Name: הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: חקור שיטה להערכת קצב ייצור וירוסים בקהילות מיקרוביות מימיות באמצעות טכניקת הפחתה והתחדשות. שיטה זו מאפשרת להסיק על שיעורי תמותה מיקרוביים הנגרמים על ידי פעילות ויראלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרסום של מאמר זה היה נתמך על ידי מענק מטעם משרד המחקר של אוניברסיטת טנסי. המחברים מודים הדור הקודם של סטודנטים וחוקרים אשר עבדו כדי לחדד נהלים אלה. המחקר נתמך על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (NSF-0851113, 0825405 ו - NSF-NSF-0550485).

1. Ultrafiltration של מי ים כדי לייצר "וירוס חינם" מים (וילהלם &amp; Poorvin 2001) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 20L של מי ים / lakewater נאסף כמו בסביבה נקייה מחיידקים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים prefiltered סדרתי דרך 142 מ"מ קוטר פוליקרבונט 0.8 מיקרומטר מסננים כי אפשר לשמור על -20 ° C לניתוח הקהילה. מוגדלת גודל מסננים נקבוביות ניתן להשתמש לפני שלב זה עבור מערכות פורה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג מים ultrafiltered ממערכת Amicon M12 (Millipore) 30 kDa-הפסקת המחסנית ספירלה משמש לכלול את כל וירוסים, אפילו קטן וירוסים RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימות מעובדים מרוכז במהירות ~ 25% עם 15-16 kPa ~ של backpressure. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם הנותרים של 500 מ"ל מים ~ יכיל הקהילה נגיף מרוכז (אשר ניתן לשמור על ניסויים אחרים), בעוד הנותרים 19.5 ליטר של מים מווירוסים ישמש מבחני ההפקה ויראלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי יום אחד של שימוש, המערכת M12 Amicon יש לנקות כדי למנוע נזק הממברנה של מחסנית המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אתה עובד עם מי ים, יש לשטוף את הממברנה עם לפחות 6L מים מילי-Q ואחריו כביסה עם פתרון NaOH 0.1N עבור 30-45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב לשטוף את המחסנית עם לפחות 6L מים מילי-Q. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום השימוש במערכת M12, מחסנית ספירלה יש לאחסן פתרון 0.05MH 3 4 ת.ד. ב 4 ° C. </li></ol> 2. הפחתת וירוס שיטת הפקה ויראלי (וילהלם et al. 2002) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עד 500 מ"ל של מי ים מדגם / lakewater עם שני מארח ווירוסים מתקבל והניח ביחידה sterifilter עם 0.2-מיקרומטר הנומינלי נקבוביות גודל נמוך חלבון מחייב סינון (למשל, Durapore) הניח על זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם בעדינות אבק לחץ על 200 מ"מ כספית &lt;בעוד הרף resuspending המדגם בעזרת פיפטה סטרילית העברת לעכב תאים חיידקיים מן להתרכז המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט שלושת הכרכים של ultrafiltrate מתווספים ההשעיה חיידקי כדי להפחית באופן משמעותי את מספר וירוסים חינם במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק חיידקי הוא מדולל בחזרה 500 מ"ל מים עם וירוסים חינם מחולק לשלושה משכפל של 150 מ"ל כל ממוקמים בקבוקי 250 מ"ל ברור פוליקרבונט. </li></ol> 3. תזרים משיק סינון (TFF) שיטת ייצור ויראלי (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) TFF מייצג גישה חלופית לשיטת הפחתת ויראלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 500 מ"ל של המדגם טבעי נאסף כמתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגם זה מרוכזת באמצעות-0.2 מיקרומטר הנומינלי נקבוביות בגודל משיק מערכת סינון לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר חלק חיידקי מצטמצם בערך 10-15 מ"ל, ultrafiltered, וירוס ללא מים הוא הוסיף ומופץ לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבקבוקים לשכפל מודגרת בבית בתנאים באתרו שימוש בתאי הסביבה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמות אור משתנים תנאי השטח באמצעות הכחלחלה אקרילי אקריליק או לנקות עם הקרנת נטו לירידה בעוצמת האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורות פני השטח אמביינט מתקבלים לעתים קרובות באמצעות מי ים זורמים הסיפון חממה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות עבור הערכות שפע חיידקים ווירוסים נלקחים בזמן 0 עם ריכוז סופי של glutaraldehyde סטרילי 2.0-2.5% נוסף לתוך cryovials. דגימות אלה מיד פלאש קפוא עם חנקן נוזלי ומאוחסנים עד קפוא מעובד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חנקן נוזלי אינו זמין, שקופיות מיקרוסקופ עשוי להיות מוכן ומעובד באופן מיידי (ראה נוהל להלן) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subsamples נאספים כל 2.5 שעות לפחות 10 שעות על ידי השיטה המתוארת לעיל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה מים הפעם עשוי להיאסף לניתוח PCR כמותי. עד 5 מ"ל של המדגם ניתן להוסיף cryovial עם סוכן לא מקבע עם הקפאת פלאש מיידית חנקן נוזלי. </li></ol></li></ol> 4. הפקה מיקרוסקופית ויראלי (נובל &amp; Fuhrman 1998, ון et al. 2004) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות קפואות להיות 0.02-מיקרומטר סינון עבור מיקרוסקופיה צריך להיות מופשר על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של SYBR הירוק על ידי דילול פתרון 1:10 המניה עם מים סטריליים. בשלב הבא, מפתרון המניות, להכין עבודה על ידי הוספת פתרון 1mL הפתרון המניות של 39 מ"ל מים סטריליים. גליצרול 50%, פוספט 50% שנאגרו פתרונות מלוחים (PBS, 0.05 M Na 2 HPO 4, 0.85% NaCl, pH 7.5) ומלאי טרי פתרון 2.5% phenylenediamine-p צריך גם להיות מוכן לפני תחילת. שמור על 50% glycerol/50% פתרון PBS ב 4 ° C ו-p phenylenediamine המניה ב -20 ° C בחושך עד ההתחלה. ממש לפני הסינון מוסיפים את p-phenylenediamine של 50% PBS glycerol/50% ריכוז סופי של 0.1% כדי לשמש כפתרון Antifade. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 25 מ"מ 0.02-מיקרומטר לסנן Anodisc על גבי MicronStep 0.45-מיקרומטר, מסנן גיבוי מתאית. הוספת 850 μL המדגם קבוע לחלק העליון של Anodisc ואקום ב PKA 20 עד יבש לחלוטין. 100 מקום μL הפתרון הירוק SYBR הפועלים צלחת פטרי סטרילית, עם הריק עדיין בזהירות להסיר את Anodisc ממגדל מקום לסנן על הירוק SYBR. דגירה דגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. בזהירות להסיר את המסנן מפתרון SYBR הירוק הפתיל האחורי של המסנן עם Kimwipe כדי להסיר את כל שאריות צבע. אם תרצה, תוכל להחזיר את המסנן למגדל ולהעביר עד 800 μL של מים מסוננים 0.02-מיקרומטר או מדיה סטרילית דרך המסנן כדי לשטוף את הכתם עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפה קטנה של פתרון antifade לשקופית המיקרוסקופ במקום להחליק על גבי העטיפה. הסר את תלוש לכסות ולהוסיף את מסנן יבשים לשקופית מיקרוסקופ רטוב עם פתרון antifade. שוב, להוסיף כמות קטנה של פתרון antifade להחליק את המכסה לאט למקם אותו על גבי המסנן, מוודא להיפטר מכל הבועות כי עלול להיווצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להקפיא את השקופיות ב -20 ° C עד הצורך (אלה יש להשתמש תוך כמה חודשים כדי למנוע דהייה והוריד ספירת וירוס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וירוסים הם המנויים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו מיקרוסקופ DMRXA לייקה) עם סט רחב מסנן כחול (אקס λ = 450-490 nm, λ = 510 nm Em עם מסנן דיכוי ב λ = 510 ננומטר). כל מסנן יהיה לפחות 20 שדות הראייה נספר, מוודא לכמת וירוסים סך מרשת כל שדה כדי להבטיח אפילו הפצה של וירוסים דרך הממברנה את המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיעור ממוצע של הישנותם וירוס משלושת עצמאית משכפל מחושבים אז סטיית התקן נקבעת שיעורי הייצור. </li></ol> 5. נציג תוצאות הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי החוקר דורש עיבוד מתמטי מינימלי כדי לייצר שיעורי הישנותם של שפע וירוס. קבוצת הנתונים העיקרי הנובע מחקר זה היא שיעורי הישנותם של שפע וירוס ב subsamples מ incubations. תוצאות אלו בצורה עצמאית רגרסיות שפע של זמן לעומת וירוס עבור כל אחת מהדגימות. עבור כל דגימה incubations הפרט לפעול כמו טיפול אחד, אז על ידי השלמת three-לשכפל incubations החוקר יכול לחשב שיעורי כמו גם אומדן של שונות (למשל, סטיית תקן) (ראה איור 1). אזהרה אחת של תהליך זה היא כי ירידה קבועה שפע וירוס מוביל לירידה בתאי המארח במדגם כי הם שנשאו בנטל וירוס. כדי לקזז את ההפסד הזה, ספירה של שפע חיידקי ממקור שני (מי ים או מים מסוננים האגם) ו T = 0 מדגם הדגירה נחוצים. מידע זה יכול לשמש כדי להסביר את האחוז של תאים שאבדו: בהנחה כי תהליך הפחתת שפע וירוס אינה סלקטיבית בעד או נגד כל חברי הקהילה חיידקים, גורם זה יכול לשמש כדי לאמוד את קצב הפקת באתרו של וירוסים . <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הייצור של דגימות נגיף דמוי חלקיקים מעל הדגירה של 10 שעות בבית בתנאים באתרו באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. נאספו במהלך הפיטופלנקטון פריחה לחופי ניו זילנד בספטמבר 2008. <img src="/files/ftp_upload/2196/2196fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה עבור ייצור assaying וירוס. התהליך מתחיל עם ultrafiltration המים מדגם ליצור וירוס ללא מים. זהו השלימה באמצעות מערכת ultrafiltration. בדגימות מים במקביל נאספים מאותו אתר ואת וירוסים חינם עברו דרך פילטר בעוד הקהילה חיידקים (המכיל תערובת של תאים נגועים ולא נגועים) נשמרת. קהילה זו היא resuspended אז במים וירוס בחינם מודגרות תחת בתנאים באתרה. שיעור הישנות של וירוסים מנוטר אז במשך 10 השעות הבאות כדי לקבוע שיעורי הייצור וירוס.

<ol><li>Higgins, J. L., Kudo, I., Nishioka, J., Tsuda, A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+the+virus+community+to+a+mesoscale+iron+fertilization+in+the+sub-Arctic+Pacific+Ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Deep-Sea+Res+II%22%5BJournal%5D)">The response of the virus community to a mesoscale iron fertilization in the sub-Arctic Pacific Ocean.</a> Deep-Sea Res II. 56, 2788-2795 (2009).</li>
<li>Mioni, C. E., Poorvin, L., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+and+siderophore-mediated+transfer+of+available+Fe+between+heterotrophic+bacteria%3A+characterization+using+a+Fe-specific+bioreporter%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Virus and siderophore-mediated transfer of available Fe between heterotrophic bacteria: characterization using a Fe-specific bioreporter.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 233-245 (2005).</li>
<li>Noble, R. T., Fuhrman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SYBR+Green+I+for+rapid+epifluorescence+counts+of+marine+viruses+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria.</a> Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).</li>
<li>Parada, V., Herndl, G., Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+burst+size+of+heterotrophic+prokaryotes+in+aquatic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mar+Biol+Assoc+U+K%22%5BJournal%5D)">Viral burst size of heterotrophic prokaryotes in aquatic systems.</a> J Mar Biol Assoc U K. 86, 613-621 (2006).</li>
<li>Poorvin, L., Rinta-Kanto, J. M., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+of+Fe+and+its+bioavailability+to+marine+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Viral release of Fe and its bioavailability to marine plankton.</a> Limnol Oceanogr. 49, 1734-1741 Forthcoming.</li>
<li>Rowe, J. M., Saxton, M. A., Cottrell, M. T., DeBruyn, J. M., Berg, G. M., Kirchman, D. L., Hutchins, D. A., Wilhelm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constraints+on+virus+production+in+the+Sargasso+Sea+and+North+Atlantic%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Constraints on virus production in the Sargasso Sea and North Atlantic.</a> Aquat Microb Ecol. 52, 233-244 (2008).</li>
<li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+of+prokaryotic+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Ecology of prokaryotic viruses.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-181 (2004).</li>
<li>Weinbauer, M. G., Peduzzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency%2C+size+and+distribution+of+bacteriophages+in+different+marine+morphotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Ecol+Prog+Ser%22%5BJournal%5D)">Frequency, size and distribution of bacteriophages in different marine morphotypes.</a> Mar Ecol Prog Ser. 108, 11-20 (1994).</li>
<li>Weinbauer, M. G., Winter, C., H&ouml, fle, G, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsidering+transmission+electron+microscopy+based+estimates+of+viral+infection+of+bacterioplankton+using+conversion+factors+derived+from+natural+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Reconsidering transmission electron microscopy based estimates of viral infection of bacterioplankton using conversion factors derived from natural communities.</a> Aquat Microb Ecol. 27, 103-110 (2002).</li>
<li>Wen, K., Ortmann, A. C., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+estimation+of+viral+abundance+by+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate estimation of viral abundance by epifluorescence microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 70, 3862-3867 (2004).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Brigden, S. M., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dilution+technique+for+the+direct+measurement+of+viral+production%3A+a+comparison+in+stratified+and+tidally+mixed+coastal+waters%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">A dilution technique for the direct measurement of viral production: a comparison in stratified and tidally mixed coastal waters.</a> Microb Ecol. 43, 168-173 (2002).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Matteson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshwater+and+marine+virioplankton%3A+a+brief+overview+of+commonalities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Freshw+Biol%22%5BJournal%5D)">Freshwater and marine virioplankton: a brief overview of commonalities and differences.</a> Freshw Biol. 53, 1076-1089 (2008).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Poorvin, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilhelm%2C+SW+%22Quantification+of+algal+viruses+in+marine+samples%22">Quantification of algal viruses in marine samples</a>. Paul, J. H. , Academic Press. London, UK. 53-66 (2001).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+and+nutrient+cycles+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%22%5BJournal%5D)">Viruses and nutrient cycles in the sea.</a> Bioscience. 49, 781-788 (1999).</li>
<li>Wilhelm, S. W., Weinbauer, M. G., Suttle, C. A., Jeffrey, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sunlight+in+the+removal+and+repair+of+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">The role of sunlight in the removal and repair of viruses in the sea.</a> Limnol Oceanogr. 43, 586-592 (1998).</li>
<li>Winget, D. M., Williamson, K. E., Helton, R. R., Wommack, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+flow+diafiltration%3A+an+improved+technique+for+estimation+of+virioplankton+production%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Tangential flow diafiltration: an improved technique for estimation of virioplankton production.</a> Aquat Microb Ecol. 41, 221-232 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מרכיב קריטי להבנת אופן השפעת וירוסים הקהילות חיידקים ימיים היא לקבוע את הקצב שבו חלקיק הנגיף מיוצרים. בהתחשב בכך שכיחותם הם (פחות או יותר) סטטי ברוב מערכות (וילהלם &amp; Suttle 1999, Weinbauer 2004), כי וירוסים יוסרו או שניתנו לא זיהומיות במהירות במערכות מים (וילהלם et al. 1998), אז שיעורי הייצור חייב להיות יחסית מהירה כדי להחליף את חלקיקי לאיבוד. אמידת וירוסים התמותה לגרום לקהילה חיידקים דורש ידע של איך וירוסים רבים מיוצרים בכל פעם וירוס lyses תא (להלן: &quot;גודל פרץ&quot;). פרץ וירוס בגדלים בדגימות טבעי יכול להשתנות במידה רבה. גדלים Burst ניתן לקבוע באופן ישיר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (למשל, Weinbauer &amp; Peduzzi 1994), אבל זה בדרך כלל מעבר ליכולות של מעבדה מסוימת או לא תמיד מעשי. במצבים בהם לא ניתן לקבוע באופן אמפירי, ערכים בספרות של 24 וירוסים לכל אירוע ממס ניתן להשתמש במערכות ימית 34 עבור מערכות מים מתוקים (Parada et al. 2006). אם קצב הייצור וירוס מחולק במספר הזה, התוצאה היא שפע של תאים לכל נפח נהרס על ידי וירוסים על בסיס יומי. חיידקים lysed ערך אז יכול להיות מחולק המניה עומד שפע חיידקים וכתוצאה מכך התמותה הנגרמת וירוס למערכת הנדון: קיימות ההערכות נעות בין אחוזים בודדים לאוכלוסייה כמעט כולו, ולעתים קרובות הם תלויים בגורמים אחרים במערכת הנדונה (וילהלם &amp; Matteson 2008). כדי לקבוע את שיעור התמותה הכולל מספר זה מוכפל לעתים קרובות על ידי שני (עבודה מתוך ההנחה כי 50% מכלל התאים ממשיכים להתרבות ו 50% של התאים אבדו, Weinbauer 2004). בהתחשב בכך הזמינות הביולוגית אלמנט מזין עקבות (למשל, N, P, Fe) יכול להגביל את שיעור הפריון העיקרית, וכן שטף הפחמן כאלה, דרך מערכות מים, והבנה של תפקיד התמותה מונחה וירוס חיידקים בתהליך הזה הפך לעניין geochemists ימיים. כיום קיימות מספר הערכות כי וירוסים מציע לשחרר ריכוזים משמעותיים של אלמנטים מזין בחזרה בעמודת המים על בסיס יומי (רו et al. 2008, היגינס et al. 2009) וכי מרכיבים אלה נטמעו במהירות על ידי הקהילה חיידקים (Poorvin et אל. 2004, Mioni et al. 2005). שיעור השטף מזין לסביבה ניתן לקבוע על ידי הכפלת מספר התאים נהרסו על ידי בסכום של התא לכל מזין (מסומן &quot;מכסות&quot;). מידע זה יכול לספק מרכיב קריטי להבנת איך קורי מזון מיקרוביאלי לתפקד על פני מערכות מימיים. התפתחויות שוטף: מאמצים שוטפים על ידי שורה של קבוצות מחקר כרוך בהתאמת האסטרטגיה לעיל למנות וירוסים ספציפיים בתוך הקהילה, וככזה, כדי לקבוע כיצד אורגניזמים מסוימים מושפעים פעילות הנגיף. כדי לעשות זאת החוקרים להשתמש פולימראז כמותיים תגובת שרשרת (qPCR) כדי להעריך את השפע של קבוצות וירוסים ספציפיים או משפחות במקביל האומדנים של הקהילה הכולל וירוס. התוצאות לאחר מכן ליישם ישירות לספק הערכות של תמותה וירוס, מחזור מזין, וכו &#39;עבור קבוצות ספציפיות פלנקטון. גישה חדשה זו עוצמה יאפשר לחוקרים בשנים הקרובות לחפור הרבה יותר עמוק לתוך התהליכים הקשורים באקולוגיה של וירוסים, בפעם הראשונה, לכמת את יחסי הגומלין של וירוסים לארח קהילות ספציפיות מעבר לאילוצים של מערכות מעבדה.

<table><tbody><tr><td>2.5% &lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-phenylenediamine</td><td>Acros Organics</td><td>130575000</td><td>מלאי עבור Antifade</td></tr><tr><td>מערכת Amicon Proflux M12</td><td>EMD Millipore</td><td>N/A</td><td>ניתן להשתמש בכל מכשיר אולטרה-פילטרציה לשלב זה</td></tr><tr><td>צבע ג'ל לחומצות גרעין SYBR Green I</td><td>Invitrogen</td><td>S-7563</td><td></td></tr><tr><td>מסנן Helicon S10 30kDa</td><td>EMD Millipore</td><td>CDUF010LT</td><td></td></tr><tr><td>מסנני Pelicon XL 0.22 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>PXGVPPC50</td><td></td></tr><tr><td>מסנני ממברנת PCTE של GE 0.2 &amp;mu;m (47mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-732-35</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון זרימה טנגנציאלית (TFF) בקנה מידה מעבדתי של Millipore</td><td>EMD Millipore</td><td>XX42LSS11</td><td>ניתן להשתמש במערכות TFF אחרות לשלב זה</td></tr><tr><td>מסננים לבנים חלקים, תאיתיים, Micronstep 0.45 &amp;mu;m (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E04WP02500</td><td></td></tr><tr><td>מסנני Anodisc של GE Whatman 0.02 &amp;mu;m (25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>68-09-6002</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Leica DMRXA</td><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנציה עם סט מסננים כחולים</td></tr><tr><td>מכלי פוליקרבונט 20L</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גליצרין</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>PBS (0.05 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.85% NaCl, pH 7.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-500, S640-500</td><td></td></tr><tr><td>50% גלוטראלדהיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קריו-פוליפרופילן עם הברגה חיצונית של Corning, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-71</td><td>ניתן להשתמש בכל מבחנות קריו</td></tr><tr><td>מבחנות קריו-פוליפרופילן עם הברגה חיצונית של Corning, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-74</td><td>ניתן להשתמש בכל מבחנות קריו</td></tr><tr><td> 85% H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-212</td><td>אחסון ממברנה ספירלית</td></tr><tr><td>גרגירי NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-3</td><td>ניקוי M12</td></tr><tr><td>משאלי מדידה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מסנן ממברנת Isopore בגודל נקבים 0.8-&amp;mu;m (142mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>ATTP14250</td><td></td></tr><tr><td>תושבת מסנן לחץ מפלדת אל-חלד של Millipore (142mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>YY30 090 00</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות aquatic

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

וירוסים הם רכיבים של מערכות מתפשט ימיים מים מתוקים, ו ידועים להיות סוכני משמעותי של תמותה של חיידקים. פיתוח אומדנים כמותיים של תהליך זה הוא קריטי כפי שאנו יכולים לפתח מודלים טובים יותר של מבנה הקהילה לתפקד חיידקים, כמו גם לקדם את הבנתנו כיצד וירוסים עובדים לשנות מחזורים biogeochemical מימיים. טכניקת ירידה וירוס מאפשר לחוקרים להעריך את הקצב שבו חלקיקי הנגיף משתחררים מן הקהילה חיידקים אנדמיים. בקיצור, שפע (תאית) וירוסים חינם מצטמצם במדגם בעוד הקהילה חיידקים נשמר ריכוז הסביבה הקרובה. הקהילה מיקרוביאלי הוא מודגרות אז בהיעדר של וירוסים חינם בקצב שבו וירוסים כמוה במדגם (דרך תמוגה של חברי כבר נגוע של הקהילה) ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופיה epifluorescence או, במקרה של וירוסים ספציפיים, כמותי PCR. שיעורים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך את שיעור התמותה עקב חיידקים תמוגה וירוס בתיווך התא.

שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

וירוסים הם מרכיבים נפוצים במערכות של מי מלח ומי מתוקים, והם ידועים כגורמים משמעותיים לתמותה מיקרוביאלית. פיתוח שיטות כמותיות...

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את הקצב שבו מופקים וירוסים בקהילות מיקרוביאליות מימיות. דבר זה מושג תחילה על ידי הפחתת השפעות של וירוסים חופשיים בדגימה הנבדקת תוך שמירה על הקהילה המיקרוביאלית המקורית. השלב השני של ההליך הוא דגירה של דגימות בתנאים מעוררים ואיסוף של תתי-דגימות מדי שעתיים עד שלוש שעות למשך עד 10 שעות.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ספירת הנגיפים בתוך תתי-הדגימות שנאספו מכל נקודת זמן. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא קביעת הקצב שבו עלתה שכיחות חלקיקי הנגיף בתוך הדגימה וקביעת קצבי ייצור הנגיפים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות, על סמך הספירות, את הקצבים שבהם מיוצרים נגיפים בתוך הקהילה המיקרוביאלית, מה שמאפשר לחוקרים להסיק את קצבי התמותה המיקרוביאלית כתוצאה מפעילות נגיפית.שלום לכולם. שמי אודרי מדיסון, ואני עובדת במעבדה של ד"ר סטיבן מילהם ובמחלקת המיקרוביולוגיה באוניברסיטת טנסי. היום, בעזרתם של צ'ארלס בודוף וקלייר קמפבל, נדגים לכם פרוצדורה לניתוח קצבי הייצור של וירוסים במערכות מימיות.כדי לעשות זאת, אנו מפחיתים את מספר הווירוסים החופשיים בדגימות וסופרים את הקצב שבו הם מופיעים מחדש בעקבות ליזיס של מיקרואורגניזמים נגועים בווירוסים. אנו משתמשים כעת בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את האקולוגיה של וירוסים וכיצד הם עשויים לעצב קהילות מיקרוביאליות. כעת, לאחר שהצגנו את הנושא, בואו נתחיל.לפני תחילת הליך זה, אספו כ-20 ליטרים של מי ים באופן אספטי ככל האפשר. לאחר איסוף הדגימה, בצעו סינון מקדים של המים דרך מסנן בעל קוטר 142 מילימטרים ונקבו של 0.8 מיקרון. עבור מערכות בעלות פריון ביולוגי גבוה, ניתן לבצע לפני כן סינון דרך מסנן בעל נקבים גדולים יותר או מסנן סיבי זכוכית.כדי להשיג מים שעברו סינון אולטרה, הגדירו מערכת סינון אולטרה כגון מערכת AmCon M 12 עם מחסנית ממברנה מסוג spiral wound כדי להסיר את כל הווירוסים. לאחר מכן, הווירוסים בדגימה מוסרים ומרוכזים במהירות של כ-25% מהמהירות המקסימלית עם לחץ חוזר של 15 עד 16 kilo pascals. התסנין, בנפח של כ-500 milliliters, מכיל כעת את קהילת הווירוסים המרוכזת, אותה ניתן לשמור למחקרים אחרים, בעוד שהפרמיאט נקי הווירוסים ישמש לבדיקות ייצור ויראליות.לאחר כל יום שימוש, נקו את מערכת ה-Omicron M 12 כדי למנוע נזק לממברנה של מחסנית המסנן. בעבודה עם מי ים, שטפו את הממברנה בלפחות שישה ליטרים של Milli Q water, ולאחר מכן בביצוע שטיפה עם תמיסת sodium hydroxide בריכוז 0.1 molar למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, שטפו את המחסנית בלפחות שישה ליטרים נוספים של Milli Q water.בסיום התהליך, ניתן לאחסן את המחסנית הספירלית בתמיסת חומצה זרחית בריכוז 0.05 molar בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בשיטת ההפחתה הוויראלית, מעבירים 500 milliliters של דגימת מי ים מאותו המיקום שבו הכנו את המים נטולי הווירוסים ליחידת סינון סטרילית עם מסנן בעל קישוריות חלבון נמוכה ובגודל נקבים נומינלי של 0.2 micro. בנקודה זו, יש לאסוף גם דגימה משנית כדי לקבוע את השפע הכולל של וירוסים וחיידקים במים ההתחלתיים.בצעו דחיסה עדינה בוואקום לדוגמה בלחץ של פחות מ-200 millimeters of mercury, תוך כדי ערבוב רציף של הדוגמה באמצעות פיפטה סטרילית כדי למנוע ריכוז של תאי חיידקים על המסנן. הוסיפו באיטיות שלושה נפחים של 500 milliliters של תרשיח אולטרה (ultra filtrate) לתליה הבקטריאלית כדי להפחית את שכיחות הווירוסים החופשיים בדוגמה, תוך שמירה על אוכלוסיות החיידקים בצפיפות קבועה. לבסוף, דללו את הפракציה הבקטריאלית בחזרה ל-500 milliliters באמצעות מים שעברו סינון אולטרה נטולי וירוסים. לאחר מכן, חלקו את התמיסה לשלוש חזרות של 150 milliliters והניחו את החזרות בבקבוקי פוליקרבונט שקופים של 250 milliliters.זהו סט הדגימות של נקודת הזמן אפס. קח דגימות להערכת שפע חיידקים ונגיפים מדגימות נקודת הזמן אפס שלך. העבר את הדגימות למבחנות קריו עם ריכוז סופי של 2.0 עד 2.5% sterile glutaraldehyde.כחומר מקבע, הקפיאו מיד את הדגימות הללו בהקפאה מהירה באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לעיבודן. לחלופין, ניתן להשתמש במערכת סינון זרימה משיקית (tangential flow system) כדי לרכז את המיקרובים הימיים. כדי להשתמש בשיטת ה-TFF, השגינו כ-500 milliliters של הדגימה הטבעית.רכז דגימה זו באמצעות מערכת סינון זרימה טנגנציאלית בעלת גודל נקבים נומינלי של 0.2 micron עד שהפראקציה הבקטריאלית תצטמצם לכ- 10 עד 15 milliliters של מים נקיים מווירוסים שעברו אולטרה-סינון, כפי שמתואר בשיטה להפחתת וירוסים; הדגר את בקבוקי השכפולים שהתקבלו בתנאי incite you. בשימוש בתאי סביבה בים, אנו משתמשים במדגרי מי ים זורמים המחוברים לאספקת מי שטח השומרת על טמפרטורת הסביבה. ניתן להתאים את רמות התאורה לתנאי השטח באמצעות אקריליק בגוון כחול או רשת סינון בצפיפות ניטרלית להפחתת עוצמת האור.בעת עבודה מתחנת שדה או ממעבדה, או כאשר מי ים זורמים אינם זמינים, ניתן להשתמש באינקובטור גידול מואר. המשיכו לאסוף דגימות משנה מדי 2.5 שעות למשך 10 שעות לפחות, בשיטה שבוצעה עבור הדגימה בנקודת הזמן אפס. בנוסף לדגימות למיקרוסקופיה, חוקרים מסוימים ירצו לאסוף מים לצורך אנליזת quantitative PCR של נגיפים ספציפיים.עבור דגימות QPCR, הוסיפו חמישה מיליליטר של הדגימה למבחנה לקירור (cryo vial) ללא חומר מקבע והקפיאו מיד בהקפאה מהירה (flash freeze) בחנקן נוזלי. כהכנה למיקרוסקופיה של ייצור נגיפי, הפשירו דגימות קפואות על קרח והכינו תמיסות טריות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הניחו מסנן דיסק בעל נקביים בגודל 0.02 מיקרון ובקוטר 25 מילימטר מעל מסנן תמיכה תאיתי בגודל 0.45 מיקרון. לאחר מכן, הוסיפו 850 מיקרוליטר של הדגימה המקובעת לחלקו העליון של מסנן ה-anadi ובצעו שאיבה בוואקום בלחץ נמוך מ-20 kilo Pascals עד לייבוש מלא.לאחר שפילטר הדיסק של ה-ano יבש, העבירו בפיפט 100 microliters של תמיסת עבודה של cyber green לצחנת פטרי סטרילית. כאשר השואב עדיין פועל, הוציאו בזהירות את דיסק ה-ano ממגדל הסינון והניחו אותו על ה-cyber green. דגרו את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.הוצאו בזהירות את המסנן מתמיס ה-cyber green וספגו את גב המסנן בעזרת נייר Kim wipe כדי להסיר את כל שאריות הצבע. לאחר מכן, הוסיפו טיפה קטנה של תמיסת Antifa לזכוכית כיסוי של מיקרוסקופ והניחו מעליה לוחית כיסוי. הסירו את לוחית הכיסוי והניחו את המסנן המיובש על זכוכית הכיסוי של המיקרוסקופ.שוב, הוסיפו כמות קטנה של תמיסת Antifa ללוחית הכיסוי והניחו אותה באיטיות על גבי המסנן, תוך הקפדה על הסרת בועות שעלולות להיווצר. ספרו את הווירוסים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מסנן כחול רחב; ספרו לפחות 20 שדות ראייה עבור כל מסנן, תוך הקפדה על כימות סך הווירוסים מכל רשת שדה כדי להבטיח פיזור אחיד של הווירוסים על פני ממבנה המסנן. חשבו את קצבי החזרה הממוצעים של הווירוסים משלושת החזרות העצמאיות וקבעו סטיית תקן מקצבי הייצור. לבסוף, תקנו קצבים אלו בהתאם לדילול המיקרואורגניזמים מהשפע ההתחלתי לשפע המדולל בדגימה עם הווירוסים המופחתים.סט הנתונים העיקרי הנובע ממחקר זה הוא שיעורי החזרת שפע הנגיפים בדגימות המשניות מהדגירה. תוצאות אלו יוצרות רגרסיות עצמאיות של שפע נגיפים לעומת זמן עבור כל אחת מהדגימות. ייצור של חלקיקים דמויי נגיף נוטר לעומת דגירה של 10 שעות בתנאי insight due באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיגנסטית.דגימות אלו נאספו במהלך פריחת פיטופלנקטון מול חופי ניו זילנד בספטמבר 2008. הרגע הצגנו כיצד להעריך שיעורי ייצור נגיפים. הדבר כולל שימוש במערכות אולטרה-פילטרציה שונות וביצוע ניסויים למדידת שיעורי ייצור הנגיפים.בנוסף, הדגמנו כיצד לספור נגיפים אלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence microscopy). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בציוד נקי, לטפל בנגיפים הצבועים בזהירות, להפחית את עוצמת התאורה, לעבד את הדגימות במהירות ולנקות כראוי את מחסניי אולטרה-פילטרציה לאחר כל שימוש. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

estimating-virus-production-rates-in-aquatic-systems

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כדי להפוך את lentiviruses, וקטורים DNA הם transfected 293 לתוך תאים אנושיים. לאחר הקציר ריכוז supernatant, titer וירוס נקבעת על ידי ביטוי פלואורסצנציה עם cytometer זרימה.

Lentivirus הפקה

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

פותחה גישה לזיהוי תנאי ריכוז נגיפי אופטימליים עבור דגימות מים בנפח קטן באמצעות קוצים של אדנו-וירוס אנושי. הטכניקות המתוארות כאן משמשות לזיהוי פרמטרי ריכוז עבור מטרות נגיפיות אחרות, ומיושמות על ניסויים בריכוז נגיפי בקנה מידה גדול.

נוהל נפח קטן לריכוז נגיפי ממים

מאמר זה מציג שיטה מבוססת ביטוי לוציפראז בתפוקה גבוהה לטיטרציה של נגיפי RNA ו-DNA שונים באמצעות מטפלים אוטומטיים וידניים בנוזלים.

כותרות תפוקה גבוהה של וירוסי רקומביננטי לוציפראז- להביע

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפיץ תאי vitripennis Homalodisca וHoCV-1 במבחנה. בינוני הוסר מHoCV-1 תרבויות חיוביות וRNA שחולץ כל שעה 24 ל168 שעה. שרידות תא הייתה לכמת ידי מכתים trypan הכחול. חלקיקי נגיף שלמים חולצו לאחר פגיעה. RNA שחולץ היה לכמת ידי qRT-PCR.

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

שיטת EPA 1615 משתמשת במסנן אלקטרו-פוזיטיבי כדי לרכז אנטרו-וירוסים ונורו-וירוסים במי הסביבה ובמי השתייה. כתב יד זה מתאר את הליך איסוף הדגימות לניתוחי שיטה 1615.

EPA שיטת המדידה של 1615. Enterovirus ומופע norovirus במים על ידי תרבות וRT-qPCR. I. איסוף דגימות וירוסים

כאן אנו מציגים נוהל למדידת סך כל הנגיפים הניתנים לתרבית באמצעות קו תאי הכליה של הקוף הירוק של באפלו. הנוהל מספק כלי סטנדרטי למדידת הופעת נגיפים זיהומיים במי הסביבה ובמי השתייה.

מדידת שיטת EPA 1615. של enterovirus ואת מופע norovirus במים על ידי תרבות RT-qPCR. II. Assay וירוס culturable סה&quot;כ

ריכוז הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים הוא משימה מאתגרת, המתבצעת בעיקר לזיהוי וכימות נגיפים. בעוד מספר שיטות ריכוז וירוסים פותחו ונבדקו, אנו מדגימים כאן את היעילות של ultrafiltration ו flocculation חלב דל שומן עבור וירוסים RNA עם סוגי דגימה שונים.

ריכוז חלקיקי הנגיף מדגימות מים ושפכים סביבתיים באמצעות חלב דל שומן ואולטרה-סינון

מבחן TCID50 המדווח כאן משתמש במדידות התנגדות בזמן אמת ללא תוויות ובמודול הווירולוגיה של המערכת כדי לנטר באופן אובייקטיבי את ההשפעות הציטופתיות הנגרמות על ידי וירוס (CPE) בזמן אמת. הבדיקה היעילה הזו מקצרת משמעותית את זמן העבודה תוך תמיכה במדידות CPE קינטיות ומהירות תפוקה גבוהה וכמותית ומאפשרת חישובי TCID50 אוטומטיים בזמן אמת.

בדיקת מינון זיהומי של תרבית רקמה (TCID50) בזמן אמת וללא תוויות באמצעות אימפדנס לכימות אוטומטי של טיטר ויראלי

כאן, אנו מתארים שיטות דגימה מהאזורים האופוטיים של מערכות אקולוגיות ימיות ומים מתוקים כדי לבודד ציאנופגים (והמארחים שלהם) ותהליכים שלאחר הדגימה המעשירים גנוטיפים בודדים ומאפיינים את דינמיקת האינטראקציה בין וירוס למארח.

דגימה סביבתית של מיקרובים פוטוסינתטיים ווירוסיהם: מהשדה למעבדה

חקור שיטה להערכת קצב ייצור וירוסים בקהילות מיקרוביות מימיות באמצעות טכניקת הפחתה והתחדשות. שיטה זו מאפשרת להסיק על שיעורי תמותה מיקרוביים הנגרמים על ידי פעילות ויראלית.

הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic

גלה סרטונים נוספים