הערכת הפקה חליפין וירוס במערכות Aquatic
22 בספטמבר 2010
שיעור התחלופה של וירוסים במערכות ימיים מים מתוקים ניתן לאמוד על ידי ירידה וטכניקה הישנותם. הנתונים לאפשר לחוקרים להסיק ששיעורי התמותה וירוס בתיווך של חיידקים במערכות מים.
המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע את הקצב שבו מופקים וירוסים בקהילות מיקרוביאליות מימיות. דבר זה מושג תחילה על ידי הפחתת השפעות של וירוסים חופשיים בדגימה הנבדקת תוך שמירה על הקהילה המיקרוביאלית המקורית. השלב השני של ההליך הוא דגירה של דגימות בתנאים מעוררים ואיסוף של תתי-דגימות מדי שעתיים עד שלוש שעות למשך עד 10 שעות.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ספירת הנגיפים בתוך תתי-הדגימות שנאספו מכל נקודת זמן. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא קביעת הקצב שבו עלתה שכיחות חלקיקי הנגיף בתוך הדגימה וקביעת קצבי ייצור הנגיפים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות, על סמך הספירות, את הקצבים שבהם מיוצרים נגיפים בתוך הקהילה המיקרוביאלית, מה שמאפשר לחוקרים להסיק את קצבי התמותה המיקרוביאלית כתוצאה מפעילות נגיפית.
שלום לכולם. שמי אודרי מדיסון, ואני עובדת במעבדה של ד"ר סטיבן מילהם ובמחלקת המיקרוביולוגיה באוניברסיטת טנסי. היום, בעזרתם של צ'ארלס בודוף וקלייר קמפבל, נדגים לכם פרוצדורה לניתוח קצבי הייצור של וירוסים במערכות מימיות.
כדי לעשות זאת, אנו מפחיתים את מספר הווירוסים החופשיים בדגימות וסופרים את הקצב שבו הם מופיעים מחדש בעקבות ליזיס של מיקרואורגניזמים נגועים בווירוסים. אנו משתמשים כעת בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את האקולוגיה של וירוסים וכיצד הם עשויים לעצב קהילות מיקרוביאליות. כעת, לאחר שהצגנו את הנושא, בואו נתחיל.
לפני תחילת הליך זה, אספו כ-20 ליטרים של מי ים באופן אספטי ככל האפשר. לאחר איסוף הדגימה, בצעו סינון מקדים של המים דרך מסנן בעל קוטר 142 מילימטרים ונקבו של 0.8 מיקרון. עבור מערכות בעלות פריון ביולוגי גבוה, ניתן לבצע לפני כן סינון דרך מסנן בעל נקבים גדולים יותר או מסנן סיבי זכוכית.
כדי להשיג מים שעברו סינון אולטרה, הגדירו מערכת סינון אולטרה כגון מערכת AmCon M 12 עם מחסנית ממברנה מסוג spiral wound כדי להסיר את כל הווירוסים. לאחר מכן, הווירוסים בדגימה מוסרים ומרוכזים במהירות של כ-25% מהמהירות המקסימלית עם לחץ חוזר של 15 עד 16 kilo pascals. התסנין, בנפח של כ-500 milliliters, מכיל כעת את קהילת הווירוסים המרוכזת, אותה ניתן לשמור למחקרים אחרים, בעוד שהפרמיאט נקי הווירוסים ישמש לבדיקות ייצור ויראליות.
לאחר כל יום שימוש, נקו את מערכת ה-Omicron M 12 כדי למנוע נזק לממברנה של מחסנית המסנן. בעבודה עם מי ים, שטפו את הממברנה בלפחות שישה ליטרים של Milli Q water, ולאחר מכן בביצוע שטיפה עם תמיסת sodium hydroxide בריכוז 0.1 molar למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, שטפו את המחסנית בלפחות שישה ליטרים נוספים של Milli Q water.
בסיום התהליך, ניתן לאחסן את המחסנית הספירלית בתמיסת חומצה זרחית בריכוז 0.05 molar בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בשיטת ההפחתה הוויראלית, מעבירים 500 milliliters של דגימת מי ים מאותו המיקום שבו הכנו את המים נטולי הווירוסים ליחידת סינון סטרילית עם מסנן בעל קישוריות חלבון נמוכה ובגודל נקבים נומינלי של 0.2 micro. בנקודה זו, יש לאסוף גם דגימה משנית כדי לקבוע את השפע הכולל של וירוסים וחיידקים במים ההתחלתיים.
בצעו דחיסה עדינה בוואקום לדוגמה בלחץ של פחות מ-200 millimeters of mercury, תוך כדי ערבוב רציף של הדוגמה באמצעות פיפטה סטרילית כדי למנוע ריכוז של תאי חיידקים על המסנן. הוסיפו באיטיות שלושה נפחים של 500 milliliters של תרשיח אולטרה (ultra filtrate) לתליה הבקטריאלית כדי להפחית את שכיחות הווירוסים החופשיים בדוגמה, תוך שמירה על אוכלוסיות החיידקים בצפיפות קבועה. לבסוף, דללו את הפракציה הבקטריאלית בחזרה ל-500 milliliters באמצעות מים שעברו סינון אולטרה נטולי וירוסים. לאחר מכן, חלקו את התמיסה לשלוש חזרות של 150 milliliters והניחו את החזרות בבקבוקי פוליקרבונט שקופים של 250 milliliters.
זהו סט הדגימות של נקודת הזמן אפס. קח דגימות להערכת שפע חיידקים ונגיפים מדגימות נקודת הזמן אפס שלך. העבר את הדגימות למבחנות קריו עם ריכוז סופי של 2.0 עד 2.5% sterile glutaraldehyde.
כחומר מקבע, הקפיאו מיד את הדגימות הללו בהקפאה מהירה באמצעות חנקן נוזלי ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לעיבודן. לחלופין, ניתן להשתמש במערכת סינון זרימה משיקית (tangential flow system) כדי לרכז את המיקרובים הימיים. כדי להשתמש בשיטת ה-TFF, השגינו כ-500 milliliters של הדגימה הטבעית.
רכז דגימה זו באמצעות מערכת סינון זרימה טנגנציאלית בעלת גודל נקבים נומינלי של 0.2 micron עד שהפראקציה הבקטריאלית תצטמצם לכ- 10 עד 15 milliliters של מים נקיים מווירוסים שעברו אולטרה-סינון, כפי שמתואר בשיטה להפחתת וירוסים; הדגר את בקבוקי השכפולים שהתקבלו בתנאי incite you. בשימוש בתאי סביבה בים, אנו משתמשים במדגרי מי ים זורמים המחוברים לאספקת מי שטח השומרת על טמפרטורת הסביבה. ניתן להתאים את רמות התאורה לתנאי השטח באמצעות אקריליק בגוון כחול או רשת סינון בצפיפות ניטרלית להפחתת עוצמת האור.
בעת עבודה מתחנת שדה או ממעבדה, או כאשר מי ים זורמים אינם זמינים, ניתן להשתמש באינקובטור גידול מואר. המשיכו לאסוף דגימות משנה מדי 2.5 שעות למשך 10 שעות לפחות, בשיטה שבוצעה עבור הדגימה בנקודת הזמן אפס. בנוסף לדגימות למיקרוסקופיה, חוקרים מסוימים ירצו לאסוף מים לצורך אנליזת quantitative PCR של נגיפים ספציפיים.
עבור דגימות QPCR, הוסיפו חמישה מיליליטר של הדגימה למבחנה לקירור (cryo vial) ללא חומר מקבע והקפיאו מיד בהקפאה מהירה (flash freeze) בחנקן נוזלי. כהכנה למיקרוסקופיה של ייצור נגיפי, הפשירו דגימות קפואות על קרח והכינו תמיסות טריות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הניחו מסנן דיסק בעל נקביים בגודל 0.02 מיקרון ובקוטר 25 מילימטר מעל מסנן תמיכה תאיתי בגודל 0.45 מיקרון. לאחר מכן, הוסיפו 850 מיקרוליטר של הדגימה המקובעת לחלקו העליון של מסנן ה-anadi ובצעו שאיבה בוואקום בלחץ נמוך מ-20 kilo Pascals עד לייבוש מלא.
לאחר שפילטר הדיסק של ה-ano יבש, העבירו בפיפט 100 microliters של תמיסת עבודה של cyber green לצחנת פטרי סטרילית. כאשר השואב עדיין פועל, הוציאו בזהירות את דיסק ה-ano ממגדל הסינון והניחו אותו על ה-cyber green. דגרו את הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
הוצאו בזהירות את המסנן מתמיס ה-cyber green וספגו את גב המסנן בעזרת נייר Kim wipe כדי להסיר את כל שאריות הצבע. לאחר מכן, הוסיפו טיפה קטנה של תמיסת Antifa לזכוכית כיסוי של מיקרוסקופ והניחו מעליה לוחית כיסוי. הסירו את לוחית הכיסוי והניחו את המסנן המיובש על זכוכית הכיסוי של המיקרוסקופ.
שוב, הוסיפו כמות קטנה של תמיסת Antifa ללוחית הכיסוי והניחו אותה באיטיות על גבי המסנן, תוך הקפדה על הסרת בועות שעלולות להיווצר. ספרו את הווירוסים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עם מסנן כחול רחב; ספרו לפחות 20 שדות ראייה עבור כל מסנן, תוך הקפדה על כימות סך הווירוסים מכל רשת שדה כדי להבטיח פיזור אחיד של הווירוסים על פני ממבנה המסנן. חשבו את קצבי החזרה הממוצעים של הווירוסים משלושת החזרות העצמאיות וקבעו סטיית תקן מקצבי הייצור. לבסוף, תקנו קצבים אלו בהתאם לדילול המיקרואורגניזמים מהשפע ההתחלתי לשפע המדולל בדגימה עם הווירוסים המופחתים.
סט הנתונים העיקרי הנובע ממחקר זה הוא שיעורי החזרת שפע הנגיפים בדגימות המשניות מהדגירה. תוצאות אלו יוצרות רגרסיות עצמאיות של שפע נגיפים לעומת זמן עבור כל אחת מהדגימות. ייצור של חלקיקים דמויי נגיף נוטר לעומת דגירה של 10 שעות בתנאי insight due באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה אפיגנסטית.
דגימות אלו נאספו במהלך פריחת פיטופלנקטון מול חופי ניו זילנד בספטמבר 2008. הרגע הצגנו כיצד להעריך שיעורי ייצור נגיפים. הדבר כולל שימוש במערכות אולטרה-פילטרציה שונות וביצוע ניסויים למדידת שיעורי ייצור הנגיפים.
בנוסף, הדגמנו כיצד לספור נגיפים אלו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence microscopy). בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בציוד נקי, לטפל בנגיפים הצבועים בזהירות, להפחית את עוצמת התאורה, לעבד את הדגימות במהירות ולנקות כראוי את מחסניי אולטרה-פילטרציה לאחר כל שימוש. וזהו זה.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת שיעור התחלופה של וירוסים בקהילות מיקרוביאליות מימיות. באמצעות שימוש בטכניקה של הפחתה והחזרה, חוקרים יכולים להסיק את שיעורי התמותה המיקרוביאלית המתווכים על ידי וירוסים במערכות של מי מלח ומי מתוקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה
- וירולוגיה
- אקולוגיה של מימיים
רקע
- וירוסים ממלאים תפקיד משמעותי בויסות אוכלוסיות מיקרוביאליות בסביבות מימיות.
- הבנת שיעורי ייצור הוירוסים יכולה לספק תובנות לגבי תמותה מיקרוביאלית.
- המחקר מתמקד הן במערכות ימיות והן במערכות מים מתוקים.
- טכניקות להערכת שפע הוירוסים הן קריטיות למחקר אקולוגי.
מטרת המחקר
- לקביעת קצב ייצור הווירוסים בקהילות מיקרוביאליות מימיות.
- לניתוח ההשפעה של וירוסים על תמותה מיקרוביאלית.
- לפיתוח מתודולוגיה מהימנה לחקר דינמיקת וירוסים במערכות מימיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות מי ים וסינון מקדים להסרת וירוסים חופשיים.
- דגירה של הדגימות תחת תנאים מבוקרים למעקב אחר הופעתם מחדש של וירוסים.
- ספירה של וירוסים מדגימות-משנה שנאספו במרווחי זמן קבועים.
- שימוש ב-glutaraldehyde לשימור הדגימות וב-quantitative PCR לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- הערכה מוצלחת של שיעורי ייצור נגיפים בדגימות ממיים.
- הדגמה של הקשר בין שפע הנגיפים לבין תמותה מיקרוביאלית.
- אספקת מסגרת למחקרי עתיד על אקולוגיה של נגיפים.
- הדגשת החשיבות של דיוק מתודולוגי בוירולוגיה של מיים.
מסקנות
- הפרוצדורה מודדת ביעילות שיעורי ייצור נגיפים במערכות מימיות.
- הממצאים תורמים להבנה טובה יותר של הדינמיקה המיקרוביאלית המושפעת מנגיפים.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את ההשלכות האקולוגיות של אינטראקציות אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של קצבי ייצור נגיפים במערכות מימיות נותנת מענה לפער קריטי בהבנת התמותה המיקרוביאלית ודינמיקת המערכת האקולוגית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במידול מבנה הקהילה המיקרוביאלית ומספקת מידע להערכת סיכונים עבור יישומים בביו-פרמצבטיקה המערבים מיקרוביומים מימיים. מדידה מדויקת של ליזיס המתווך על ידי נגיפים תומכת במחקר תרגומי ובהחלטות תיק השקעות בביוטכנולוגיה סביבתית ובטיפולים מיקרוביאליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של אינטראקציות בין וירוסים למארחים בתוך קהילות מיקרוביאליות מורכבות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות כימות תמותה מיקרוביאלית המונעת על ידי וירוסים.
- מספק תיקוף פונקציונלי של ההשפעה הוויראלית על תהליכים ברמת המערכת האקולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מסייע בהכנת מערכות מיקרוביאליות מימיות מתוקשפות לצורך אנליזות המשך.
- מספק כימות סטנדרטי וניתן לשחזור של שיעורי ייצור נגיפים.
- מאפשר השוואה חזקה של פעילות נגיפית בתנאים סביבתיים או הנדסיים שונים.
מחקר תרגומי וקליני-קדם
- מתאימה נתונים על תמותה מיקרוביאלית למודלים מימי רלוונטיים למחלות, במידת הרלוונטיות.
- תומך ברצף מהגילוי האקולוגי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות מיקרוביאליות.
- מספק הפחתת סיכונים חזויה עבור מניפולציה סביבתית או טיפולית של מיקרוביומות מימיות.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטה זו להערכת קצב ייצור נגיפים משתלבת ברצף מהגילוי ועד לשלב הפרה-קליני במחקר של מיקרוביום מימי וביוטכנולוגיה סביבתית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבחינת היפותזות על ויסות ויראלי של אוכלוסיות מיקרוביאליות ומחזורים ביו-גאכימיים.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואת פעילות ויראלית בין דגימות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות של שפע ויראלי ברזולוציית זמן לצורך ניתוח סטטיסטי ומודלי רגרסיה.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה של שיעורי תמותה מיקרוביאליים למודלים מימיים פרה-קליניים במידת הרלוונטיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס תהליך עבודה הניתן לשימוש חוזר לכימות נגיפים במערכות מימיות מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון הניבוי במידול של קהילות מיקרוביאליות ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מתקנן את ספירת הנגיפים ואת ניתוח קצב הייצור לצורך הדירות (reproducibility).
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) עבור התערבויות במיקרוביום מימי וניהול סיכונים סביבתיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכונים של מטרות מיקרוביאליות ונגיפיות בקווי ייצור סביבתיים וביוטכנולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוביולוגיה של מימיים, וירולוגיה, ומיקרוסקופיה כמותית או qPCR.
- מחייב גישה למערכות אולטרה-פילטרציה, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ותשתית אנליטית.
- מצריך סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרוטוקולי דגימה, אינקובציה וספירה.
- עשוי לדרוש התאמה לסביבות מימיות שונות או להרכבים שונים של קהילות מיקרוביאליות.
- תלוי בטיפול קפדני בדגימות ובבדיקת התקנים של הציוד כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:09
Introduction
1:45
Ultrafiltration of Seawater to Generate "Virus-free" Water
3:23
Virus Reduction Method for Viral Production
5:40
Virus Production Under in situ Conditions
6:48
Virus Production Microscopy
9:35
Representative Results
10:09
Conclusion
