכל זן חיידקים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום של אינטראקציות מתוכננות בין חיידקים לחקר מנגנוני התגובה המוקדמת לפתוגנים במיני צמחים.