Name: הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למדו להעריך תגובות פיוניות לחיות חיידקיים באמצעות הדמיית עלים שלמים. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת של תנועת תאי שמירה תוך מזעור פגיעה ברקמה, ומסייעת בחקר אינטראקציות צמח-מיקרואורגניזם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק מטעם המכון הלאומי לבריאות של אוניברסיטת טקסס בארלינגטון להקים קרנות MM.

1. צמחים וחיידקים הכנת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל בהליך זה לזרוע זרעים ארבידופסיס על v 01:01:01: v: v תערובת של גידול בינוני (Redi הארץ תקע ומערבבים שתיל, סאן Gro), vermiculite בסדר, perlite. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את הצמחים בתא הגידול (22 ° C, 12 שעות של אור μmol / mm 2 / sec 100 יום ו 65 ± 5% לחות) ומים לפי הצורך. הצמחים מוכנים לשימוש בתוך 4-6 שבועות, כאשר יש להם עלים צעירים הרחיב באופן מלא לקראת נעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני תחילת הניסוי להכין את התרבות החיידק. Streak Pseudomonas syringae ממלאי גליצרול על מדיום LB שונה (10 g / L tryptone, 5 g / L תמצית שמרים, 5 g / L NaCl pH 7.0, ו - אגר 1.5%) ו דגירה של 24 שעות 28 ° C. השתמש תרבות טרי להכין את inoculum ותמיד להתחיל צלחות תרבות ממניות גליצרול כמו חיידקים הופכים אלימים פחות משנה לאחר culturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חיידקים שגדלו על הצלחת להתחיל תרבות של 10 מ"ל נוזל פ syringae בתוך בקבוקון 50 מ"ל Erlenmeyer. דגירה התרבות לילה בשעה 28 ° C עם נמרצת רועד עד שהוא מגיע או צפיפות אופטית OD ב 600 ננומטר בין 0.8 ו 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD ב 600 ו לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה XG ב 1360 במשך 10 דקות. Resuspend התאים במים מזוקקים כך OD 0.2 הסופי. OD זו תואמת את 10 8 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / mL. עם חיידקים מוכן להמשיך להכין את העלים לבצע את assay. </li></ol> 2. ליף מכתים ו דגירה עם חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת כתם עלים הראשון להכין 20 מיקרומטר propidium יודיד או פתרון לצרכן במים. 10 מ"ל של תמיסת מספיק כתם 3 עלים קטנים בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את הצמחים מן החדר צמיחה עם מלקחיים לנתק 3 צעיר, מלא מורחבת עלים. לטבול את העלים שלמים פתרון לצרכן במשך 5 דקות. ואז להסיר את העלים ולשטוף אותם בקצרה עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום הבא עלה עם המשטח התחתון פונה כלפי מטה על שקופיות מיקרוסקופ. חותכים את העלים בסכין גילוח חד לארבעה חלקים למעט וריד באמצע כך העלה מניח שטוח בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לדגור את החיידקים עם העלים, להוסיף 300 μL ההשעיה חיידקי תחת חתיכות עלה בשקופית. וודא כי פני השטח התחתון של העלה נמצא בקשר עם inoculum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הדגימות בתנאים סביבתיים אותו ששימשו לגידול צמחים. באותו זמן להתבונן עלים מתחת למיקרוסקופ, להעביר את פיסות עלים לשקופית חדשה עם המשטח התחתון פונה כלפי מעלה. שים לב לא להחליק לכסות משמש כאשר גובר על השקופיות. המדגם העלה אותו ניתן הדמיה מספר פעמים במהלך הדגירה וקורס זמן ניתן להגדיר על פי מטרות המחקר. </li></ol> 3. , מיקרוסקופית מדידה ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal (Meta LSM 510, Carl Zeiss Inc) משמש כדי לבחון את העלים. שים את פני השטח התחתון של העלים כדי לזהות את הקרינה של PI (עירור 453 ננומטר, פליטת 543 ו - 620 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגימות עלים אותו לצלם תמונות של הפיוניות לאורך זמן. שמור את התמונות למדידת רוחב הפתח הפיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת רוחב הצמצם הפיוניות של הפיוניות לפחות 60 עבור כל טיפול בכל נקודת זמן באמצעות תמונה דפדפן LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את השגיאה הממוצעת ורמת עבור רוחב הצמצם הפיוניות. משמעות סטטיסטיים של התוצאות יכול להיות מחושב באמצעות 2 זנב, סטודנט חכם לזווג של t-test. </li></ol> 4. תמונות נציג תגובת הפיוניות כדי דגירה עם חיידקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה תמונה מיקרוסקופיים טיפוסיים (באמצעות המטרה 20x) של פני השטח עלה ארבידופסיס תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal בתצוגה בשדה בהיר (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Propidium כתמים יודיד את דופן התא של תאים קיימא להגדיל את הנראות של התאים השומר בנוסף המאפשר זיהוי של תאים פגומים לאיסוף נתונים (איור 2). מגוון של פתחי הנקבוביות הפיוניות ניתן לראות micrographs אלה, מן הפיוניות סגורות לחלוטין הפיוניות לרווחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפיוניות סגורות לגמרי מזוהים על ידי הצורה של התאים השומר (איור 3). רוחב הפתח נחשבת 0 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הפיוניות פתוחות (איור 4) רוחב הצמצם הראו נמדדת באמצעות קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלו הן תוצאות הניסוי אופייני assay זה הפיוניות. עלים Arabidopis הודגרו בחושך עם שלושה זנים שונים של Pseudomonas syringae. רק החיידק היה Pst DC3000 מסוגל לפתוח כהה הפיוניות סגורות, כפי שנמדד על ידי רוחב הצמצם של הפיוניות 60 שנבחרו באקראי לכל זן חיידקי (איור 5). </li><img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה של ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. שים לב הצמצם הפיוניות אינו ברור כאשר לעומת להציג את פלורסנט שנעזר מכתים יודיד propidium (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. מיקרוסקופ של פני השטח של עלה יודיד מוכתם propidium ארבידופסיס. אחת שדה הראייה של השטח עלה תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal (LSCM) באמצעות המטרה 20x. הערה מגוון של פתיחת הנקבוביות הפיוניות. החצים צהוב הצביע לחלוטין קרוב הפיוניות וחצים ירוקים הם הצביעו על הפיוניות לרווחה. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. לגמרי הפיוניות קרוב שזוהו על ידי צורת ופתיחת בין התאים השומר. רוחב הצמצם נחשב 0 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. הפיוניות פתח המציגה את רוחב הצמצם ב מיקרומטר. המדידות נלקחו באמצעות הדפדפן LSCM מבוסס על קו ישר נמשך על פני שטח רחב של הנקבובית הפיוניות. <img src="/files/ftp_upload/2185/2185fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. הצמצם הפיוניות של עלים ארבידופסיס מודגרות עם שלושה זנים של עגבניות Pseudomonas syringae pv:.. DC3118, DB29, ו DC3000 צמחים הוחזקו בחושך בזמן ניסויים. התוצאות מוצגות כממוצע (n = 50-70) ± שגיאת התקן. משמעות סטטיסטיים זוהה עם מבחן t-שני זנב של הסטודנטים. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים עם תוצאות דומות. </ol>

<ol><li>Brooks, D. M., Hernandez-Guzman, G., Kloek, A. P., Alarcon-Chaidez, F., Sreedharan, A., Rangaswamy, V., Penaloza-Vazquez, A., Bender, C. L., Kunkel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+well-defined+series+of+coronatine+biosynthetic+mutants+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a well-defined series of coronatine biosynthetic mutants of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 17, 162-174 (2004).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKatagiri%2C+F+%22The+Arabidopsis+Book%22">The Arabidopsis Book</a>. Somerville, C. R., Meyerowitz, E. M. , American Society of Plant Biologists. Rockville, MD. (2002).</li>
<li>Ma, S. W., Morris, V. L., Cuppels, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+DNA+region+required+for+production+of+the+phytotoxin+coronatine+by+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of a DNA region required for production of the phytotoxin coronatine by Pseudomonas syringae pv. tomato.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 4, 69-74 (1991).</li>
<li>Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stomata+function+in+innate+immunity+against+bacterial+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion.</a> Cell. 126, 969-980 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הצגנו הליך ישר קדימה כדי למדוד את הצמצם הפיוניות ברקמה עלה שלם המאפשר הערכה קלה של הפיוניות תגובה לטיפולים שונים. למרות הצגנו תוצאות השימוש במערכת מודל ארבידופסיס / Pseudomonas syringae, assay עלה שלם הפיוניות יכול להתבצע באופן פוטנציאלי עם שילוב צמחים חיידק כלשהו. הפרוטוקול יכול בקלות להיות שונה כדי להתאים לדרישות צמיחה של צמחים אחרים חיידקים פתוגנים. העיקרון הליך הכולל נשאר אותו הדבר. בנוסף, שיטה זו עשויה להועיל לחוקרים המבקשים ללמוד פלט התפקודית של התאים השומר לא רק לחיות חיידקים, אלא גם לגירויים אחרים בחומרים כימיים בתנאים לשמור על הסביבה הטבעית של העלה. עלים שלמים יכול להיות קשה בשל עובי תמונה שלה טופוגרפיה אחידה. בעיה זו ניתן להקל על ידי הסרת ורידים באמצע העלה כך שהוא מניח שטוח בשקופית באמצעות מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, סוגים אחרים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן להשתמש כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה של פני השטח עלה.

<table><tbody><tr><td>Propidium iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-1</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>Difco Laboratories</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>VWR international</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>Bio Express</td><td>J637-2500G</td><td></td></tr><tr><td>תא גידול לצמחים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור עם מנער</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

הפיוניות הם פתחים טבעיים האפידרמיס המפעל אחראי חילוף הגזים בין הצמח הפנים ואיכות הסביבה. הם נוצרו על ידי זוג של תאים השומר, אשר מסוגלים לסגור את הנקבוביות הפיוניות בתגובה למספר גורמים חיצוניים כולל עוצמת האור, ריכוז דו תחמוצת הפחמן, והלחות היחסית (RH). נקבוביות הפיוניות הוא גם הנתיב העיקרי לכניסה הפתוגן לתוך העלים, צעד חיוני להתפתחות המחלה. מחקרים שנעשו לאחרונה חשפה כי סגירת נקבוביות יעיל לצמצום התפתחות מחלה חיידקית בצמחים ארבידופסיס; חלק אינטגרלי של חסינות מולדת צמח. בעבר, השתמשנו קליפות אפידרמיס כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים (Melotto et al 2006.), אולם שמירה על תנאים סביבתיים נוחים עבור שתי קליפות צמח אפידרמיס ותאי חיידקים כבר מאתגר. האפידרמיס ליף יכולים להישמר חי ובריא עם MES חיץ (10 mM KCl, 25 מ&quot;מ MES-KOH, pH 6.15) עבור ניסויים של תאים אלקטרו השומר. עם זאת, החיץ הזה אינו מתאים לקבלת ההשעיה חיידקי. מצד שני, תאים חיידקיים יכולים להישמר חי במים וזה לא תקין כדי לשמור על קליפות אפידרמיס לתקופה ארוכה של פעמים. כאשר צף על פני המים לקלף אפידרמיס, התאים לקלף, כי הם חשופים אוויר יבש בתוך 4 שעות להגביל את העיתוי לבצע את הניסוי. השיטה האידיאלית להעריך את ההשפעה של גירוי מסוים על תאים השומר צריך להציג התערבות מינימלית הפיזיולוגיה הפיוניות ועל הסביבה הטבעית של הצמח כמה שיותר. אנו, אפוא, פיתחו שיטה חדשה כדי להעריך את התגובה הפיוניות לחיות חיידקים אשר ופצע עלה מניפולציה ממוזער באופן משמעותי במטרה לספק assay הפיוניות לשחזור בקלות ואמין. פרוטוקול מבוסס על מכתים עלה שלם עם יודיד propidium (PI), הדגירה של מכתים עלה עם ההשעיה חיידקי, והתבוננות עלים תחת סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal. לבסוף, שיטה זו מאפשרת תצפית המדגם העלה אותו לחיות על פרקי זמן ארוכים באמצעות תנאים מקרוב לחקות את התנאים הטבעיים שבהם צמחים מותקפים על ידי פתוגנים.

פיתחנו פרוטוקול פשוט לגשת לשחזור בתגובה הפיוניות לחיידקים לחיות. שיטה זו מקטינה ופצע ומניפולציה של העלה, לעומת השימוש קליפות אפידרמיס שדווח קודם לכן.

פתחים מסוג פיוניות (Stomata) הם פתחים טבעיים באפידרמיס של הצמח האחראים על חילוף גזים בין פנים הצמח לסביבה. הם נוצרים על ידי זוג...

בפרוצדורה זו נעשה שימוש בדימוי עלים להערכת תנועת תאי שמירה בתגובה לתאי חיידקים חיים. ראשית, החיידקים מורבים מתוך מאגר גליצרין ומוכן תמיסת接ing (inoculum). לאחר מכן, נאספים עלים צעירים ובריאים והם נצבעים ב-propidium iodide.העלים הצבועים נגזרים וחלקי העלה מדגריים על פני תרחיף חיידקי. לבסוף, פני העלה נבחנים תחת המיקרוסקופ וניתן למדוד את פתחי הסטומטות. התוצאות שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראות שינויים בפתח הסטומטות בתגובה לחיידקים.היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון שימוש בקליפות אפידרמיס, הוא שהעלה הבא במגע עם החיידקים נשאר שלם, דבר המדמה את התנאים הטבעיים לחדירה חיידקית לעלים. כדי להתחיל בהליך זה, זרעו זרעי Arabidopsis על תערובת של 1:1:1 של מצע גידול, ורמיקוליט ופרלייט. גדלו את הצמחים בתא גידול והשקו אותם לפי הצורך.הצמחים יהיו מוכנים לשימוש בעוד ארבעה עד שישה שבועות, כאשר יהיו להם עלים צעירים ופרושים במלואם לפני שלב התיתור. יומיים לפני תחילת הניסוי, יש להכין מריחה של תרבית החיידקים. יש לבצע מריחה של Pseudomonas ringe ממאגר גליצרול על מצע LB משופר, ולהדגיר למשך 24 שעות בטמפרטורה של 28 °C.השתמשו בתרבית טרייה להכנת האינוקולום ותמיד התחילו את פלטות התרביות ממלאי גליצרין. מכיוון שחיידקים הופכים לפחות וירולנטיים לאחר תרביות משנה, השתמשו בחיידקים שגדלו על הפלטה כדי להתחיל תרבית נוזלית של 10 milliliter של pseudomona singe. בבקת Erlenmeyer של 50 milliliter דגרו את התרבית למשך לילה ב-28 degrees Celsius עם ניעור חזק עד שהיא תגיע לצפיפות אופטית או OD ב-600 nanometers שבין 0.8 ל-1.מדדו את ה-OD ב-600 ואספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה ב-1,360 ×g למשך 10 דקות. השעיקו את התאים במים מזוקקים כך שה-OD הסופי יהיה 0.2. ערך OD זה תואם ל-10⁸ יחידות יוצרות מושבות (CFU) למילליליטר.כאשר החיידקים מוכנים, המשיכו להכין את העלים ולבצע את הבדיקה לצורך צביעת העלים. ראשית, הכינו תמיסת propidium iodide, או PI, בריכוז 20 µM במים. 10 mL של תמיסה מספיקים לצביעת שלושה עלים קטנים בכל פעם.הוציאו את הצמחים מתא הגידול ובעזרת פינצטה, התירעו שלושה עלים צעירים שהתרחבו במלואם. טבלו את העלים השלמים בתמיסת ה-PI למשך חמש דקות. לאחר מכן הוציאו את העלים ושטפו אותם קצרות במים מזוקקים.בשלב הבא, הניחו על זכוכית כיסוי עלה כאשר הצד התחתון פונה כלפי מטה. חתכו את העלה בעזרת להב תער חדה לארבעה חלקים, תוך השמטת העורק המרכזי, כדי שהעלה יונח בצורה שטוחה על זכוכית הכיסוי לצורך אינקובציה של החיידקים עם העלים. הוסיפו 300 µL של תרחיף חיידקים תחת חלקי העלה על זכוכית הכיסוי, וודאו שהצד התחתון של העלה נמצא במגע עם האינוקולום.דגרו את הדגימות תחת אותם תנאים סביבתיים ששימשו לגידול הצמחים. כאשר מגיע הזמן לתצפית על העלים תחת המיקרוסקופ, העבירו את חלקי העלה לזכוכית כיסוי חדשה כך שהצד התחתון פונה כלפי מעלה. שימו לב כי אין להשתמש בזכוכית כיסוי בעת הרכבת הדגימות על הזכוכית.ניתן לדגום את אותו דגימת עלה למספר הדמיות במהלך הדגירה, וניתן לקבוע סדרת זמן בהתאם למטרות המחקר. במקרה זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר לבחינת העלים, צפייה במשטח התחתון של העלים לזיהוי הפלואורסצנציה של PI תוך שימוש באותן דגימות עלה, ולכידת תמונות של הסטומות לאורך זמן. שמרו את התמונות לצורך מדידת רוחב מפתח הסטומה.מדדו את רוחב מפתח הפיונית של לפחות 60 פיוניות עבור כל טיפול בכל נקודת זמן. באמצעות דפדפן התמונות של LSM, חשבו את הממוצע ואת השגיאה התקנית עבור רוחב מפתח הפיונית. ניתן לחשב את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות באמצעות מבחן t של Student למדגמים מזווגים דו-זנבי (two-tailed paired wise students).T-test כאן היא תמונה מיקרוסקופית טיפוסית של פני עלה של arabidopsis תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר. בתצוגת שדה בהיר, propidium iodide צובע את דופן התא של תאים חיוניים, ובכך מגביר את הנראות של תאי השמירה ובנוסף מאפשר זיהוי של תאים שאינם פגועים. ניתן לראות במיקרוגרפים אלו טווח של פתיחות פתחים סטומטליים PO, החל מפתחים סגורים לחלוטין ועד פתחים פתוחים לרווחה.פתחים (stoma) סגורים לחלוטין מזוהים על פי צורת תאי השמירה. רוחב הפתח נחשב לאפס מיקרומטר עבור פתחים סגורים. רוחב הפתח המוצג נמדד באמצעות קו ישר שנמתח לרוחב האזור הרחב ביותר של נקבוביות הפתח.אלו הן תוצאות ניסוי טיפוסיות של בדיקת החדרת פתוגנים לעלה חי. עלי Arabidopsis דגרו בחושך עם שלושה זנים שונים של pseudomonas Cy Ringe, ורק החיידק P-S-T-D-C 3000 היה מסוגל לפתוח סטומות בחושך, כפי שנמדד על ידי רוחב הפתח של 60 סטומות שנבחרו באופן אקראי לכל זן חיידקים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום של אינטראקציות מתוכננות בין חיידקים לחקר מנגנוני התגובה המוקדמת לפתוגנים במיני צמחים.

assessing-stomatal-response-to-live-bacterial-cells-using-whole-leaf

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק...

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

מקור: Lee, H. et al., מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוקה מפוצלת להדמיית אפקטורים המועברים מחיידקים במהלך זיהום. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטה לניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי צמחים באמצעות השלמת חלבון פלואורסצנטי ירוק מפוצל (sfGFP) בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגישה מאפשרת הדמיה מדויקת של טרנסלוקציה של אפקטור לציטוזול התא המארח.

ניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי הצמח

התרת איך פיזיולוגיה ומורפולוגיה צמודות מאפשרת הבנה עמוקה יותר של תפקוד מכניסטית של צמח עלים. אנו מציגים שני הליך לגזור פרמטרים של רגולציה הפיוניות ממדידות הפיוניות מוליכות ומתאמים עם תכונות עלה פונקציונליות מסורתיות.

הנוגע לתכונות מוליכות הפיוניות פונקציונליות ליף

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

מתוארים פרוטוקולים לחקירת הדינמיקה של סטרומולים של כלורופלסט, הצינורות המלאים בסטרומה המשתרעים מפני השטח של כלורופלסטים.

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.

ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לתצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות לפלישת חיידקים ב - Arabidopsis thaliana. שיטה זו ממנפת מכשיר הדמיה סטומטלי נייד, יחד עם צינור ניתוח תמונה המיועד לתמונות עלים שצולמו על ידי המכשיר.

תצפית ישירה ומדידה אוטומטית של תגובות סטומאטליות למזרקי Pseudomonas PV . עגבניה DC3000 ב Arabidopsis thaliana

פרוטוקול זה מתאר גישה בעלת תפוקה גבוהה להערכת דליפת יוני צמחים, פעילות פרוקסידאז וייצור קלוז באותה דגימה.

הערכת תגובות עלים למטבוליטים משניים מיקרוביאליים באמצעות פורמט בעל תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מציג שיטה השוואתית להערכת תכונות סטומטליות ואפידרמליות בשני מינים מובחנים, באמצעות פילינג אפידרמלי, טכניקות ניקוי וניתוח תמונות בעזרת בינה מלאכותית. המטרה היא לאפשר כימות בתפוקה גבוהה וניתנת לשחזור של מבנים תאיים הבסיס לתפקוד הפיוניתי ליישומים חקלאיים ולמחקר צמחי רחב.

אפיון תכונות פטיחות ואפידרמליות באמצעות פילינג, ניקוי וניתוח תמונות מבוסס בינה מלאכותית

למדו להעריך תגובות פיוניות לחיות חיידקיים באמצעות הדמיית עלים שלמים. שיטה זו מאפשרת תצפית בזמן אמת של תנועת תאי שמירה תוך מזעור פגיעה ברקמה, ומסייעת בחקר אינטראקציות צמח-מיקרואורגניזם.

הערכת התגובה הפיוניות לחיות תאים חיידקיים באמצעות הדמיה עלה שלמים

גלה סרטונים נוספים