Name: סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-23T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: למדו לזהות תאים נגועי HIV-1 באמצעות וקטור lentiviral תלוי Rev המביע GFP. השיטה משתמשת בזרימה ציטומטרית לכימות תאים חיוביים ומציעה יישומים טיפוליים בזיהוי וטיפול ב-HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה בחלקה על ידי שירות הבריאות הציבורי מענק 1R01AI081568 מ NIAID ל י.ו. ועל ידי תרומות נדיבות של תורמים הרוכבים של רייד 2009 איידס NYCDC מאורגן על ידי מ &#39;רוזן Day2 בע&quot;מ

1. Transfection של פלסמידים עבור הפקה של Rev-מותנה חלקיקים lentiviral הגדרת: Rev-GFP תלוי וקטור lentiviral, pNL-GFP-RRE-SA, תוארה בעבר 4,5,6. כדי להרכיב לתוך חלקיק נגיפי, הפלסמיד היה contransfected לתוך HEK293 בתאי T לבנות עם HIV-1 אריזה, pCMVΔ8.2 (בתנאי בחביבות על ידי ד"ר Dider Trono), וכן פלסמיד שנשא את גליקופרוטאין VSV-G (pHCMV-G) . Transfection בוצע בשיטת סידן פוספט. הכנת מאגרים: 10 X בהרוורד (Hepes בופר) הוכנה על ידי המסת 5 גרם של Hepes, 8 גרם של NaCl, 0.37 גרם של KCl, 1 גרם דקסטרוז, 0.103 גרם Na 2 HPO 4 (anhydrous) ב 100 מ"ל של H 2 O. The10 Aliquot X בהרוורד חיץ לתוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C. בזמן transfection, להמיר את 10 X 2 X בהרוורד כדי בהרוורד עם H 2 O (1: 5 דילול), ולהתאים את ה-pH על בין 7.05-7.12. (ל -10 מ"ל 2 X בהרוורד, זה בדרך כלל דורש כ 50 μL של 1M NaOH). סנן לעקר את החיץ 2X בהרוורד על ידי עובר דרך 0.22 מיקרומטר Millipore הסינון. חיץ CaCl 2 נעשתה על ידי המסת CaCl 2 ב 10 Hepes מ"מ עד 2M ריכוז הסופי. התאם ל-pH 5.8, מסנן לעקר את החיץ ולאחסן ב 4 ° C. נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני transfection, זרע 2 x 10 6 תאים HEK293T ב 100 מ"מ, צלחת פטרי, ולגדל תאים לילה 10 מ"ל DMEM + 10% FBS על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר supernatant מתאי ולהחליף עם 5 מ"ל טרי DMEM + 10% FBS, התרבות תאים ברציפות במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור קלקר 5 מ"ל, להוסיף 480 μL חיץ 2X בהרוורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור פוליסטירן השני 5 מ"ל, להוסיף 60 μL 2M CaCl 2 חיץ, ה-DNA פלסמיד, ו transfection TE חיץ (1 mM טריס, 25 mM EDTA, pH 8.0) עד נפח כולל של 480 μL. עבור צלחת פטרי כל פלסמידים יש להוסיף ביחס של 10 מיקרוגרם של pNL-GFP-RRE-SA, 7.5 מיקרוגרם של pCMVΔR8.3, ו 2.5 מ"ג של pHCMV-G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פלסמיד דנ"א CaCl 2 dropwise תערובת של הצינור 2 בהרוורד X, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. המשקע בסדר יהוו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את μL 960 של התערובת dropwise ידי פיפטה אל התאים. לדגור על 37 ° C CO, 5% 2 לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את supernatant ולהוסיף טרי 10 מ"ל DMEM + 10% FBS, ברציפות דגירה התאים ב 37 ° C CO, 5% 2 לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב transfection 48 שעות לכתוב, הקציר וירוס על ידי הסרת supernatant והעברתו לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי. הוסף 10 מ"ל טרי טרי DMEM FBS + 10% לתוך צלחת פטרי כל ולהמשיך תרבות בין לילה. חנות supernatant וירוס ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך הקציר transfection 72 שעות שלאחר ידי איסוף supernatant. מערבבים את כל supernatants ו בצנטריפוגה supernatants XG ב 500 במשך 15 דקות כדי גלולה ולסלק פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant נאספו מסונן באמצעות מסנן Millipore 0.22 מיקרומטר. הווירוס היה מרוכז יותר באמצעות גודל הדרה עמודות. </li></ol> 2. תתרכז חלקיקים נגיפיים ולקבוע titer ויראלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקיקים נגיפיים רוכזו על ידי טור בגודל הרחקה (100,000 מגוואט מנותקים, Centricoin). Supernatant ויראלי נטען לתוך הטור, ו centrifuged XG ב 6000 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant ויראלי מרוכז נאסף, aliquoted, ומאוחסנים ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Titer ויראלי נקבע על ידי זיהום של TNF-שטופלו, HIV-1 קו התא חיובי Jacket, J1.1 7. היו תאים בתרבית בצלחת 96 גם ב 2.5 x 10 5 תאים לכל מ"ל (100 מ"ל סה"כ נפח), וכן נגוע 100 מ"ל של דילול סדרתי vNL-GFP-RRE-SA במשך שבוע. כייל (TCID50) של החלקיקים הוערך על ידי ספירת בארות GFP חיובית בעקבות השיטה של ​​ריד Muench 8. </li></ol> 3. סימון HIV-1 תאים חיובי עם החלקיקים lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA הגדרת: תא T מסוג CD4 אנושי קו, CEM-SS, היה נגוע הראשון עם HIV-1. ב 48 השעות שלאחר הזיהום, התאים היו superinfected עם חלקיקי lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA. בעקבות superinfection עוד יומיים, GFP חיובי תאים נותחו על ידי cytometry הזרימה. כמו שליטה, HIV-1 נגוע CEM-SS התאים נדבקו זהה עם vNL-GFP-RRE-SA. רק ב-HIV-1-נגועים CEM-SS תאים הולידה את ה-GFP בתאים חיוביים אך לא HIV-1 נגוע CEM-SS תאים. נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעתיים לפני ההדבקה, להוסיף polybrane לריכוז סופי 4 מ"ג / מ"ל. ספירת תאים ולקחת 2 x 10 5 תאים עבור כל זיהום. להדביק תאים עם נ"ג 200 (p24) של HIV-1-3 NL4 למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות, resuspendתאים לתוך 2 x 10 5 תאים / מ"ל, והתרבות 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ולקחת 2 x 10 5 תאים לכל זיהום vNL-GFP-RRE-SA. מוסיפים 100 מ"ל של vNL-GFP-RRE-SA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו תאים resuspend לתוך 2 x 10 5 תאים / מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניתוח תזרים cytometry ב superinfection 48 שעות הודעה. תאים נגועים היו pelleted ו resuspended לתוך paraformaldehede 500 מ"ל 1%, מודגרות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ניתח אז על נתח FACScan (בקטון דיקנסון). </li></ol> 4. נציג תוצאות אם הניסויים מבוצעים בהצלחה, אוכלוסייה גדולה של GFP יזוהו בתאים HIV-1-נגועים CEM-SS על ידי cytometer את הזרימה, בעוד שליטה, התאים GFP חיובי לא יזוהו ב HIV-1 נגוע CEM-SS תאים. אם הניסויים מבוצעים בהצלחה, וקטור Rev-מותנה lentiviral, vNL-GFP-RRE-SA, יאפשר זיהוי ספציפי מאוד של איידס משכפלים לחיות אוכלוסיות תאים, באמצעות מדידה של חלבון פלואורסצנטי ירוק הביטוי (GFP). בדוגמה זו, שנקטפו CEM-SS תאים הוכתמו נוגדן PE-שכותרתו עכברוש חד שבטי כנגד CD24 העכבר, HSA, ונותחו לאחר מכן על cytometer זרימה הן HSA וביטוי GFP. <img src="/files/ftp_upload/2198/2198fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. כפי שמוצג כאן, אוכלוסייה גדולה של GFP זוהה HIV-1-נגועים בתאי superinfected עם vNL-GFP-RRE-SA (איור 1 ג'). לעומת זאת, התאים GFP חיובי לא התגלו או CEM-SS תאים HIV-1 נגוע ללא superinfection lentiviral (איור 1 א) או HIV-1 לתאים נגוע עם superinfection lentiviral (איור 1b).

<ol><li>Garcia, J. A., Wu, F. K., Mitsuyasu, R., Gaynor, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+cellular+proteins+involved+in+the+transcriptional+regulation+of+the+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Interactions of cellular proteins involved in the transcriptional regulation of the human immunodeficiency virus.</a> EMBO Journal. 6, 3761-3770 (1987).</li>
<li>Merzouki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+gp120%2F160+expressing+cells+upregulate+HIV-1+LTR+directed+gene+expression+in+a+cell+line+transfected+with+HIV-1+LTR-reporter+gene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%22%5BJournal%5D)">HIV-1 gp120/160 expressing cells upregulate HIV-1 LTR directed gene expression in a cell line transfected with HIV-1 LTR-reporter gene constructs.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand. 41, 445-452 (1995).</li>
<li>Aguilar-Cordova, E., Chinen, J., Donehower, L., Lewis, D. E., Belmont, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+reporter+cell+line+for+HIV-1+tat+activity%2C+HIV-1+inhibitors%2C+and+T+cell+activation+effects%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">A sensitive reporter cell line for HIV-1 tat activity, HIV-1 inhibitors, and T cell activation effects.</a> AIDS Res Hum Retroviruses. 10, 295-301 (1994).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+lentiviral+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent lentiviral expression vector.</a> Retrovirology. 4, 12-12 (2007).</li>
<li>Wu, Y., Beddall, M. H., Marsh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-dependent+indicator+T+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Current+HIV+Research%22%5BJournal%5D)">Rev-dependent indicator T cell line.</a> Current HIV Research. 5, 395-403 (2007).</li>
<li>Young, J., Tang, Z., Yu, Q., Yu, D., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+killing+of+HIV-1-positive+macrophages+and+T+Cells+by+the+Rev-dependent+lentivirus+carrying+anthrolysin+O+from+Bacillus+anthracis%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Selective killing of HIV-1-positive macrophages and T Cells by the Rev-dependent lentivirus carrying anthrolysin O from Bacillus anthracis.</a> Retrovirology. 5, 36-36 (2008).</li>
<li>Perez, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1-infected+T+cell+clone+defective+in+IL-2+production+and+Ca2%2B+mobilization+after+CD3+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An HIV-1-infected T cell clone defective in IL-2 production and Ca2+ mobilization after CD3 stimulation.</a> Journal of Immunology. 147, 3145-3148 (1991).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כמו עם תאת תלויי וקטורים התפתחה בשלב מוקדם יותר ביטוי, מערכת Rev המתואר כאן הוא ניצול של תהליך התפתח HIV. הכללת Rev-התלות הופכת את וקטור מבוססי LTR הביטוי תלויה מאוד בנוכחות של שכפול ה-HIV. היישום של וקטור זה כפי שדווח כאן, וירוס ה-HIV תלויי הכתב, מציעה גישה חדשה הרומן לזהות נשאי HIV לתאים. וקטור מאפשר בדיקה של תאים חיים, יכול לבטא את כל הגן לניסויים בסיסי או קליני, כמו lentivirus פסאודו הקלדת יש גישה סוגי תאים ורקמות ביותר.

<table><tbody><tr><td>מטריצת בטיחות ביולוגית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 5%CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; אינקובטור</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td></td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>אלגה&amp;#174;6KR</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;#x00B0;מקרר C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;#x00B0;מקרר C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> -80&amp;#x00B0;מקרר בטמפרטורה של C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>סופר תאים</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>סלומטר (Cellometer)&amp;#174; AutoT4</td><td></td></tr><tr><td>קו תאי HEK293T</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות (National Institutes of Health)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קו תאי CEM-SS</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קו תאי Jurkat J1.1</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870</td><td></td></tr><tr><td>FBS מועשר בחלבונים (Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum)</td><td>Invitrogen</td><td>10438-018</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1&lt;sub&gt;NL4-3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>הוכנו על ידי טרנספקציה של תאי HeLa ב-DNA פרו-ויראלי משובט</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE</td><td></td><td></td><td>מחיקה מלאה של כל מסגרות הקריאה הפתוחות (ORFs) של HIV מתוך pNL4-3</td></tr><tr><td>pNL-GFP-RRE-SA</td><td></td><td></td><td>הכנסת HIV-1 A5 ו-D4 אל pNL-GFP-RRE</td></tr><tr><td>pCMV&amp;#916;8.2</td><td></td><td></td><td>סופק על ידי ד"ר Dider Trono</td></tr><tr><td>pHCMV-G</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x HBS (מלחים במאזן Hepes)</td><td>Invitrogen</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>2M CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; בופר</td><td>Invitrogen</td><td>S-013-154-10</td><td></td></tr><tr><td>1% פאראפורמאלדהיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>חומר הלבנה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מבחנות פאלקון (Falcon) בנפח 50 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>358206</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות עם תחתית עגולה בנפח 5 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>0.45&amp;mu;מסנן Millipore M</td><td>EMD Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>0.20&amp;mu;מסנן Millipore M</td><td>EMD Millipore</td><td>SLFG85000</td><td></td></tr><tr><td>צלח פטרי 100 מ"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>עמודת הפרדה על בסיס גודל (סף חיתוך של 100,000MW)</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2041</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה להקפאה בנפח 2 מ"ל</td><td>Axygen Scientific</td><td>SCT-200</td><td></td></tr><tr><td>פלטה בעלת 96 בארות</td><td>BD Biosciences</td><td>353227</td><td></td></tr><tr><td>מבחנת מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT- 175-C</td><td></td></tr></tbody></table>

סימון ספציפיות של hiv-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

Specific Marking of HIV-1 Positive Cells using a Rev-dependent Lentiviral Vector Expressing the Green Fluorescent Protein

רוב HIV-תגובה וקטורים ביטוי מבוססים על האמרגן HIV, לחזור מסוף ארוך (LTR). בעוד מגיבים חלבון ה-HIV מוקדם, תאת, LTR הוא גם מגיב למצבים ההפעלה הסלולרית לפעילות הכרומטין המקומי שבו האינטגרציה התרחשה. זה יכול לגרום ל-HIV פעילות עצמאית גבוהה, הגביל את השימושיות של הכתב LTR מבוססי תאים סימן נשאיות 1,2,3. הנה, אנחנו נבנה וקטור ביטוי lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת-תגובה, מספר רב של רצפי דנ&quot;א HIV הכוללים את אלמנט Rev-HIV בתגובה אתרי שחבור 4,5,6. וקטור שולב וירוס כתב lentiviral, המתיר גילוי ספציפי מאוד של שכפול ה-HIV בקרב אוכלוסיות תא חי. הפעילות של וקטור נמדדה על ידי ביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). היישום של וקטור זה כפי שדווח כאן מציעה גישה חלופית הרומן השיטות הקיימות, כגון PCR באתרו או מכתים HIV אנטיגן, לזהות נשאי HIV לתאים. וקטור יכול גם לבטא גנים טיפוליים לניסויים קליניים בסיסיים או למקד נשאי HIV לתאים.

פיתחנו וקטור lentiviral שיש לה, בנוסף LTR תאת מגיב, את אלמנט Rev-תגובה (RRE) כי ניתן לווסת את ביטוי הגן הכתב בצורה HIV-1 ו-תאת Rev-מותנה. וקטור מאפשר את זיהוי ספציפי של שכפול HIV בתאים חיים באמצעות ביטוי ה-GFP.

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

מרבית וקטורי הביטוי המגיבים ל-HIV מבוססים על מקדם ה-HIV, החזרה הטרמינלית הארוכה (LTR). בעוד שהם מגיבים לחלבון HIV מוקדם, Tat, ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות תאים חיוביים ל-HIV באמצעות וקטור לנטיבירי תלוי-rev של HIV-1 הנושא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור חלקיקים לנטיביריים תלויי-rev באמצעות קו-טרנספקציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא הדבקת תאי T מסוג CD4 אנושיים עם HIV-1.בשלב הבא, תאי CD4 T אנושיים חיוביים ל-HIV עוברים זיהום-על (super infection) עם חלקיקים לנטיביריאליים הנושאים את הגן GFP. השלב הסופי הוא זיהוי תאים חיוביים ל-HIV על ידי מדידת תאים חיוביים ל-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את אחוז התאים החיוביים ל-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אל עבר טיפול בזיהום HIV, בשל העובדה שהווקטור התלוי ב-rev יכול גם להוביל ולבטא באופן סלקטיבי גנים טיפוליים בתאים נגועים ב-HIV כדי להוביל להשמדת תאים חיוביים ל-HIV. את הפרוצדורה ידגים gi, פרופסור עוזר מחקר מהמעבדה שלנו. כדי לייצר חלקיקי לנטי-וירוס תלויי rev, מבצעים טרנספקציה של תאי HEK 293T עם שלושה פלסמידים: הווקטור הלנטי-וירוסי GFP התלוי ב-rev, מבנה אריזה של HIV-1 ופלסמיד הנושא את הגליקופרוטאין VSVG. יום אחד לפני הטרנספקציה של הפלסמידים, זורעים 2×10⁶ תאי HEK 293T ב-10 milliliters של מצע גידול.בצלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר. גדלו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. למחרת, החליפו את העליון (supernatant) של התאים בחמישה מיליליטר של מצע טרי.לאחר מכן, המשיכו לגדל את התאים במשך ארבע שעות ב-37 °C, 5% carbon dioxide. הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה לפני סיום דגירה של ארבע השעות. תאי HEK 2 93 T יעברו טרנספקציה עם שלושת הפלסמידים ביחס של 10 µg של וקטור לנטי-ויראלי GFP תלוי-rev, 7.5 µg של מבנה אריזה HIV one ו-2.5 µg של גליקופרוטאין VSVG.ראשית, ערבבו מראש את שלושת ה-plasmid DNAs ביחס הרצוי. לאחר מכן, הכינו שתי מבחנות פוליסטירן של 5 milliliters. הוסיפו 480 microliters של HBS buffer בריכוז two times למבחנה הראשונה ולמבחנה השנייה.הוסף 60 µL של בופר calcium chloride בריכוז 2 M ל-DNAs של הפלזמה ולבופר הטרנספקציה, עד לנפח כולל של 480 µL. לאחר מכן, הוסף את תערובת ה-DNA של הפלזמה וה-calcium chloride בטיפות למבחנת ה-2× HPS, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.משקע דק ייווצר בהדרגה. כעת, הוסיפו את כל 960 µL של התערובת בטפטוף באמצעות פיפטה לתאי HEK 2 9 3 T. דגרו ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך הלילה.ביום למחרת, הסיר את העלייה (supernatant) והוסף 10 milliliters של מצע טרי. דגירה את התאים שוב בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide למשך לילה. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, אסוף את הנגיף על ידי הסרת העלייה והעברתה למבחנה סטרילית של 50 milliliter.הוסיפו 10 milliliters של מצע טרי לצלחת הפטרי והמשיכו בתרבית למשך הלילה. אחסנו את העלייה של הווירוס בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. המשיכו באיסוף ב-72 שעות לאחר הטרנספקציה על ידי איסוף ה-SUP natant ומיזוגו עם ה-sup natant שנאסף קודם לכן.לאחר מכן, סבב במצנטריפוגה את הסופרנאט S במהירות של 500 ×g למשך 15 דקות כדי לשקיע ולהסיר שיירי תאים. לאחר הסבב במצנטריפוגה, אסוף את הסופרנאט S והעבר אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, סנן את הסופרנאט דרך מסנן millipore של 0.22 µm.הנגיף ירוכז עוד יותר באמצעות עמודת הפרדה לפי גודל (size exclusion column), שתודגם כעת לריכוז חלקיקי נגיף. טענו את העלייה (supinate) הנגיפית אל עמודת הפרדה לפי גודל וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 6,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות. אספו את העלייה הנגיפית המרוכזת, והפרישו כ-100 µL לקביעת הטיטר הנגיפי.חלקו את השארית לאליקווטות ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80°C- . קביעת הטיטר הוויראלי היא אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוצדורה זו. ריכוז גבוה יותר של מולטיפליסיטי של זיהום (MOI) נדרש לצורך זיהום יעיל של תאים עם וקטור ה-GFP VIR.על מנת לקבל אחוז של תאים חיוביים ל-GFP הניתנים לזיהוי באמצעות ציטומטריה עם זרימה לצורך קביעת הטיטר הווירוסלי, תבצע הדבקה של שורת תאי jerk cat חיוביים ל-HIV V1 שטופלו ב-TNF באמצעות העלייה הווירוסלית (viral supinate). תאים אלו, החיוביים ל-HIV V1, גודלו בתרבית.בפלטת 96 בארות בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים למילליליטר בנפח כולל של 100 µL. הכין שש דילולות סדרתיות של פי עשרה של החלקיקים הלנטיביריאליים התלויים ב-rev להדבקת התאים החיוביים ל-HIV-1. הוסף 100 µL מכל דילול סדרתי של הנגיף לכל בארת תאים. הדגר באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שבעה ימים.את טטר של החלקיקים מעריכים באמצעות תצפית על תאים חיוביים ל-GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החישובים מבוצעים לפי השיטה של Reid ו-MU, והטטר נקבע כנקודת הדילול שיכולה להוביל לבארים חיוביות ל-GFP. ב-50% מהבארים שהודבקו בסימון IV נצפו תאים חיוביים עם חלקיקים לנטיביריריים תלויי-rev.שורת תאי T CD4 אנושיים תודבק תחילה ב-HIV-1. נשתמש ב-2×10⁵ תאים לכל הדבקה. שעתיים לפני ההדבקה.הוסיפו poly brain לתאים עד לריכוז סופי של 4 µg/mL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הדביקו את התאים על ידי הוספת תמיסת HIV לאחד ממבחנות ה-5 mL.שתי המבחנות האחרות של התאים אינן מזוהמות וישמשו כביקורות. דגרו את כל התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר שעתיים, סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 10 דקות, שטפו את הנגיפים החופשיים על ידי השלכת הנוזל העליון (supernatant) והשביו את התאים בתווך טרי בריכוז של 2 × 10⁵ תאים למיליליטר; דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות.לאחר 48 שעות, התאים המודבקים ב-HIV מוכנים להדבקה. עבור חלקיקי lentiviral תלויי rev, השתמשו בשני פעמים 10⁵ תאים להדבקה עם 100 µL של חלקיקי lentiviral לתאים המודבקים ב-HIV V1; כביקורת, תאי T CD4 אנושיים שאינם מודבקים ב-HIV V1 מודבקים אף הם עם 100 µL של חלקיקי lentiviral. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, וביום למחרת.החליפו את המצע המרוקן במצע טרי ושחזרו את התאים בריכוז של 2×10⁵ תאים למיליליטר. 48 שעות לאחר ההדבקה, השקיפו את התאים באמצעות סרכזגופה ולאחר מכן שחזרו אותם ב-500 µL של 1% Paraformaldehyde. העבירו את התאים המשוחזרים לשפורת ציטומטריית זרימה לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, ניתן לנתח את התאים במכשיר fax scan analyzer לבדיקת חיוביות ל-GFP.אם הניסויים יבוצעו בהצלחה, הווקטור הלנטיבירי V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A, התלוי בשכפול (rev dependent), יאפשר זיהוי ספציפי מאוד של HIV משתכפל באוכלוסיות של תאים חיים באמצעות מדידה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק GFP. בדוגמה זו, תאי C-E-M-S-S שנאספו נצבעו בנוגדן מונוקלונלי של חולדה המסומן ב-PE נגד mouse CD 24 HSA, ולאחר מכן נותחו בציטומטר זרימה לבדיקת ביטוי של HSA ו-GFP, כפי שמוצג כאן. אוכלוסיית GFP ניכרת זוהתה בתאים שנדבקו ב-HIV one ועברו זיהום-על עם V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.לעומת זאת, לא זוהו תאים חיוביים ל-GFP הן בתאי C-E-M-S-S שאינם נגועים ב-HIV V ללא זיהום-על לנטיווירוס, והן בתאים שאינם נגועים ב-HIV one עם זיהום-על לנטיווירוס. זכרו כי עבודה עם HIV עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון רמות בטיחות ביולוגית (biosafety levels) ונהלים מתאימים, בעת ביצוע הליך זה.

specific-marking-hiv-1-positive-cells-using-rev-dependent-lentiviral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

ניסוי זה הוא מדריך חזותי עבור ניצול שיבוט מולקולרי פלואורסצנטי של HIV עבור לחיות ניסויים הדמיה confocal.

חזותי Cell ל-תא העברה של HIV באמצעות המשובטים פלורסנט של HIV מיקרוסקופיה confocal חיים

דרכי הביטוי lentiviral הם כלי הרכב היעיל ביותר עבור ביציבות להביע מפעיל מולקולות שונות או ובונה הכתב בחלוקת ולא חלוקת בתאי יונקים ואורגניזמים שלמים. כאן אנו מספקים פרוטוקול על איך לארוז בונה ביטוי lentivector בחלקיקי pseudoviral וכדי transduce תאים היעד באמצעות חלקיקים pseudoviral.

אריזות ל-HIV או FIV מבוססי בונה הביטוי Lentivector שימוש התמרה של VSV-G חלקיקים נגיפיים Pseudotyped

אנו מתארים שיבוט מולקולרי של הנגיף maedi-visna המבטא GFP ו מדבק לחלוטין. שכפול של וירוס זה ניתן לגילוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry הזרימה.

הפצת ועל גילוי Clone מולקולרית זיהומיות של וירוס Maedi-visna המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק

זיהוי של רנ&quot;א נגיפי על ידי הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים)

בפרוטוקול זה אנו מתארים, ייצור טיהור טיטרציה של וקטורים lentiviral. אנו מספקים דוגמה משלוח וקטור בתיווך lentiviral הגן בנוירונים בתרבית ו האסטרוציטים ראשוניים. השיטות שלנו עשוי לחול גם על סוגי תאים...

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

מאז גילוי גן החלבון הפלואורסצנטי הירוק, חלבונים פלואורסצנטיים השפיעו על הביולוגיה המולקולרית של התא. פרוטוקול זה מתאר כיצד ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים מובחנים באמצעות הנדסה גנטית משמש לברקוד תאים בודדים. ההליך מאפשר מעקב אחר אוכלוסיות שונות בתערובת תאים, שהיא אידיאלית עבור יישומים מרובים.

Barcoding הגנטי עם חלבונים ניאון עבור יישומי Multiplexed

אנו מתארים וזמינותו מבוססת תא לדווח על HIV-1 היתוך באמצעות הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי על ידי מיקרוסקופ לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית. זה יכול לשמש כדי לבדוק את מעכבי נגיפי כניסה (במיוחד בשלב fusion) במערכות זיהום תא ולתא.

Cre-עצלן תפוקה גבוהה מופעל ממברנה ויראלי Assay פיוז'ן לזהות מעכבי של היתוך ממברנה נגיפי HIV-1

פרוטוקול תפוקה גבוהה עבור הערכה תפקודית של הפעלה מחדש יעיל HIV ואישור של הפרו-וירוס החבויים תיאר, המיושם על ידי בדיקת ההשפעה של התערבויות ב- HIV שעתוק, שחבור. התוצאות נציג השפעת השהיית היפוך סוכנים על שעתוק מונחה-LTR, החדרת הינם מסופקים.

תפוקה גבוהה בחוץ גופית הערכה של השהיה היפוך סוכנים על HIV שעתוק ו שחבור

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

מוצג כאן פרוטוקול לגישת הדמיה פלואורסצנטית, multiplex immunofluorescent c ell-based detection של DNA, RNA, ו- protein (MICDDRP), שיטה המסוגלת להדמיה פלואורסצנטית סימולטנית חד-תאית של חלבונים נגיפיים וחומצות גרעין מסוג וגדילה שונים. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מערכות.

הדמיה פלואורסצנטית מרובת תאים בודדים כדי לדמיין חומצות גרעין וחלבונים ויראליים ולפקח על HIV, HTLV, HBV, HCV, נגיף זיקה וזיהום שפעת

אנו מדגימים פרוטוקול שלב אחר שלב לחקר תפקוד גנים במקרופאגים שוכנים ברקמת הצפק in vivo, באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים.

הכנה וקטורית לנטיויראלית לאפנון יעיל של גנים ומיקרו-רנ"א של מקרופאגים שוכנים ברקמת חלל הצפק in vivo בעכברים

למדו לזהות תאים נגועי HIV-1 באמצעות וקטור lentiviral תלוי Rev המביע GFP. השיטה משתמשת בזרימה ציטומטרית לכימות תאים חיוביים ומציעה יישומים טיפוליים בזיהוי וטיפול ב-HIV.

סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

גלה סרטונים נוספים