Name: Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: למד לזהות תגובות תאי T לאנטיגנים ספציפיים באמצעות שיטת ELISPOT. השיטה מאפשרת כימות ציטוקינים וניתוח יחידות יוצרות כתמים במחלות אידיופתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך בחלקו על ידי מענק ונדרבילט CTSA 1 UL1 RR024975 של המרכז הלאומי למשאבי מחקר, המכונים הלאומיים לבריאות. עבודה זו מומנה על ידי NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.

בשביל הפרוטוקול הבא, אנו משתמשים בתאי דם היקפיים mononuclear (PBMC) כמו התאים של עניין. עם זאת, פרוטוקול זה ניתן להשתמש עם סוגי תאים אחרים. בצע את assay במנדף רקמות התרבות באמצעות טכניקה סטרילית. יום 1: הכנת צלחת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את הצלחת ELISPOT ופתח אותו למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 150 μL של 1X PBS באמצעות pipettor רב, אם ניתן, גם pipetting יחיד אחרת מקובל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את חבילת מאגרים לפתוח אותו למכסה המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של הנוגדן ללכוד, אנטי אנושי אינטרפרון-γ, עד 11 MLS של 1X PBS. וורטקס היטב. העברת תערובת נוגדנים למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μL של הפתרון ציפוי זה לתוך זה גם שימוש רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את הצלחת parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת במקרר למשך הלילה. הצלחות טובים במשך שבועות. כלל האצבע הוא שאם יש עדיין נשאר נוזלי את הבארות, את הצלחת יכול לשמש. </li></ol> תא הכנה אם PBMCs הם טריים ואז לספור את התאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2. עבור PBMC מאוחסנים חנקן נוזלי, מפשיר של תאים הכרחי. הפרוטוקול הוא כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה cryovial של תאים 37 ° C אמבט מים עד מופשר כמעט לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מיד ב 5 מ"ל של R10 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין במשך 5 דקות ב 225 x ז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend שוב ב 5 מ"ל של R10 מדיה לספור את התאים קיימא באמצעות trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו הריכוז 2 x 10 6 תאים / מ"ל ב R10 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנוחה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO 2. </li></ol> יום 2: קביעת-Up פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת עם מכסה לייבל מספר זיהוי הדגימה, תנאים טוב, ותאריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 150 μL של סטרילית 1x PBS באמצעות ה-dump שיטת כתם. היזהר לא להתיז את הצלחת בעת ההטלה. הדבר עלול לגרום בארות הצלחת להפוך סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של R20 היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד צלחת הוא דוגרים, לספור את התאים היו נח בן לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין ההשעיה תא בסל"ד 1500 למשך 5 דקות. למזוג supernatant ו resuspend גלולה, כך יש לך ריכוז סופי של 1x10 6 תאים לכל 1mL ב R10 התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את R20 באמצעות ה-dump שיטת כתם. היזהר לא להתיז את הצלחת בעת ההטלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של פתרון תאים (10 5 תאים) כדי היטב כל אחד. הוסף פפטידים מתאימים ו / או אנטיגנים על בארות המקביל כפולים. השתמש קצה פיפטה חדשה בכל פעם שאתה נכנס הפתרון עובד פפטיד. ריכוז הפפטיד רגיל הוא 10-40 מיקרוגרם / מ"ל. מאז פפטידים להשתנות, כל חוקר צריך לכיל פפטידים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב בארות בקרה שלילית, רק להוסיף תאים (לא פפטידים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב בארות בקרה חיובית, להוסיף phytohemagglutinin (PHA; 10 מיקרוגרם / מ"ל; סיגמא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO 2 (~ 18 שעות). </li></ol> יום 3: פיתוח פלייט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת 6 פעמים עם 150 1xPBS μL באמצעות ה-dump שיטת כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 PBS μL היטב כל הצלחת באמצעות pipettor רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת במקרר למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קחו את הצלחת מהמקרר ומניחים אותו על מכסה המנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון נוגדן ביוטין <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של נוגדן ביוטין (מב 7-B6-1) כדי 11mL PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מתכננים להוסיף את הפתרון באמצעות רב, לשפוך אותה לתוך המאגר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS על ידי מצליף אותה לפח. היזהר לא להתיז את הצלחת בעת ההטלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 100 μL של פתרון זה לתוך זה היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת מכסה את הרקמה תרבות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 6 פעמים צלחת עם 150μL 1xPBS באמצעות ה-dump שיטת כתם. ביום לשטוף את ה 6, תשאיר את PBS על הצלחת עד שהכנת את הנוגדן streptavidin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הנוגדן streptavidin. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5.5 μ l streptavidin נוגדן (streptavidin-ALP) כדי 11mL PBS (1:2000 דילול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון וורטקס לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מתכננים להוסיף את הפתרון באמצעות רב, לשפוך אותה לתוך המאגר. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS שנותרו בארות למחוק את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של פתרון streptavidin היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת מכסה את הרקמה תרבות בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות 6 פעמים עם PBS באמצעות ה-dump שיטת כתם. ביום לשטוף את ה 6, תשאיר את PBS על הצלחת עד שביצעת את הפתרון צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה בחושך. הכן את phosphatase אלקליין המצע פתרון (אלקליין תשתית phosphatase ערכת IV BCIP / NBT): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 4 טיפות של ריאגנט המצע 1-11 מ"ל טריס חיץ, מערבולת היטב. הוסף 4 טיפות של ריאגנט המצע 2 עד טריס חיץ, מערבולת היטב. הוסף 4 טיפות של ריאגנט המצע 3 עד טריס חיץ, מערבולת היטב. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS הנותרים למחוק את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של הפתרון צבע היטב כל הצלחת באמצעות רב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האור לאחר 5 עד 10 דקות של צבע מתפתחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר ריאגנטים צבע להישאר על הצלחת עד הכתמים מתחילים להפוך סגולים כהים למדי. זה אמור לקחת בין 5 עד 20 דקות. להיזהר לא להשאיר את פתרון המצע על יותר מדי זמן, כי כך עלול לגרום רקע גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת ELISPOT 3 פעמים עם מי ברז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו לייבוש למשך כשעה או לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו צלחת ידנית או עם קורא צלחת ELISPOT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הצלחת בקופסה הרחק חשיפה לאור. </li></ol> נציג תוצאות: ELISPOT נועדה לכמת את התגובה החיסונית נגד אנטיגנים של חיידקים. כל נקודה מציין התא מגיב אחד, המבטא את ציטוקינים של עניין. הכתמים ניתן לספור ידנית או באמצעות קורא צלחת ELISPOT. הערכה כי ELISPOT שבוצעה כהלכה צריך להתחיל עם החקירה של שליטה שלילי לייצור הרקע של ציטוקינים של עניין. ב בארות בקרה שלילית שהיינו מצפים לראות שום כתמים, אם כי קצת רקע (צבע סגול) רשאי להיות נוכח. בדרך כלל, לא צריך להיות פחות מהממוצע של חמש נקודות לכל טוב. בארות בקרה חיובית לאשר את התגובה שבוצעה כהלכה, וכי התאים מגיבים לגירוי antigenic. ב בארות בקרה חיובית שהיית מצפה לראות רקע סגול עמוק עקב מפגש של כתמים (Fig1). צריך להיות קצת רקע לא לבן. אם הביקורת חיובית דגימות בקרה שלילית מתאימים, אז אפשר לספור את בארות המכיל את האנטיגן של עניין. תוצאה "לא טובים", יבואו לידי ביטוי על ידי רקע גבוה (בארות הם סגול), ללא כתמים או נקודות מעטים מאוד, מרכז ריקים, כתמים מוגדר כהלכה או כתמים ומחוברות. רשימה של עצות לפתרון בעיות מסופק (טבלה 1). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/2221/2221fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. נציג צלחת ELISPOT. כל צלחת צריכה להכיל ביקורת חיובית, שליטה שלילי פפטיד של עניין שנערך מינימום של שתי בארות. C9, C10, D10 ו - D9 הם בארות שליטה חיובית, כפי שניתן לראות יש צבע סגול עמוק, תאים ומחוברות וכמעט כל רקע לבן. בארות לשלוט שליליים G11, G12, H11 ו H12. בארות אלה אין רקע סגול ואין כתמים כצפוי. נקודות ה-G7, G8, H7 ו H8, ממחישות התגובות הסלולר פפטידים חיידקים; כתמים סגולים מייצגים תא תגובה אחת ביטוי ציטוקינים של עניין. טבלה 1 <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> תצפית </td><td> בעיה אפשרית </td><td> פתרון אפשרי </td></tr><tr><td> גבוהה רקע </td><td> 1. שני הצדדים של הממברנה לא נשטף כראוי 2. יותר מדי תאים מפרישים ציטוקינים 3. פלייט לא מיובש כראוי 4. מעל צלחת שפותח </td><td> 1. שטפו את שני הצדדים של הממברנה עם מים מזוקקים לפני ואחרי התפתחות הצבע. ריאגנטים עלול לדלוף דרך הממברנה לתוך הבסיס של הבסיס, אלה יכולים לגרום רקע גבוה אם לא נשטף. 2. הפחת את מספר התאים בכל טוב, זה יחייב אופטימיזציה 3. יבש את הצלחת עוד לפני קריאת 4. לצמצם את זמן פיתוח </td></tr><tr><td> אין נקודות / כתמים מעטים </td><td> 1. לא מספיק תאים מפרישים ציטוקינים / חלבון עניין 2. ודא תאים מגורה בצורה נכונה 3. תאים לא מודגרות עבור lאונג מספיק או עלול לקחת זמן להגיב ממריץ 4. צבע לקוי פיתוח 5. לא מספיק ראשוני או משני הנוגדנים </td><td> 1. הגדלת מספר התאים. זה ידרוש אופטימיזציה 2. גם להשתמש בקרה גירוי חיובי - ממריץ שאתה יודע יניעו ביטוי של ציטוקינים שלך / חלבון עניין 3. להגדיל את זמן הדגירה התא או להשתמש בשיטה עקיפה (טרום לטפל בתאים עם ממריץ) 4. צג התפתחות צבע עם מיקרוסקופ תקורה להבטיח כי ריאגנטים בפיתוח אוחסנו כראוי ולא איבדו את פעילות 5. ריכוז הנוגדן העיקרי ו / או משנית יהיה צורך מוגבר. זה ידרוש אופטימיזציה. </td></tr><tr><td> בלנק תחומי </td><td> 1. ממברנה לא טרום טיפול 2. ממברנה התייבש בשלב כלשהו 3. תאים מופצים בצורה לא אחידה </td><td> 1. ודא קרום הוא pretreated כראוי עם אתנול 70% (ממברנות כל לא צריך את זה כדי לבדוק עם הספק שלך). לשטוף היטב עם PBS 3X לאחר מכן 2. ודא קרום לא יבש 3. ודא שאתה לערבב בעדינות את התאים יש השעיה תא הומולוגיים טוב לפני pipetting אל הבארות </td></tr><tr><td> בלנק מרכז </td><td> 1. נזקי כביסה </td><td> 1. ספיקה על מכונת כביסה אוטומטיים (או pipetting) עשוי להיות גבוה מדי. זקוק הליך כביסה עדינה יותר </td></tr><tr><td> שקר חיובי </td><td> 1. נוגדן אגרגטים משני 2. תאים עדיין על הממברנה 3. תרבית תאים זיהום </td><td> 1. סינון נוגדנים משני 2. ודאו כי כל התאים נשטפים מן הקרום עם PBS Tween 20 לפני הדגירה נוגדנים משני. תאים משמאל על הממברנה ייתן כתמים בצורת סדיר 3. שמור ריאגנטים כמו סטרילי ונקי ככל האפשר. ודא תרבות הסלולרי שלך הטכניקה aseptic. בדוק חיוביות שגויות על ידי הפעלת שליטה בתקשורת שלילית. עבור התנועה צלחת, <a href="http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&amp;rid=11457#7">לראות כתמים מוגדרים היטב</a> </td></tr><tr><td> ומחוברות כתמים </td><td> 1. ציפוי המסכן, נוגדן רב מדי 2. תא ממושכת תרבות 3. תאים מעל מגורה </td><td> 1. הפחתת ריכוז נוגדן ראשוני 2. ככל התאים מודגרת יותר, ציטוקינים / חלבון הם מפרישים. זה יגרום כתמים גדולים יותר יתחילו להתמזג ולהיות נבדל. 3. הפחת תרבית תאים צעד זמן הדגירה. גירוי יתר תגרום הרבה ציטוקינים / חלבון להיות מופרש על ידי התא. זה יהיה לייצר כתמים כי יתחילו להתמזג ולהיות נבדל. הפחת את כמות ממריץ בתקשורת תרבות או תרבות בסכום זמן קצר יותר </td></tr><tr><td> לא מוגדרים כתמים </td><td> 1. ממברנה לא טרום טיפול (אם הקרום שלך דורש את זה, לבדוק עם הספק) 2. פלייט תנועה במהלך הדגירה התא </td><td> 1. קרום חייב להיות מראש שטופלו אתנול או זה יכול לגרום, כתמים מטושטשים מוגדרים היטב. זה יהיה קשה לקורא להבחין בין אלה 2. אל תאפשר הצלחת להעביר במהלך הדגירה התא כמו תאים עברו תיצור יותר מאשר נקודה אחת. אם אפשר להשתמש חממה ייעודית כי לא ייפתחו במהלך הדגירה. אל הברז צלחת לאחר הוספת תאים </td></tr><tr><td> חיובי בקרה בארות נמוך </td><td> 1. נחשלות - עלול להיות תוצאה של שימוש streptavidin-ALP ו / או BCIP / NBT פתרונות שלא הובאו לטמפרטורת החדר </td><td> 1. תביאו ריאגנטים לטמפרטורת החדר לפני שמוסיפים את הבארות </td></tr><tr><td> צפיפות נקודות מקשה לכמת אותם </td><td> 1. תאים רבים מדי נוספו הבארות </td><td> 1. הפוך את דילולים של תאים (כלומר, 1 x 10 6, 5 x 10 5, 1 x 10 5, 5 x 10 4, 1 x 10 4 תאים לכל טוב) כדי לקבוע את המספר האופטימלי של התאים תגרום להיווצרות כתמים ברורים </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+diagnostic+evaluation+of+suspected+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis.</a> Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).</li>
<li>Sung, H. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+abdominal+tuberculosis+by+T-cell+based+assays+on+peripheral+blood+and+peritoneal+fluid+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells.</a> Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).</li>
<li>Kim, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+Central+Nervous+System+Tuberculosis+by+T-Cell-Based+Assays+on+Peripheral+Blood+and+Cerebrospinal+Fluid+Mononuclear+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).</li>
<li>Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+recognition+of+Mycobacterium+tuberculosis+ESAT-6+and+KatG+peptides+in+systemic+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis.</a> Infect Immun. 75, 527-530 (2007).</li>
<li>Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+A+antigens+derived+from+molecular+analysis+of+sarcoidosis+granulomas+elicit+systemic+Th-1+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses.</a> Respir Res. 25, 36-36 (2008).</li>
<li>Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+recent+Mycobacterium+tuberculosis+transmission+in+the+setting+of+high+HIV+and+TB+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden.</a> Thorax. 65, 315-320 (2010).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+human+T-Cell+Responses+to+Aspergillus+fumigatus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens.</a> PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).</li>
<li>Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+differentiated%2C+resting+gn-specific+memory+CD8%2B+T+cells+persist+years+after+infection+by+andes+hantavirus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).</li>
<li>Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+function+of+HIV-specific+T-cell+responses+with+increasing+time+from+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection.</a> Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay ELISPOT התפתחה כאחד מבחני החשוב ביותר בשימוש נרחב כדי לפקח על המערכת החיסונית בבני אדם וכן מגוון של מינים אחרים. עם assay ELISPOT, תדרים תא החיסון ניתן למדוד ברמת תא בודד ללא הרחבה או מניפולציה של אוכלוסיות תאים. Assay ELISPOT הוחל נרחב לחקור ספציפית אנטיגן התגובה החיסונית במחלות שונות, כולל זיהומים, סרטן, אלרגיות ומחלות אוטואימוניות. היישום של assay זה יושם בעיקר במחקרים בהם כימות של אנטיגן ספציפי לתאים הוא קריטי או השוואה של התגובה החיסונית לאנטיגן ספציפי במדינות מחלה שוני...

א הכנת מדיה <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsA.jpg" alt="חומרים"> ב הכנת מאגר טריס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 800 מ"ל של DDH 2 O ל L 1 כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 12 גרם של טריס ומוסיפים כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף hexahydrate 0.12 גרם של מגנזיום כלוריד (MgCl 2: 6 שעות 2 O) לתוך כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים עם מוט בחישה מגנטי על צלחת ערבוב אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מומס, pH 9.5 הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 200 מ"ל של DDH 2 O ל כוס, מביאים אותו עד 1000mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר. </li></ol> ג חומרים הדרושים לניתוח ELISPOT: <img src="/files/ftp_upload/2221/2221materialsb.jpg" alt="חומרים ב">

enzyme-linked immunospot assay (elispot): כימות th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

חסינות מסתגלת היא מרכיב חשוב אישור של פתוגנים תאיים. היכולת לזהות ולכמת התגובות הללו בבני אדם הוא כלי אבחוני חשוב. Assay enzyme-linked immunospot (ELISPOT) הוא צובר פופולריות ביכולתה לזהות התגובה החיסונית התאית נגד אנטיגנים של חיידקים, כולל אוכלוסיות immunosuppressed כגון אלה עם HIV, השתלה, ואת השימוש בסטרואידים. Assay זה יש את היכולת לכמת את התגובה החיסונית נגד אנטיגנים ספציפיים של חיידקים, כמו גם להבחין אם התגובות האלה Th1 או Th2 אופי. ELISPOT אינה מוגבלת לאתר של דלקת. זה צדדי ביכולתה להעריך את התגובה החיסונית בתוך דם היקפיים, כמו גם אתרים של מעורבות פעילה כגון שטיפה ברונכואלוואולרית, נוזל השדרה מוחין, מיימת. זיהוי של המערכת החיסונית כנגד אנטיגנים בודדות או מרובות אפשרי, כמו גם epitopes חלבונים ספציפיים בתוך חיידקים. Assay זה מאפשר זיהוי של המערכת החיסונית לאורך זמן, כמו גם הבחנות מוכר על ידי אנטיגנים לתאי T הפונדקאי. Dual ELISPOT מבחני צבע זמינים עבור גילוי של ביטוי סימולטני של שני ציטוקינים. יישומים אחרונים של טכניקה זו כוללים אבחנה של שחפת extrapulmonary, כמו גם חקירה של התרומה של אנטיגנים זיהומיות למחלות אוטואימוניות.

זיהוי מטרות מיקרוביאלי של חסינות אדפטיבית במחלות אידיופטית ניתן להשיג על ידי שימוש assay האנזים צמוד immunospot.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

חסינות נרכשת היא מרכיב חשוב בסילוק של פתוגנים תוך-תאיים. היכולת לזהות ולכמת תגובות אלו בבני אדם היא...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות תגובות של תאי T לאנטיגנים רלוונטיים. דבר זה מושג תחילה על ידי קידוד באמצעות נוגדני לכידה. השלב השני של הפרוצדורה הוא הוספת תאים ואנטיגנים רלוונטיים ולאחר מכן דגירה למשך לילה.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת נוגדני זיהוי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא פיתוח הפלטה באמצעות ריאגנטים של סובסטרט וניתוח הנקודות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המזהות ציטוקינים רלוונטיים באמצעות ניתוח של יחידות יוצרות נקודות (spot forming units).שלום, שמי ד"ר Ki Richter ואני מרצה למחקר במעבדתו של ד"ר Wonder Drake באוניברסיטת ונדרבילט, בחטיבה למחלות זיהומיות. היום אנו נדגים את טכניקת ה-ELISpot, הידועה גם כבדיקת ELISpot (immuno spot assay) מקשורה לאנזים. ד"ר Isfahan chambers ו-Tiffany Cone ידגימו עבורכם את הטכניקה היום.על מנת לשמור על סטנדרטים של תרביות תאים, בצע את המניפולציות בתנאים סטריליים בתוך המבתר, פתח פלטת בארות מסוג ally spot plate ושטוף שלוש פעמים עם PBS. הכן תמיסת ציפוי של הנוגדן הלוכד ב-PBS. ערבב היטב באמצעות וורטקס לנוחות העבודה.העבירו את תמיסת הנוגדנים למאגר עבור פיפט רב-ערוצי וחלקו 100 µL מתמיסת הציפוי לכל באר. אטמו את הפלטה בעזרת פילם והניחו במקרר למשך לילה. פלטות אלו, המצופות בנוגדנים, נשמרות למשך שבועות.כלל האצבע קובע שניתן להשתמש בלוחית כל עוד נותר נוזל בבארות. כדי להכין את התאים לבדיקה זו, צבעו תאים מונונוקלאריים של דם פריפרי (PBMC) שבודדו זה עתה ב-tripan blue לבדיקת חיוניות וספרו אותם. זרקו את ה-PBMC בריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר ב-10 מ"ל מדיום והדגירו אותם למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. כדי לעקוב אחר הניסוי, סמנו את מכסה לוחית ה-Ali spot עם מספר זיהוי הדגימה, תנאי הבארות והתאריך.שטפו את הפלטה שש פעמים עם PBS סטרילי באמצעות שיטת השפיכה והספיגה (dump and blot). היזהרו לא להתיז מהפלטה בזמן השפיכה, שכן הדבר עלול לגרום לבארות בפלטה להפוך לסגולות. הוסיפו 20 µL מתווך לכל בארה והדגרימו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.בזמן שהפלטה דוגרת, ספרו את התאים שנחו במהלך הלילה. אספו את ה-pbmc באמצעות סנטריפוגה. שפכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את המשקע ב-10 מצעי גידול בריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר.לאחר דגירה של שעה אחת של פלטת נקודות ה-ally, הסירו את מצע ה-R 20 באמצעות שיטת השפיכה והניגוב (dump and blot). היזהרו לא להתיז נוזלים על הפלטה במהלך השפיכה. הוסיפו 100 µL של תרחיף תאים לכל נקודה.יש לעקוב אחר התכנון הניסיוני עם הוספת פפטידים ואנטיגנים לבארי הבדיקה המתאימים. יש לכלול תמיד ביקורת שלילית של תאים ללא פפטידים וכן בארי ביקורת חיובית עם פיתוהמוגלוטינין מוסף. יש להדגיר את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.שטפו את הפלטה שש פעמים עם 150 µL של XPBS בשיטת הריקון והספיגה (dump and blot). הוסיפו 100 µL של PBS לכל באער בפלטה והניחו את הפלטה במקרר או בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בינתיים, הכינו את תמיסת הנוגדן המסומן בביוטין ב-PBS.הוציאו את פלטת ה-ALI spot מהמקרר והשליכו את ה-PBS על ידי נטילתו לסל המיחזור. היזהרו שלא להתיז מהפלטה בעת מזיגת מנה של תמיסת הנוגדן הביוטין לכל באר, והדגירו את הפלטה במ hút תרביות רקמה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את הפלטה שישה פעמים עם PBS, כאשר בשטיפה האחרונה השתמשו בשיטת השליכה והספיגה (dump and blot).השאירו כעת את ה-PBS על הפלטה. הכינו את תמיסת הנוגדן STREPTAVIDIN ב-PBS, וודאו שערבבתם את התמיסה באמצעות וורטקס. שפכו את שטיפת ה-PBS האחרונה מהבארות והניחו את פלטת ה-ALI spot.הוסיפו תמיסת נוגדן streptavidin לכל באר והדגירו את הפלטה במנדף לתרביות רקמה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. כדי להסיר עודפי נוגדן streptavidin, שטפו את הפלטה שש פעמים ב-PBS תוך שימוש בשיטת השפיכה והספיגה (dump and blot); בשטיפה האחרונה, השאירו את ה-PBS על הפלטה. בהתחשב ברגישות לאור של תמיסת מצע הפוספטאז האלקלי B-C-I-P-M-B-T.יש לעבוד בחושך בעת הכנת תמיסת הצביעה, כפי שמתואר על ידי היצרנים בהוראות של ערכת התסבירה לפוספטאז האלקלי. יש לשפוך את ה-PBS שנותר מהבארים ולייבש את לוחת הנקודות. הוסף תמיסת סובסטרט לכל באר והדלק את האור. לאחר חמישה עד 10 דקות של פיתוח הצבע, השאר את הריאגנטים על הפלטה עד שהנקודות יתחילו להפוך לסגולות ויהיו כהות למדי.תהליך זה אורך עד 20 דקות. שטפו את פלטת ה-Ali שלוש פעמים במי ברז והניחו לה להתייבש באוויר. כל פלטה מכילה ביקורת חיובית, ביקורת שלילית ואת הפפטיד הנבדק, שבוצעו לפחות בשכפול.ב בארי הפקדים החיוביים מופיע צבע סגול עמוק המשקף שכבת תאים רציפה (confluent) וכמעט ללא רקע לבן. ב בארי הפקדים השליליים אין רקע סגול ואין נקודות, כפי שצפוי. בארי דגימות הבדיקה ממחישים כאן תגובות תאיות לפפטידים מיקרוביאליים.הכתמים הסגולים מייצגים תא בודד המגיב ומבטא את הציטוקין הנבדק בעת ביצוע טכניקת ה-LA spot. יש להיזהר שלא לנקב את הממברנה עם קצות הפיפטות ולא לאפשר ללוחית להתייבש, שכן הדבר יוביל לרקע גבוה.

enzyme-linked-immunospot-assay-elispot-quantification-th-1-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אפיון של T-cell epitopes של פתוגנים הגורמים לזיהומים מקומיים, כגון נגיף הפפילומה האנושי, מהווה אתגר בשל מספרם המוגבל של תאי T במחזור הדם. בשיטה המתוארת, תאי T נדירים בודדו ואופיינו החל ממספר קטן מאוד של תאים.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת ELISpot כדי להעריך את תפקודם של תאי B מפרישי נוגדנים, ASC. הנוגדנים המופרשים על ידי ASCs אינטראקציה עם מקטעי נוגדנים רב-שבטיים הקשורים לקרום, אשר מזוהים על ידי נוגדני IgG או IgM מצומדים אנזים. הכתם הצבעוני שנוצר בכל באר מעיד על נוכחות איזוטיפ של הנוגדן הספציפי, אשר נמצא בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי צמוד אנזים משמש כמדד לתגובות זיכרון מרכזיים וקורלציה עם תגובות חיסון נגד mycobacterial מגן. עם assay זה, תאי דם היקפי mononuclear הם מגורה עם אנטיגנים mycobacterial וinterleukin-2 במשך 14 ימים, מה שמאפשר בידול והתרחבות של תאי T הזיכרון מרכזיים.

יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

דם היקפי אנושי משמש בדרך כלל להערכת התגובה החיסונית ההומורלית. כאן, מתוארות השיטות לבידוד תאי B אנושיים מדם היקפי, התמיינות תאי B אנושיים לתאי B מפרישי נוגדנים (AB) (ASCs) בתרבית, וספירת סך ה-IgM וה-IgG-ASCs באמצעות בדיקת ELISpot.

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

הפיתוח של אינטרפרון-גמא ELISpot וזמינותו של שפן PBMCs מאפשרת אפיון T-cell תגובות במודל זה מאוד רלוונטי ללימוד מחלות זיהומיות. לנו יש להחיל וזמינותו כדי למדוד את תא T תגובות המשויכות intradermal משלוח של חיסונים DNA.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשם זיהוי איכותי vivo של אנטיגן ספציפי CD8+ T תאים. ניתוח אפשרי עם המתלים תא בודד איברים או כמויות קטנות של דם. מגוון רחב של מחקרים דורשות הניתוח של תגובות תא T ציטוטוקסי (חיסון, מחקרים חיסוני סרטן).

כימות סימולטני של CD8 וקטור נגד ו- Anti-transgene-ספציפי+ T תאים דרך MHC אני Tetramer מכתים לאחר החיסון עם וקטור ויראלי

הפרוטוקול מציג שיטות מפורטות להערכה אם ננו-אמולסיה אופיופוגונין D אדג'ובנט מקדם תגובות חיסוניות תאיות יעילות.

במבחנה הערכת פעילות תאית של חיסון ננו-אמולסיה אדג'ובנט אופיופוגונין D

למד לזהות תגובות תאי T לאנטיגנים ספציפיים באמצעות שיטת ELISPOT. השיטה מאפשרת כימות ציטוקינים וניתוח יחידות יוצרות כתמים במחלות אידיופתיות.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

גלה סרטונים נוספים