סימון ספציפיות של HIV-1 תאים חיוביים באמצעות וקטור Rev-מותנה lentiviral מבטא את חלבון פלואורסצנטי ירוק

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות תאים חיוביים ל-HIV באמצעות וקטור לנטיבירי תלוי-rev של HIV-1 הנושא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק. דבר זה מושג תחילה על ידי ייצור חלקיקים לנטיביריים תלויי-rev באמצעות קו-טרנספקציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא הדבקת תאי T מסוג CD4 אנושיים עם HIV-1.

בשלב הבא, תאי CD4 T אנושיים חיוביים ל-HIV עוברים זיהום-על (super infection) עם חלקיקים לנטיביריאליים הנושאים את הגן GFP. השלב הסופי הוא זיהוי תאים חיוביים ל-HIV על ידי מדידת תאים חיוביים ל-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את אחוז התאים החיוביים ל-GFP באמצעות ציטומטריית זרימה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות אל עבר טיפול בזיהום HIV, בשל העובדה שהווקטור התלוי ב-rev יכול גם להוביל ולבטא באופן סלקטיבי גנים טיפוליים בתאים נגועים ב-HIV כדי להוביל להשמדת תאים חיוביים ל-HIV. את הפרוצדורה ידגים gi, פרופסור עוזר מחקר מהמעבדה שלנו. כדי לייצר חלקיקי לנטי-וירוס תלויי rev, מבצעים טרנספקציה של תאי HEK 293T עם שלושה פלסמידים: הווקטור הלנטי-וירוסי GFP התלוי ב-rev, מבנה אריזה של HIV-1 ופלסמיד הנושא את הגליקופרוטאין VSVG. יום אחד לפני הטרנספקציה של הפלסמידים, זורעים 2×10⁶ תאי HEK 293T ב-10 milliliters של מצע גידול.

בצלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר. גדלו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. למחרת, החליפו את העליון (supernatant) של התאים בחמישה מיליליטר של מצע טרי.

לאחר מכן, המשיכו לגדל את התאים במשך ארבע שעות ב-37 °C, 5% carbon dioxide. הכינו את ריאגנטים הטרנספקציה לפני סיום דגירה של ארבע השעות. תאי HEK 2 93 T יעברו טרנספקציה עם שלושת הפלסמידים ביחס של 10 µg של וקטור לנטי-ויראלי GFP תלוי-rev, 7.5 µg של מבנה אריזה HIV one ו-2.5 µg של גליקופרוטאין VSVG.

ראשית, ערבבו מראש את שלושת ה-plasmid DNAs ביחס הרצוי. לאחר מכן, הכינו שתי מבחנות פוליסטירן של 5 milliliters. הוסיפו 480 microliters של HBS buffer בריכוז two times למבחנה הראשונה ולמבחנה השנייה.

הוסף 60 µL של בופר calcium chloride בריכוז 2 M ל-DNAs של הפלזמה ולבופר הטרנספקציה, עד לנפח כולל של 480 µL. לאחר מכן, הוסף את תערובת ה-DNA של הפלזמה וה-calcium chloride בטיפות למבחנת ה-2× HPS, והדגר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

משקע דק ייווצר בהדרגה. כעת, הוסיפו את כל 960 µL של התערובת בטפטוף באמצעות פיפטה לתאי HEK 2 9 3 T. דגרו ב-37 °C, 5% carbon dioxide למשך הלילה.

ביום למחרת, הסיר את העלייה (supernatant) והוסף 10 milliliters של מצע טרי. דגירה את התאים שוב בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, 5% carbon dioxide למשך לילה. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, אסוף את הנגיף על ידי הסרת העלייה והעברתה למבחנה סטרילית של 50 milliliter.

הוסיפו 10 milliliters של מצע טרי לצלחת הפטרי והמשיכו בתרבית למשך הלילה. אחסנו את העלייה של הווירוס בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. המשיכו באיסוף ב-72 שעות לאחר הטרנספקציה על ידי איסוף ה-SUP natant ומיזוגו עם ה-sup natant שנאסף קודם לכן.

לאחר מכן, סבב במצנטריפוגה את הסופרנאט S במהירות של 500 ×g למשך 15 דקות כדי לשקיע ולהסיר שיירי תאים. לאחר הסבב במצנטריפוגה, אסוף את הסופרנאט S והעבר אותו למבחנה חדשה. לאחר מכן, סנן את הסופרנאט דרך מסנן millipore של 0.22 µm.

הנגיף ירוכז עוד יותר באמצעות עמודת הפרדה לפי גודל (size exclusion column), שתודגם כעת לריכוז חלקיקי נגיף. טענו את העלייה (supinate) הנגיפית אל עמודת הפרדה לפי גודל וסובבו בצנטריפוגה במהירות של 6,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 15 דקות. אספו את העלייה הנגיפית המרוכזת, והפרישו כ-100 µL לקביעת הטיטר הנגיפי.

חלקו את השארית לאליקווטות ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80°C- . קביעת הטיטר הוויראלי היא אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוצדורה זו. ריכוז גבוה יותר של מולטיפליסיטי של זיהום (MOI) נדרש לצורך זיהום יעיל של תאים עם וקטור ה-GFP VIR.

על מנת לקבל אחוז של תאים חיוביים ל-GFP הניתנים לזיהוי באמצעות ציטומטריה עם זרימה לצורך קביעת הטיטר הווירוסלי, תבצע הדבקה של שורת תאי jerk cat חיוביים ל-HIV V1 שטופלו ב-TNF באמצעות העלייה הווירוסלית (viral supinate). תאים אלו, החיוביים ל-HIV V1, גודלו בתרבית.

בפלטת 96 בארות בריכוז של 2.5 × 10⁵ תאים למילליליטר בנפח כולל של 100 µL. הכין שש דילולות סדרתיות של פי עשרה של החלקיקים הלנטיביריאליים התלויים ב-rev להדבקת התאים החיוביים ל-HIV-1. הוסף 100 µL מכל דילול סדרתי של הנגיף לכל בארת תאים. הדגר באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך שבעה ימים.

את טטר של החלקיקים מעריכים באמצעות תצפית על תאים חיוביים ל-GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החישובים מבוצעים לפי השיטה של Reid ו-MU, והטטר נקבע כנקודת הדילול שיכולה להוביל לבארים חיוביות ל-GFP. ב-50% מהבארים שהודבקו בסימון IV נצפו תאים חיוביים עם חלקיקים לנטיביריריים תלויי-rev.

שורת תאי T CD4 אנושיים תודבק תחילה ב-HIV-1. נשתמש ב-2×10⁵ תאים לכל הדבקה. שעתיים לפני ההדבקה.

הוסיפו poly brain לתאים עד לריכוז סופי של 4 µg/mL. דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הדביקו את התאים על ידי הוספת תמיסת HIV לאחד ממבחנות ה-5 mL.

שתי המבחנות האחרות של התאים אינן מזוהמות וישמשו כביקורות. דגרו את כל התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר שעתיים, סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 10 דקות, שטפו את הנגיפים החופשיים על ידי השלכת הנוזל העליון (supernatant) והשביו את התאים בתווך טרי בריכוז של 2 × 10⁵ תאים למיליליטר; דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 48 שעות.

לאחר 48 שעות, התאים המודבקים ב-HIV מוכנים להדבקה. עבור חלקיקי lentiviral תלויי rev, השתמשו בשני פעמים 10⁵ תאים להדבקה עם 100 µL של חלקיקי lentiviral לתאים המודבקים ב-HIV V1; כביקורת, תאי T CD4 אנושיים שאינם מודבקים ב-HIV V1 מודבקים אף הם עם 100 µL של חלקיקי lentiviral. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, וביום למחרת.

החליפו את המצע המרוקן במצע טרי ושחזרו את התאים בריכוז של 2×10⁵ תאים למיליליטר. 48 שעות לאחר ההדבקה, השקיפו את התאים באמצעות סרכזגופה ולאחר מכן שחזרו אותם ב-500 µL של 1% Paraformaldehyde. העבירו את התאים המשוחזרים לשפורת ציטומטריית זרימה לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, ניתן לנתח את התאים במכשיר fax scan analyzer לבדיקת חיוביות ל-GFP.

אם הניסויים יבוצעו בהצלחה, הווקטור הלנטיבירי V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A, התלוי בשכפול (rev dependent), יאפשר זיהוי ספציפי מאוד של HIV משתכפל באוכלוסיות של תאים חיים באמצעות מדידה של ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק GFP. בדוגמה זו, תאי C-E-M-S-S שנאספו נצבעו בנוגדן מונוקלונלי של חולדה המסומן ב-PE נגד mouse CD 24 HSA, ולאחר מכן נותחו בציטומטר זרימה לבדיקת ביטוי של HSA ו-GFP, כפי שמוצג כאן. אוכלוסיית GFP ניכרת זוהתה בתאים שנדבקו ב-HIV one ועברו זיהום-על עם V-N-L-G-F-P-R-R-E-S-A.

לעומת זאת, לא זוהו תאים חיוביים ל-GFP הן בתאי C-E-M-S-S שאינם נגועים ב-HIV V ללא זיהום-על לנטיווירוס, והן בתאים שאינם נגועים ב-HIV one עם זיהום-על לנטיווירוס. זכרו כי עבודה עם HIV עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון רמות בטיחות ביולוגית (biosafety levels) ונהלים מתאימים, בעת ביצוע הליך זה.