Name: גין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-17T17:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: למדו שיטת electroporation in vivo להזרקת גנים למוח חולדות ניאונטליות באמצעות פלסמידים. טכניקה זו מאפשרת מסירה ממוקדת ויעילה של חומר גנטי לרקמת מוח חיה במחקר נוירולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים יקטרינה Karelina לעזרה עם הקלטת פסקול וידאו, איוון Molotkov עבור 3D אנימציה ד&quot;ר פיטר Blaesse להכנת החטיבה-EGFP פלסמיד. העבודה נתמכה על ידי מענקים ממרכז הניידות של הבינלאומי של פינלנד, קרן התרבות הפינית האקדמיה של פינלנד.

1. הקדמה יצירת חיות טרנסגניות היא שיטה רבת עוצמה של חקירה של פונקציות גן חיים בעלי חיים 1 ועל מנגנון נפרמים מחלה 2,3, כמו גם עבור מניפולציה המאפיינים של 4 תאים. עם זאת, ההליך הוא מייגע למדי, מאוד זמן רב ויקר, ולכן התאוששות להשתמש בשיטות חלופיות משלוח הגן כגון הזרקת נגיפי 5, הזרקת חדרית היילודים עם electroporation 6 ו ברחם electroporation 7,8. שיטת הזרקה חדרית ללא electroporation הלידה ויש לו קבוצה ייחודית של יתרונות: שימוש שאינו ויראלי בונה גנטיות; אפשרות ליצור דפוס ביטוי מקומי באזור ריבית; ב transfection באתרו של לא נודדות סוגי תאים, כגון קליפת המוח האסטרוציטים. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את תהליך מפורט של משלוח גן הלידה למוח החולדה הילוד באמצעות פלסמיד קידוד עבור חלבון משופר פלואורסצנטי ירוק תחת מקדם ביתא אקטין עוף עם CMV משפר (pCAG-EGFP) 9. אנו מדגימים את הכנת פתרון פלסמיד המכיל את הזריקה, ייצור של זכוכית דקה pipettes והרכבה של microinjector על מכשיר stereotactic. אז אנחנו מדברים על anaesthetizing גורים עכברוש עם isoflurane, על ביצוע הניתוח, על הליך ההזרקה ועל electroporation באמצעות מלקחיים אלקטרודות ב porator vivo. לבסוף, אנו נדון בקצרה את התוצאות הצפויות, פרספקטיבות קשיים שעלולים להתעורר במהלך ניסויים אלה. 2. הכנה פלסמיד עבור electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדרך כלל אנחנו מכינים 10 μl של הפתרון הזרקת פלסמיד בצינור קיר μl 200 דק. פתרון זה מספיק עבור מספר ניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו לערבב 8 μl של הפתרון פלסמיד (ראה חומרים וציוד) עם μl 1 של PBS 10X (ראה חומרים וציוד) 1 μl של פתרון מים מהיר 0,1% הירוק (ראו חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הריכוז הסופי של פלסמיד בפתרון הזרקה צריך להיות בין 1 ל 3 מיקרוגרם / μl. ריכוז נמוך של ה-DNA פלסמיד תפחית את יעילות transfection, ואילו ריכוז גבוה DNA תהיה צמיגה מדי הזרקה באמצעות קצה דק של זכוכית נימי. </li></ol> 3. זכוכית הכנה מחט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת כוס פיפטה, אנו משתמשים זכוכית בורוסיליקט נימי עם נימה (ראה חומרים וציוד) אלקטרודה אנכי זכוכית חולץ (ראה חומרים וציוד) על מקסימום משיכת וחימום פרמטרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, אנו לשבור את קצה פיפטה בעזרת פיסת נייר כדי להשיג קצה 10-20 מיקרומטר קוטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בודקים את קוטר קצה ובצורה אובייקטיבית תחת מיקרוסקופ. </li></ol> 4. Microinjector הרכבת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בפולימר דק נימי (ראה חומרים וציוד) אנחנו ממלאים בערך 1 / 3 של נפח של 10 μl המילטון מזרק (ראה חומרים וציוד) עם שמן מינרלי (ראו חומרים וציוד). הימנע בועות אוויר! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז אנחנו ממלאים את פיפטה מזכוכית עם שמן מינרלי להכניס את פיפטה לתוך המזרק המילטון. הימנע בועות אוויר! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק עם כוס פיפטה קבוע אז על microinjector המחוברים לבקר (ראה חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההתקנה microinjection קבוע על מכשיר stereotactic (ראה חומרים וציוד) מאפשר לנו בבטחה לטבול את קצה פיפטה זכוכית לתוך הצינור עם פתרון הזרקת פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר קצה נוגע במשטח של הפתרון, לטבול אותו עוד יותר על ידי מ"מ 1 או 2 ולמלא את פיפטה עם μl כ 1 של תמהיל הזרקה באמצעות מזרק מיקרו בקר. </li></ol> 5. Anaesthetizing בעלי חיים כל הנהלים המוצגים כאן נעשו על פי מאוניברסיטת הלסינקי תקנות ניסויים בבעלי חיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ניסוי, אנחנו ממלאים מזרק גז הדוק (ראו חומרים וציוד) עם כ 2 מ"ל של isoflurane (ראה חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאשר את המזרק הוא קבוע על יחידת ההרדמה (ראה חומרים וציוד) המחובר למקור זרימת אוויר, תיבת חיות את המסכה קבוע על ההתקנה stereotactic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על יחידת ההרדמה, אנו להתאים את זרימת האוויר כ 250 מ"ל / דקה ורמת isoflurane ל -4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו שמים את החולדה הגור לתוך תיבת חיה עבור 2-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הגור מפסיק לנוע, למקם אותו על כרית חימום (ראה חומרים וציוד) מצורף ההתקנה stereotactic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום חלק מקורי של ראשו של הגור לתוך המסכה anaesthetizing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה לוקח 5 עד 10 דקות עבורהגור להיכנס הרדמה עמוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את עומק ההרדמה עם קמצוץ הזנב להקטין את יבוא isoflurane ל% כ 1.5-2.0. </li></ol> 6. , כירורגיה Microinjection ו electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנקו את העור על ראשו של הגור עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים קטנים (ראה חומרים וציוד) מלקחיים דק (ראה חומרים וציוד), לחתוך את העור בעורפו של הגור אל המצח שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנד חתיכות העור לצדדים ולמשוך ברים האוזן מעט לתוך פתחי שמיעתי של הגולגולת על הראש קיבעון העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ המשקפת, אנחנו לאתר את נקודת גבחת על הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את האזור של עניין באמצעות קואורדינטות stereotactic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פיפטה זריקה מעל האזור הזה ולסמן אותו על ידי הטלת 25-50 nl הפתרון הזרקה אל פני הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדחה הגולגולת בעדינות ובזהירות בנקודה המסומנת באמצעות מקדחה במהירות גבוהה כירורגי (ראו חומרים וציוד) תחת המיקרוסקופ עד נוזלי מופיע באזור קדח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן מלקחיים electropotation אלקטרודות (ראה חומרים וציוד) בצידי הגולגולת עם ג'ל מוליך זרם (ראו חומרים וציוד) כדי להשיג מוליכות טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את טיפת נוזל מהחור קדח בעזרת טמפון קטן (ראה חומרים וציוד) לטבול את המחט זכוכית אל החור על פי הקואורדינטות של הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות 25-100 nl הפתרון הזרקת בשיעור של 5 עד 20 nl / sec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להסיר את פיפטה ו electroporate מיד. Electroporation נעשית על ידי יישום בחמש לחיצות מלבן עם משך של 50 אלפיות ו משרעת של V 99 בתדר של 1 הרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר אלקטרודות וברים האוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את העור חתך באמצעות שילוב של מלקחיים אילמת (ראה חומרים וציוד) וחד הנושאים כירורגי (ראו חומרים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הגור לתוך תא חם 15-30 דקות כדי לסייע להחלמה שלו לאחר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן החזיר את הגור לכלוב של אמא שלו. </li></ol> 7. נציג תוצאות הביטוי של transgene בתאי transfected בהצלחה יופיעו כ -10 שעות לאחר electroporation, והוא יישאר יציב במשך כמה שבועות. אנו microinjected הפלסמיד גם לשכבות עמוקות או קליפת המוח באזור הסטריאטום של יום הלידה 2 (P2) גורים Wistar חולדה שבוצעו electroporation vivo כמתואר לעיל. פרוסות המוח (400 מיקרומטר עובי) נחתכו לאחר 2-6 ימים (P4-P8) באמצעות vibrotome במדיום חיתוך קר (Hepes שנאגרו תמיסת מלח מאוזן של ארל) 10. הרכישה בוצעה באמצעות תמונה Zeiss Axioplan 2 LSM5 פסקל confocal מיקרוסקופ (Zeiss, גרמניה) במדיום חיתוך בטמפרטורת החדר. אתרי הזרקה בשכבות קורטיקליים עמוקים בסטריאטום הכיל תאים transfected רבים להביע EGFP שאותרו באזור קומפקטית של כ 200-300 מיקרומטר קוטר (איור 1 א ', ב). בתוך תאים transfected, רמת הביטוי EGFP גבוהה מספיק כדי לאפשר הדמיה של תהליכים תאיים דק (איור 1C) כולל דנדריטים עם הקוצים של צורות שונות (איור 1D) וצרורות האקסון (איור 1E). היציבות החזקה של EGFP וכן כדאיות התא לאחר electroporation מותר התחקות החלקים המרוחקים של אקסונים (עד 1.5-2 מ"מ מגופים התא) כגון מסופים קליפת המוח (איור 1F). <img src="/files/ftp_upload/2244/2244fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (א) transfected בהצלחה תאים באזור הסטריאטום במוח חולדה P4 המגדירה את האתר הזרקת פלסמיד. (ב) תאים transfected בשכבות עמוקות בקליפת המוח (כ 1000 מיקרומטר מתחת לפני השטח קליפת המוח) של המוח עכברוש P5. (ג) תא transfected באזור הסטריאטום במוח חולדה P8. (D) תהליכים דנדריטים של תא transfected באזור הסטריאטום במוח חולדה P8; החצים מצביעים על סוגים שונים של הקוצים הדנדריטים וגם filopodia. (ה) האקסונים של תאים transfected בתוך מסלול בטחונות. (F) האקסונים סיום על פני השטח של pial P8 עכברוש הקורטקס (ראש חץ). ברים הם סולם 100 מיקרומטר על A, B, E ו-F, 10 מיקרומטר על C ו-D

<ol><li>Gerlai, R., Clayton, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+hippocampal+function+in+transgenic+mice%3A+an+ethological+perspective.+Trends+Neurosci%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Analyzing hippocampal function in transgenic mice: an ethological perspective. Trends Neurosci.</a> 22, 47-51 (1999).</li>
<li>McGowan, E., Eriksen, J., Hutton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+modeling+Alzheimer%27s+disease+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A decade of modeling Alzheimer's disease in transgenic mice.</a> Trends Genet. 2, 281-289 (2006).</li>
<li>Cryan, J. F., Holmes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ascent+of+mouse%3A+advances+in+modeling+human+depression+and+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The ascent of mouse: advances in modeling human depression and anxiety.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 4, 775-790 (2005).</li>
<li>Wells, T., Carter, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+neural+function+in+transgenic+rodents%3A+towards+a+comprehensive+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of neural function in transgenic rodents: towards a comprehensive strategy.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 111-130 (2001).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> J. Neurosci. Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Boutin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3, e1883-e1883 (2008).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures%3A+interface+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li>
<li>Walantus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E16+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li>
<li>Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-based+nuclear+movement+occurs+independently+of+centrosome+positioning+in+migrating+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 16182-16187 (2007).</li>
<li>Ashwell, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshwell%2C+K+%22Atlas+of+the+Developing+Rat+Nervous+System%22">Atlas of the Developing Rat Nervous System</a>. , 3rd edition, Academic Press. (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 6th edition, Academic Press. (2007).</li>
</ol>

דרכי המסירה הגן לתוך המוח מכרסם החי מבוססים היטב עבור ברחם electroporation 7,8,11,12, ולאחרונה, עבור electroporation הלידה 6. עם זאת, שיטות אלו מבוססות על הזרקה תוך חדרי של ה-DNA פלסמיד, שיכולה להיות המגביל את מספר יישומים. לדוגמה, שיטות אלו אינן מאפשרות מיקוד תאים באזורים מסוימים במוח כמו ההיפוקמפוס, ולא transfection שאינם נודדים סוגי תאים כאלה האסטרוציטים כמו קליפת המוח. Non-חדרית זריקה בשילוב עם electroporation שימש לראשונה למסירה גן נוירונים לתוך...

<table><tbody><tr><td>פינצטה 2A-sa dumb, 115 מ"מ</td><td>ציוד</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td>טפל ב-70% אתנול לצורך חיטוי לפני השימוש במניפולציות כירורגיות</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה ביולוגי עם פד חימום מפלדת אל-חלד</td><td>ציוד</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת בורוסיליקט עם חוט להט</td><td>חומרים</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF120-69-10</td><td>מחט זכוכית</td></tr><tr><td>מקדחים חד-פעמיים</td><td>חומרים</td><td>מייזינגר</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו&amp;rsquo;PBS 10X</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מסוג Dumont #5, 110 מ"מ</td><td>ציוד</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>יש לטפל באתנול 70% לחיטוי לפני השימוש במניפולציות כירורגיות</td></tr><tr><td>נראה שהטקסט נקטע. אנא ספק את הטקסט המלא לתרגום.&amp;#8211;מכשיר למשיכת אלקטרודות</td><td>ציוד</td><td>אילינג</td><td>50-2013</td><td>מכשיר למשיכת זכוכית לאלקטרודות אנכיות</td></tr><tr><td>Ethilon מונופיל פוליאמיד 6-0 FS-3 16 מ"מ 3/8c</td><td>חומרים</td><td>ג'ונסון &amp;ו-ג'ונסון</td><td>EH7177H</td><td>חוטי תפירה כירורגיים</td></tr><tr><td>מזרק מיקרו Exmire בנפח 10.0 מ"ל</td><td>ציוד</td><td>Exmire</td><td>MS*GLLX00</td><td>מזרק אטום לגז</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרודות מלקחיים</td><td>ציוד</td><td>BEX</td><td>LF650P3</td><td>טפל ב-70% אתנול לחיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>בקרת מקדח Foredom</td><td>ציוד</td><td>מבוא</td><td>FM3545</td><td>ספק כוח ובקר למקדח כירורגי. האנלוג הזמין כעת הוא ערכת מיקרו-מוטור K.1070 (Foredom) </td></tr><tr><td>ידית מיקרו-מוטור של Foredom</td><td>ציוד</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td>האנלוג הזמין כעת הוא ערכת מיקרו-מוטור K.1070 (Foredom)</td></tr><tr><td>פלטפורמת הרדמה בגז לעכברים</td><td>ציוד</td><td>Stoelting Co.</td><td>50264</td><td>הורכב על מכשיר סטריאוטקסי</td></tr><tr><td>איסופלורן</td><td>ריאגנט</td><td>Baxter International Inc.</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה לחיטוי מיקרו, 105 מ"מ</td><td>ציוד</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td>יש לטפל באתנול 70% לצורך חיטוי לפני שימוש במניפולציות כירורגיות</td></tr><tr><td>Microfil</td><td>חומרים</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MF34G-5</td><td>מילוי קפילרות באמצעות מיקרו-מזרק</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>מזרק NanoFil בנפח 10 מיקרוליטר</td><td>ציוד</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ננופיל (NANOFIL)</td><td>מזרק Hamilton</td></tr><tr><td>פלסמיד CAG-EGFP</td><td>ריאגנט</td><td></td><td></td><td>הופקו וטוהרו באמצעות EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) והומסו במים נקיים מנוקליאז (nuclease free water) לריכוז של 1.5 mg/ml</td></tr><tr><td>מחולל פולסים CUY21Vivo-SQ</td><td>ציוד</td><td>BEX</td><td>CUY21Vivo-SQ</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל אלקטרודות של Schiller</td><td>ריאגנט</td><td>Schiller AG</td><td>2.158000</td><td>ג'ל מוליך</td></tr><tr><td>מכשיר סטריאוקסיס לבעלי חיים קטנים</td><td>ציוד</td><td>מכשירי David Kopf</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>סט&amp;#8211;מתאם לעכבר בוגר ולחולדה רך-גומא (neonatal rat)</td><td>ציוד</td><td>Stoelting Co.</td><td>51625</td><td>הורכב על מכשיר סטריאוטקסי. יש לחטא את מוטות תמיכת האוזניים (earbars) באתנול 70% לפני השימוש במניפולציות כירורגיות.</td></tr><tr><td>מספרי איריס לסטודנטים, ישרים 11.5 ס"מ</td><td>ציוד</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td>יש לחטא באמצעות אתנול 70% לפני שימוש במניפולציות כירורגיות</td></tr><tr><td>ספיגי ספיגה Sugi בגודל 17 x 8 מ"מ</td><td>חומרים</td><td>Kettenbach</td><td>31602</td><td>פדי ספיגה כירורגיים</td></tr><tr><td>משאבת מיקרו-מזרק UMP3 ובקר משאבת מיקרו-מזרק Micro 4</td><td>ציוד</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td>מיקרו-מזרק ובקר</td></tr><tr><td>מכשיר הרדמה Univentor 400</td><td>ציוד</td><td>Univentor</td><td>8323001</td><td></td></tr></tbody></table>

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת non-חדרית electroporation פלסמיד ו

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

יצירת חיות טרנסגניות היא הגישה הסטנדרטית בלימוד פונקציות של הגן של עניין in vivo. עם זאת, רבים בנוקאאוט או חיות טרנסגניות אינם קיימא באותם מקרים שבהם הגן מתבטא שונה או נמחק בתוך האורגניזם כולו. יתר על כן, מגוון של מנגנוני פיצוי לעתים קרובות לעשות את זה קשה לפרש את התוצאות. ההשפעות הפיצוי ניתן להקל על ידי תזמון גם את ביטוי הגנים או להגביל את כמות התאים transfected. שיטת microinjection חדרית בלתי הלידה והן electroporation vivo מאפשר משלוח ממוקד של גנים, siRNA או מולקולות צבען ישירות באזור קטן של עניין במוח מכרסם היילוד. בניגוד הטכניקה המקובלת חדרית הזרקה, שיטה זו מאפשרת transfection שאינם נודדים סוגי תאים. בעלי חיים transfected באמצעות השיטה המתוארת כאן ניתן להשתמש, למשל, עבור שני הפוטונים in vivo הדמיה או בניסויים אלקטרו על פרוסות המוח חריפה.

פרוטוקול זה מתאר שיטה שאינה ויראלי מסירת בונה גנטית באזור מסוים של המוח מכרסם החי. השיטה מורכבת הכנה פלסמיד, ייצור micropipette, ניתוח חולדה בילוד הגור, microinjection של לבנות, ואת<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation.

ג&#39;ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

יצירת בעלי חיים טרנסגניים היא גישה סטנדרטית לחקר תפקודיו של גן בעל עניין in vivo. עם זאת, בעלי חיים נוק-אאוט (knockout) או טרנסגניים רבים...

שלום, אני RI Ov. ואני אלקסיה יינג. אנחנו סטודנטים לתואר מתקדם באוניברסיטת Cent. בסרטון זה, נציג שיטה של אלקטרופורציה in vivo להחדרה של גן מטרה לאזור מסוים ברקמת המוח המובילה.אם כן, בואו נראה. שיטת האלקטרופורציה in vivo מציעה דרך מהירה ויעילה להחדרת גנים רצויים או RNA מפריע קצר (siRNA) לרקמת מוח חיה.שיטה זו מספקת חלופה זולה ליצירת בעלי חיים טרנסגניים ולגישה של העברת גנים באמצעות נגיפים. בסרטון זה, נדגים הליך מפורט של העברת גנים לאחר הלידה לקליפת המוח הרדיאלית (rad cortex) של רכים. נשתמש בפלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (enhanced green fluorescent protein) ובפרומוטור beta actin של תרנגולת עם מחזק CMV.אנו מבצעים את כל המניפולציות הכירורגיות בתוך קבאלת זרימה למינרית על מנת לשמור על סטריליות ולמזער את הסיכון לזיהום חיידקי או פטריי של בעל החיים. להחדרת פלסמיד לקורטקס, אנו משתמשים במזרק מיקרו של WPI עם בקר אלקטרוני ובמזרק Hamilton של 10 µL המחובר למניפולטור סטריאוטקטי. הגור הכלב האדום מורדם באמצעות יחידת הרדמה המורכבת מקופסה וממסכה.לאחר מכן מקבעים את הגור באמצעות מוטי אוזניים על שולחן חימום המחובר למניפולטור הסטראותקטי. לצורך מניפולציה כירורגית וניטור של המיקרו-הזרקה, אנו משתמשים במיקרוסקופ בינוקולרי. עבור אלקטרופורציה, אנו משתמשים במכשיר electroporation מדגם CYV 21 in vivo עם אלקטרודות בצורת פינצטה.עבור התאוששות הגורים. לאחר ההרדמה, נעשה שימוש בתא חימום. בדרך כלל אנו מכינים 10 µL של תמיסת ההזרקה של הפלסמיד בתוך מבחנה בעלת דופן דקה של 200 µL. תמיסה זו מספיקה למספר ניסויים.אנו מערבבים שמונה µL של תמיסת הפלסמיד עם מיקרוליטר אחד של 10 XPBS ומיקרוליטר אחד של תמיסת fast green בריכוז 0.1% במים. הריכוז הסופי של הפלסמיד בתמיסת ההזרקה צריך להיות בין 1 ל-3 µg/µL. שימוש בריכוזים נמוכים יותר של ה-plasmid DNA יפחית את יעילות הטרנספקציה, בעוד שריכוז DNA גבוה יותר יהיה צמיגי מדי להזרקה דרך הקצה הדק של קפילרת הזכוכית.להכנת פיפטת הזכוכית, אנו משתמשים בנימי זכוכית בורוסיליקט עם פילמנט ובמכשיר למשיכת זכוכית (glass pooler) אלקטרודי אנכי בהגדרות חימום ומשיכה מקסימליות. לאחר מכן, אנו שוברים את קצה הפיפטה באמצעות פיסת נייר כדי להגיע לקוטר קצה של 10 עד 20 micrometer. אנו בודקים את קוטר הקצה ואת צורתו תחת העדשת המיקרוסקופ.באמצעות קפילרית פולימר דקה, אנו ממלאים כשליש מהנפח של מזרק Hamilton של 10 µL. בעזרת שמן מינרלי, אנו מוודאים שאין בועות אוויר. לאחר מכן, אנו ממלאים את הפ pipette מזכוכית בשמן מינרלי ומכניסים את ה-pipette לתוך מזרק ה-Hamilton.שוב, יש להימנע מבועות אוויר. המזרק עם הפפיטה מזכוכית מקובע לאחר מכן למיקרו-מזרק המחובר לבקר. מערך המיקרו-הזרקה המקובע למכשיר סטריאוטקטי מאפשר לנו להטביל בבטחה את קצה הפפיטה מזכוכית לתוך המבחנה המכילה את תמיסתו של הפלסמיד להזרקה.כאשר הקצה נוגע בפני השטח של התמיסה, טבלנו אותו עמוק יותר ב-1 עד 2 מילימטרים. לאחר מכן, השתמשנו בבקר של המיקרו-מזרק כדי למלא את השפיר בערך 1 µL מתערובת ההזרקה. כל הניסויים המוצגים כאן בוצעו בהתאם לתקנות של אוניברסיטת הלסינקי לניסויים בבעלי חיים.עבור כל ניסוי, אנו ממלאים מזרק אטום לגז ב-isoflurane. אנו מקבעים את המזרק ביחידת ההרדמה המחוברת למקור זרימת האוויר, כאשר בעל החיים הולך והמסכה מקובעת למערך סטריאוטקטי. ביחידת ההרדמה, אנו מכוונים את זרימת האוויר לכ-250 milliliters minute ואת רמת ה-isoflurane ל-4% אנו מציבים את ה-red pop בתיבת בעל החיים למשך שתיים עד חמש דקות.כאשר ה-P מפסיק לנוע, אנו מניחים אותו על פלטת החימום המחוברת למערך הסטריאוטקסית. אנו ממקמים את החלק הרוסטרלי של ראש ה-P בתוך המסכה. בדרך כלל נדרשים בין חמשה ל-10 דקות עד שהגור חולל הרדמה עמוקה.כאשר הדבר מושג, אנו מפחיתים את זרימת האיסופלורן לכ-1.5 עד 2%. אנו מחטאים את העור בראשו של הגור באמצעות 70% ethanol בעזרת צמר גפן קטן ופינצטה דקה. אנו חותכים את העור מאזור העורף של הגור ועד למצחו, מכופפים את חלקי העור הצידה ומכניסים מעט את מוטות האוזניים לתוך פתחי הפה של הגולגולת לצורך קיבוע הראש והעור. באמצעות מיקרוסקופ בינוקולרי נאתר את נקודת ה-bregma על הגולגולת כדי לזהות את אזור העניין באמצעות הקואורדינטות הסטריאוטקטיות, נמקם את פיפטת ההזרקה מעל אזור זה ונסמן אותו על ידי טפטוף של 25 עד 50 nanoliters של תמיסת ההזרקה על פני השטח של הגולגולת.נקדח את הגולגולת בעדינות ובזהירות בנקודה המסומנת באמצעות מקדח כירורגי במהירות גבוהה תחת מיקרוסקופ, עד להופעת נוזל באזור הקידוח. מקבעים את מלקחי האלקטרופורציה ואת האלקטרודות בצדי הגולגולת. נמריח ג'ל מוליך כדי להשיג מוליכות טובה יותר.אנו מסירים את טיפת הנוזל מהאזור הנדקר באמצעות טמפון קטן ומטביעים את מחט הזכוכית אל תוך החור. בהתאם לקואורדינטות של אתר ההזרקה, הזנקנו 25 עד 100 nanoliters של תמיסת ההזרקה בקצב של 5 עד 20 nanoliter לשנייה. לאחר מכן הסרנו במהירות את הפפיטה והמשכנו מיד לביצוע אלקטרופורציה.אלקטרופורציה מבוצעת באמצעות הפעלת חמישה פולסים במשך 50 milliseconds בעוצמה של 99 volts ובתדירות של one hertz. אנו מסירים את האלקטרודות ואת מוטות קיבוע האוזניים. תפרנו את העור הגזור באמצעות שילוב של פינצטה קהה ופינצטה חדה וחוטים כירורגיים.הנחנו את הגור בתא חימום למשך 15 עד 30 דקות כדי לסייע בהחלמתו לאחר ההרדמה. לאחר מכן, החזרנו את הגור לכלוב אמו. הביטוי של הגן התוצאה (transgene) בתאים שהועברו בהצלחה יופיע כ-10 שעות לאחר האלקטרופורציה ויישאר יציב למשך מספר שבועות.זהו כל הדבר. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם. להתראות.

gene-delivery-to-postnatal-rat-brain-non-ventricular-plasmid

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בשנת הזרקה תוך חדרי ברחם ו electroporation של E16 עוברים עכברוש

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

מקור: Denaxa, M., el al., השתלת אבות של אינטרנוירונים קליפתיים מהונדסים כימוגנטית לתוך מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך להזרקת וקטור פלסמיד הנושא את הגן המעניין לאבות בין-נוירוניים בפרוסת מוח עוברית, ואחריו אלקטרופורציה לכניסת פלסמיד וביטוי גנים. אבות אבות מותאמים אלה יכולים לשמש מאוחר יותר לטיפול בהפרעות מוחיות.

העברת גנים בסיוע אלקטרופורציה משובצת אגרוז באבות אבות בין-עצביים בקליפת המוח של עכברים

ניתן להשפיע על גנים בזמן ההתפתחות של קליפת המוח או ההיפוקמפוס של החולדות באמצעות electroporation ברחם (IUE) בE16, כדי לאפשר שינויים מהירים וממוקד בקישוריות עצבית למחקרים מאוחרים יותר של התנהגות או neuropathology בבעלי חיים מבוגרים. אחרי לידה בתחום ההדמיה vivo על שליטה בהצלחת IUE מתבצעת על ידי פליטת אור של הפעלת לוציפראז transfected השותף.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

אנחנו מדגימים את טכניקה פולשנית המכונית electroporation האזור subventricular ילוד. הטכניקה מורכבת של הזרקת DNA פלסמיד לתוך חדרי לב לרוחב של גורים ילודים ויישום זרם חשמלי כדי לספק ולתפעל גנטיים תאי גזע...

Electroporation האזור Subventricular ילודים

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Electroporation שטח pial ילודים

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

מוצג כאן הוא שיטת אלקטרופורציה עבור משלוח ה-DNA של הפלזמה ותיוג תא ependymoglial במבוגר בלדג טלנצאלון. פרוטוקול זה הוא שיטה מהירה ויעילה כדי להמחיש ולעקוב אחר תאים ependymoglial בודדים ופותחת אפשרויות חדשות להחיל אלקטרופורציה על מגוון רחב של מניפולציות גנטיות.

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

הפרוטוקול הנוכחי מתווה הוראות שלב אחר שלב לביצוע זריקות תוך-תיקליות בעכברים יילודים לצורך עריכת גנים והעברת תרופות.

הזרקה תוך-תטית של עכבר שזה עתה נולד לצורך עריכת גנום ואספקת תרופות

למדו שיטת electroporation in vivo להזרקת גנים למוח חולדות ניאונטליות באמצעות פלסמידים. טכניקה זו מאפשרת מסירה ממוקדת ויעילה של חומר גנטי לרקמת מוח חיה במחקר נוירולוגי.

ג'ין משלוח מוח החולדה אחרי לידה על ידי הזרקת Non-חדרית electroporation פלסמיד ו

גלה סרטונים נוספים