Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות תגובות של תאי T לאנטיגנים מעניינים. זה מושג על ידי קידוד ראשון עם נוגדנים לכידה. השלב השני של ההליך הוא הוספת תאים ואנטיגנים מעניינים ולאחר מכן דגירה למשך הלילה.

השלב השלישי של ההליך הוא הוספת נוגדנים לזיהוי. השלב האחרון בהליך הוא פיתוח הצלחת עם ריאגנטים למצע וניתוח כתמים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות שבחרו ציטוקינים מעניינים באמצעות ניתוח יחידות יוצרות נקודות.

היי, שמי Dr.Ki ריכטר ואני מדריך מחקר במעבדה של ד"ר וונדר דרייק באוניברסיטת ונדרבילט במחלקה למחלות זיהומיות. היום אנו מדגימים את טכניקת Ellie Spot, הידועה גם בשם בדיקת נקודה חיסונית מקושרת לאנזים. ד"ר איספהאן צ'יימברס וטיפאני קון ידגימו עבורכם את הטכניקה היום.

על מנת לשמור על תקני תרבית תאים, בצע מניפולציות בתנאים סטריליים במכסה המנוע, פתח צלחת ספוט של בעל ברית ושטוף שלוש פעמים עם PBS. הכן תמיסת ציפוי של נוגדן הלכידה ב- PBS. מערבבים היטב על ידי מערבולת לנוחות.

העבירו את תמיסת הנוגדנים למאגר עבור תמיסת הציפוי הרב-ערוצית, פיפטר ו-100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי לכל אחד. אוטמים היטב את הצלחת עם פרפיל ומכניסים למקרר למשך הלילה. לוחות מצופים נוגדנים אלה טובים לשבועות.

כלל האצבע מכתיב שניתן להשתמש בצלחת אם עדיין נשאר נוזל בבארות. כדי להכין את התאים לבדיקה זו, יש להדביק תאים חד-גרעיניים טריים מבודדים בדם היקפי עם טריאן כחול לצורך כדאיות ולספור אותם, יש לצלחת את ה-pbmc ב-2 מיליון תאים למיליליטר ב-10 המדיה שלנו ולדגור למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. על מנת לעקוב אחר הניסוי, סמן את מכסה לוחית הספוט של עלי עם מספר זיהוי הדגימה, תנאי הבאר והתאריך.

שוטפים את הצלחת שש פעמים עם PBS סטרילי בשיטת השלכת וכתם היזהר לא להתיז את הצלחת בזמן השלכתה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לבארות הצלחת להפוך לסגולות. מוסיפים את 20 המדיה שלנו לכל באר ומדגרים את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.

בזמן שהצלחת דוגרת, ספרו את התאים שנחו למשך הלילה. קציר את ה- pbmc על ידי צנטריפוגה. שפכו את הסופרנטנט והשאירו מחדש את הגלולה ב-10 המדיה שלנו בריכוז של מיליון תאים למיליליטר.

לאחר הדגירה של שעה אחת של לוחית הספוט של בעל הברית, הסר את המדיה R 20 בשיטת השלכה וכתם. היזהר לא להתיז את הצלחת בזמן השלכה. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל אחד.

עקוב אחר התכנון הניסיוני עם הוספת פפטידים ואנטיגנים לבארות הבדיקה המתאימות. כלול תמיד בקרה שלילית על תאים ללא פפטידים וגם בארות בקרה חיוביות בתוספת פיטו המגלוטינין. דגרו את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

שטפו את הצלחת שש פעמים עם 150 מיקרוליטר של XPBS אחד בשיטת השלכה וכתם. מוסיפים 100 מיקרוליטר PBS לכל באר בצלחת ומכניסים את הצלחת למקרר או בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בינתיים, הכינו את תמיסת הנוגדנים לביוטין ב-PBS.

הוציאו את צלחת הספוט של ALI מהמקרר והשליכו את ה-PBS על ידי הזלפה לסל האשפה. היזהר לא להתיז את הצלחת בזמן השלכת תמיסת נוגדני ביוטין לכל באר ולדגור את הצלחת במכסה המנוע בטמפרטורת החדר למשך שעה. שטפו את הצלחת שש פעמים עם PBS בשיטת השלכת וכתם בכביסה האחרונה.

השאירו את ה-PBS בצלחת עכשיו. הכן את תמיסת הנוגדנים STREPTAVIDIN ב- PBS, הקפד לערבב את התמיסה לערבוב. ובכן השליכו את שטיפת ה- PBS האחרונה מהבארות ותכננו את צלחת הספוט של ALI.

הוסף תמיסת נוגדנים סטרפטווידין לכל באר ודגר את הצלחת במכסה המנוע של תרבית הרקמה בטמפרטורת החדר למשך שעה. על מנת להסיר עודפי נוגדן טרביין, שטפו את הצלחת שש פעמים עם PBS בשיטת השלכה וכתם בכביסה האחרונה, הובילו את ה-PBS על הצלחת. בהתחשב ברגישות לאור של תמיסת המצע פוספטאז אלקליין B-C-I-P-M-B-T.

עבדו בחושך בעת הכנת תמיסת הגבעול כפי שמתואר על ידי היצרנים בהוראות ערכת המצע האלקליין פוספטאז השליכו את ה-PBS הנותר מהבארות והכתם את צלחת הספוט. הוסף תמיסת מצע לכל באר והדליק את האור. לאחר חמש עד 10 דקות של התפתחות צבע, הניחו לריאגנטים להישאר על הצלחת עד שהכתמים מתחילים להפוך לסגולים והם כהים למדי.

זה לוקח עד 20 דקות. שטפו את צלחת הספוט של עלי שלוש פעמים במי ברז והניחו לייבוש באוויר. כל צלחת מכילה בקרה חיובית, בקרה שלילית ופפטיד מעניין המתנהל במינימום בשכפול.

בארות הבקרה החיוביות הן בצבע סגול עמוק המשקפות שכבה משולבת של תאים וכמעט ללא רקע לבן. לבארות הבקרה השליליות אין רקע סגול ואין כתמים כצפוי. בארות מדגם הבדיקה ממחישות כאן תגובות תאיות לפפטידים מיקרוביאליים.

הכתמים הסגולים מייצגים תא מגיב יחיד המבטא את הציטוקין המעניין בעת ביצוע טכניקת הנקודה של LA. אנא היזהר לא לנקב את הממברנה עם קצות הפיפטה שלך או לאפשר לצלחת שלך להתייבש כי זה יוביל לרקע גבוה.