Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות תגובות של תאי T לאנטיגנים רלוונטיים. דבר זה מושג תחילה על ידי קידוד באמצעות נוגדני לכידה. השלב השני של הפרוצדורה הוא הוספת תאים ואנטיגנים רלוונטיים ולאחר מכן דגירה למשך לילה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הוספת נוגדני זיהוי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא פיתוח הפלטה באמצעות ריאגנטים של סובסטרט וניתוח הנקודות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המזהות ציטוקינים רלוונטיים באמצעות ניתוח של יחידות יוצרות נקודות (spot forming units).

שלום, שמי ד"ר Ki Richter ואני מרצה למחקר במעבדתו של ד"ר Wonder Drake באוניברסיטת ונדרבילט, בחטיבה למחלות זיהומיות. היום אנו נדגים את טכניקת ה-ELISpot, הידועה גם כבדיקת ELISpot (immuno spot assay) מקשורה לאנזים. ד"ר Isfahan chambers ו-Tiffany Cone ידגימו עבורכם את הטכניקה היום.

על מנת לשמור על סטנדרטים של תרביות תאים, בצע את המניפולציות בתנאים סטריליים בתוך המבתר, פתח פלטת בארות מסוג ally spot plate ושטוף שלוש פעמים עם PBS. הכן תמיסת ציפוי של הנוגדן הלוכד ב-PBS. ערבב היטב באמצעות וורטקס לנוחות העבודה.

העבירו את תמיסת הנוגדנים למאגר עבור פיפט רב-ערוצי וחלקו 100 µL מתמיסת הציפוי לכל באר. אטמו את הפלטה בעזרת פילם והניחו במקרר למשך לילה. פלטות אלו, המצופות בנוגדנים, נשמרות למשך שבועות.

כלל האצבע קובע שניתן להשתמש בלוחית כל עוד נותר נוזל בבארות. כדי להכין את התאים לבדיקה זו, צבעו תאים מונונוקלאריים של דם פריפרי (PBMC) שבודדו זה עתה ב-tripan blue לבדיקת חיוניות וספרו אותם. זרקו את ה-PBMC בריכוז של 2 מיליון תאים למיליליטר ב-10 מ"ל מדיום והדגירו אותם למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. כדי לעקוב אחר הניסוי, סמנו את מכסה לוחית ה-Ali spot עם מספר זיהוי הדגימה, תנאי הבארות והתאריך.

שטפו את הפלטה שש פעמים עם PBS סטרילי באמצעות שיטת השפיכה והספיגה (dump and blot). היזהרו לא להתיז מהפלטה בזמן השפיכה, שכן הדבר עלול לגרום לבארות בפלטה להפוך לסגולות. הוסיפו 20 µL מתווך לכל בארה והדגרימו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.

בזמן שהפלטה דוגרת, ספרו את התאים שנחו במהלך הלילה. אספו את ה-pbmc באמצעות סנטריפוגה. שפכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את המשקע ב-10 מצעי גידול בריכוז של 1 מיליון תאים למיליליטר.

לאחר דגירה של שעה אחת של פלטת נקודות ה-ally, הסירו את מצע ה-R 20 באמצעות שיטת השפיכה והניגוב (dump and blot). היזהרו לא להתיז נוזלים על הפלטה במהלך השפיכה. הוסיפו 100 µL של תרחיף תאים לכל נקודה.

יש לעקוב אחר התכנון הניסיוני עם הוספת פפטידים ואנטיגנים לבארי הבדיקה המתאימים. יש לכלול תמיד ביקורת שלילית של תאים ללא פפטידים וכן בארי ביקורת חיובית עם פיתוהמוגלוטינין מוסף. יש להדגיר את הפלטה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.

שטפו את הפלטה שש פעמים עם 150 µL של XPBS בשיטת הריקון והספיגה (dump and blot). הוסיפו 100 µL של PBS לכל באער בפלטה והניחו את הפלטה במקרר או בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בינתיים, הכינו את תמיסת הנוגדן המסומן בביוטין ב-PBS.

הוציאו את פלטת ה-ALI spot מהמקרר והשליכו את ה-PBS על ידי נטילתו לסל המיחזור. היזהרו שלא להתיז מהפלטה בעת מזיגת מנה של תמיסת הנוגדן הביוטין לכל באר, והדגירו את הפלטה במ hút תרביות רקמה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את הפלטה שישה פעמים עם PBS, כאשר בשטיפה האחרונה השתמשו בשיטת השליכה והספיגה (dump and blot).

השאירו כעת את ה-PBS על הפלטה. הכינו את תמיסת הנוגדן STREPTAVIDIN ב-PBS, וודאו שערבבתם את התמיסה באמצעות וורטקס. שפכו את שטיפת ה-PBS האחרונה מהבארות והניחו את פלטת ה-ALI spot.

הוסיפו תמיסת נוגדן streptavidin לכל באר והדגירו את הפלטה במנדף לתרביות רקמה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. כדי להסיר עודפי נוגדן streptavidin, שטפו את הפלטה שש פעמים ב-PBS תוך שימוש בשיטת השפיכה והספיגה (dump and blot); בשטיפה האחרונה, השאירו את ה-PBS על הפלטה. בהתחשב ברגישות לאור של תמיסת מצע הפוספטאז האלקלי B-C-I-P-M-B-T.

יש לעבוד בחושך בעת הכנת תמיסת הצביעה, כפי שמתואר על ידי היצרנים בהוראות של ערכת התסבירה לפוספטאז האלקלי. יש לשפוך את ה-PBS שנותר מהבארים ולייבש את לוחת הנקודות. הוסף תמיסת סובסטרט לכל באר והדלק את האור. לאחר חמישה עד 10 דקות של פיתוח הצבע, השאר את הריאגנטים על הפלטה עד שהנקודות יתחילו להפוך לסגולות ויהיו כהות למדי.

תהליך זה אורך עד 20 דקות. שטפו את פלטת ה-Ali שלוש פעמים במי ברז והניחו לה להתייבש באוויר. כל פלטה מכילה ביקורת חיובית, ביקורת שלילית ואת הפפטיד הנבדק, שבוצעו לפחות בשכפול.

ב בארי הפקדים החיוביים מופיע צבע סגול עמוק המשקף שכבת תאים רציפה (confluent) וכמעט ללא רקע לבן. ב בארי הפקדים השליליים אין רקע סגול ואין נקודות, כפי שצפוי. בארי דגימות הבדיקה ממחישים כאן תגובות תאיות לפפטידים מיקרוביאליים.

הכתמים הסגולים מייצגים תא בודד המגיב ומבטא את הציטוקין הנבדק בעת ביצוע טכניקת ה-LA spot. יש להיזהר שלא לנקב את הממברנה עם קצות הפיפטות ולא לאפשר ללוחית להתייבש, שכן הדבר יוביל לרקע גבוה.