Name: Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: למדו לבחון רעילות של פפטיד β-עמילואיד בדגם טראנסגני של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מהירה של שיתוק שרירים הנגרם מהצטברות Aβ, ומסייע בבדיקת השפעות תרופתיות וגנטיות על מחלת אלצהיימר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לחברי בהווה ובעבר המעבדה קישור שעזר לפתח את פרוטוקולי המתואר כאן, במיוחד ג&#39;ין פונטה, אשר פיתח את ההליך המקורי. עבודה זו נתמכה על ידי פרסים מ-NIH (AG12423) ואת איגוד האלצהיימר (פרס זניט) כדי CDL

1) הכנת צמיחה נמטודות צלחות מדיה עבור assay שיתוק. מבחני שיתוק מבוצעות על צמיחה תקן נמטודות מדיה (NGM) צלחות בשימוש שגרתי עבור ג elegans התפשטות וגנטיקה (Stiernagle, 2006). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיטוי הפתרון NGM המכילה NaCl, אגר ו Peptone בבקבוק Erlenmeyer ולהוסיף את הכמויות המתאימות של CaCl 2 סטרילי, אורציל, כולסטרול, MgSO 1M 4 ו - 1M KPO 4. Aliquot 10 מ"ל של נוזל לתוך NGM מ"מ x 60 כל 15 מ"מ צלחת פטרי. אפשר NGM לחזק הלילה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם בדיקת ההשפעות של תרכובות / תמציות, aliquot תמצית על כל צלחת ולהשתמש מפזר כדי לפזר באופן שווה את תמצית על פני הצלחת. אפשר לחלץ לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. כרכים על מ"ל 1 ידרוש זמן רב יותר להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוט כל צלחת עם μL של 250 א ' coli OP5O זן גדל מדיה LB לילה עבור צפיפות אופטית של 0.4-0.6. אפשר חיידקים להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר. </li></ol> משתנים רלוונטיים הגיל של צלחות יש השפעה משמעותית על assay השיתוק, כמו צלחות מבוגרים יותר נוטים להתייבש. צלחות השתמש שפכו בתוך שבוע assay שיתוק. לקבלת תוצאות אידיאלי, לשפוך צלחות 3-4 ימים לפני תחילת אוכלוסיות תולעת סינכרוני [ראו (2) להלן]. לצורך ניסוי כלשהו, ​​להשתמש רק צלחות זרמו מן אצווה אותו. לשנות את הגודל של הדשא (כלומר הבחינו לעומת התפשטות) ו / או סוג של חיידקים גם לשנות את ההתנהגות של התולעים. מבחני שיתוק יכול להתבצע באמצעות חלופה א coli זנים כמקור מזון (למשל, זן HT115 בשימוש האכלה ניסויים RNAi), אבל זה יכול לשנות את קינטיקה של שיתוק, וכן הוא מחייב בקרה פנימית המתאימה. 2) הכנת גיל סינכרוני אוכלוסיות תולעת מסננים CL4176 (SMG-1 (cc546 ts) אני; dvIs27 [Myo-3 / Aβ ​​minigene + רול-6 (su1006) גן סמן] X הוא הנפוץ ביותר עבור assaying Aβ-Induced שיתוק זה זן מהונדס דגמים אחרים זמינים. חוקרים אקדמיים תמורת סכום סמלי של גנטיקה Caenorhabditis מרכז (http://www.cbs.umn.edu/CGC/). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למקסם את בתיאום הגיל של האוכלוסייה מבחן עדיף להתחיל עם דור ההורים מסונכרן. שבוע לפני שיזם את assay שיתוק של האוכלוסייה הבדיקה, השתמש בבורר תולעת פלטינה להעביר 20-30 מבוגרים הרה להולדת על 10 ס"מ צלחות כמה NGM התפשטות עם OP50 עבור ביצה 2 שעה שכב על 16 מעלות צלזיוס (טמפרטורת מתירני עבור CL4176 ). הסר את המבוגרים הרה להולדת צאצאים ולאפשר לגדול במשך 7 ימים, ועד אז הם יהיו "ביום השני" הרה להולדת מבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (יום 1) ומבוגרים היום השני הרה להולדת משמשים להכנת לגיל סינכרוני אוכלוסיות הבדיקה. עבור כל תנאי הניסוי המטרה היא ליצור צלחות בשלושה עותקים המכיל 50-75 גיל סינכרוני תולעים. באמצעות בורר תולעת פלטינה, העברת 10-12 של 2 מבוגרים יום הרה להולדת על 60 מ"מ (10 מ"ל נפח) צלחות NGM מנוקדות OP50. אפשר התולעים להטיל ביצים על 16 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, ולאחר מכן לבחור את ומבוגרים ולאפשר הביצים לבקוע ולגדול ב 16 ° C. בשלב זה הוא הכי טוב שיש מישהו שלא יהיה הבקיע את הצלחות לקוד אותם, אז מלך השערים יהיה עיוור תנאי הניסוי. </li></ol> משתנים רלוונטיים שלב ההתפתחות העוברית כאשר הביצים מוטלות (~ שלב 26 תאים עבור סוג תולעים בר בתנאים אופטימליים) היא פונקציה של גיל תזונה למבוגרים. אם המבוגרים הרה להולדת משמש להכנת האוכלוסייה מבחן מבוגרים או רעב, ביצים בשלב מאוחר יותר יהיה מונח, הפחתת בתיאום הגיל של האוכלוסייה ואת שחזור של קינטיקה שיתוק. זה חיוני מאשר מונו axenic (כלומר, רק OP50 חיידקים) תרבויות משמשים (חיידקים מזהמים יכולים להשפיע קשות זה assay), וכן שחזור הוא הגבוה ביותר אם צלחות בשלושה עותקים יש מספר דומה של תולעים. 3) transgene אינדוקציה Assay שיתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (יום 3) צלחות Upshift עד 25 ° C 48 שעות לאחר סיום הביצה סינכרוני להניח, תולעים צריך להיות בשלב הזחל השלישית (L3). פלטות צריכים להיות מסודרים בלי לערום ב 25 ° C בחממה כדי לאפשר צלחות כל להגיע 25 ° C באותו זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (יום 4) ניקוד בגין השיתוק של תולעים (זן CL4176) בשעה 18-20 שעות לאחר התחלת upshift. בשלב זה, את כל התולעים באוכלוסייה צריך הגיעו הזחל השלב הרביעי (L4). המשך הבקיע בשתי שעות במרווחים עד שכל תולעים על כל הצלחות משותקים. מסיבות שאינן ידועות, שיתוק אפילו לא על פני אורך הגוף: באזור הראש הוא החלק האחרון של התולעת להפסיק לזוז. לכן, worms כי יזמו לאחרונה שיתוק לא יכול לתרגם את פני הצלחת, אבל יכול להזיז את ראשם, ובכך לנקות חיידקים סביב הקדמי שלהם להשאיר "הילה" של חיידקים פינה. תולעים אלו יהיו תמיד להיות משותק לחלוטין, ולכן תולעים עם הילות מסווגים כמו משותק. תולעים מסוימות לא יהיו הילות אבל גם לא להראות תנועה ספונטנית; אלה נבחנים על ידי דרבון עם בורר את התולעת. אם תולעת דקר לא יכול לעבור התפשטות הגל גוף מלא על דרבון, הוא גם הבקיע כמו משותק. לקבלת ניקוד יעיל, זה הכי קל להעביר את התולעים משותק למגזר ללא רבב של הצלחת, כך שהם לא יהיו rescored במתכוון תקופת הניקוד הבא. (זה גם מאפשר אי - מסווג תולעים להפגין תנועה, מה שמאפשר תיקון ניקוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור עקומת שיתוק, בכל נקודת זמן שבריר של תולעים על כל צלחת שלא היה משותק מומר אחוז, ואת ממוצע אחוז "unparalyzed" הוא זמם נגד הזמן מהופעת upshift. (הרציונל זממו בדרך זו הוא כי עקום וכתוצאה מקביל רשמית עקומת ההישרדות, וכך ניתן לנתח באמצעות תקן הלא פרמטרית סטטיסטיקות ההישרדות.) </li></ol> משתנים רלוונטיים Upshift של תולעים myo-3/Aβ מהונדס חייב להתרחש לפני שהם מגיעים לשלב אמצע L4 לשיתוק להיות יזם, כמו האמרגן-3 מיו מוסדר התפתחותי, צמצמה באופן משמעותי ביטוי מאוחר L4 או תולעים בוגרות. כמו כן, הביטוי של transgene זו חסומה אם תולעים להיות רעב, אז זה חיוני כי התולעים הם המדושנים במהלך הניסוי. אנחנו מעולם לא נצפתה תולעת משותק לשחזר בשום תנאי, ואחרי שעה של 12-16 upshift, כל CL4176 תולעים ישתקו, גם אם הם מורידה הילוך עד 16 ° C. ב זן CL4176, upregulation מספיק ביטוי transgene לגרום לשיתוק יכול להתרחש בטמפרטורות נמוכות יותר (כלומר, 20-25 ° C) למרות עיתוי שיתוק יהיה שונה. שיעור שיתוק תלוי זן מהונדס מסוים בשימוש (בנינו זנים myo-3/Aβ עם שני שיעורי מהר יותר לאט יותר מאשר CL4176), ולכן עם זנים החלופה חלון הניקוד ייתכן שיהיה צורך להתאים. 4) נציג תוצאות שמוצג באיור 1 היא מזימה של עקומת שיתוק עבור CL4176, הן טופלו וחשוף mM 6.27 קפאין (הריכוז הסופי בצלחת NGM). טיפול זה גורם עיכוב מאוד משמעותי מבחינה סטטיסטית שיתוק של כ 4 שעות, שבה אנו מפרשים מעיד כפי הדיכוי של רעילות Aβ במודל זה. שמוצג באיור 2 הוא ניסוי עצמאי assaying את ההשפעות של cafestol, אחרת נמצא מתחם קפה. העלילה זה אופייני עבור טיפולים שאינם השפעה רעילות Aβ. שים לב, בניסויים הן כמחצית מטופל CL4176 אוכלוסיות משותקים ב 24 שעות, ושיתוק תושלם על ידי 28 שעות. אלה הם זמנים אופייני שיתוק שליטה CL4176 אוכלוסיות. סטיות משמעותיות בין עיתוי זה מעיד על התנאים הסביבתיים שינו או מחיקה ספונטנית של עותקים transgene. (CL4176 מכיל מערך chromosomally משולבת מהונדס עם מספר עותקים של transgene myo-3/Aβ. למרות מערך מהונדס הוא בדרך כלל יציב למדי, כל הריבוי של זן בטמפרטורות&gt; 16 ° C יבחר עבור תולעים נדיר כי עברו המחיקה ספונטנית של transgenes, וכתוצאה מכך וריאנטים כי יהיה מופחת הביטוי Aβ ותוצאות שיתוק איטי יותר.) <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. עקומת שיתוק עבור זן CL4176 תולעים מטופל או חשופים לקפאין 6.27 מ"מ (Sigma). פעמים הם ציינו מן ייזום upshift הטמפרטורה. ברים שגיאה = SEM <img src="/files/ftp_upload/2252/2252fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. עקומת שיתוק עבור CL4176 תולעים חשופים 0.48 mM cafestol (Sigma). ברים שגיאה = SEM

<ol><li>Arya, U., Dwivedi, H., Subramaniam, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reserpine+ameliorates+Abeta+toxicity+in+the+Alzheimer%27s+disease+model+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 44, 462-466 (2009).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313, 1604-1610 (2006).</li>
<li>Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+phenotyping+of+a+transgenic+C.+elegans+expressing+neuronal+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta.</a> J Alzheimers Dis. , (2009).</li>
<li>Drake, J., Link, C. D., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+precedes+fibrillar+deposition+of+Alzheimer%27s+disease+amyloid+beta-peptide+%281-42%29+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model.</a> Neurobiol Aging. 24, 415-4120 (2003).</li>
<li>Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+aggregation+of+beta-amyloid+peptide+variants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants.</a> J Neurochem. 71, 1616-1625 (1998).</li>
<li>Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+insulin-receptor+signaling+promotes+the+autophagic+degradation+of+beta-amyloid+peptide+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans.</a> Autophagy. 3, 569-580 (2007).</li>
<li>Fonte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+in+vivo+beta-amyloid+peptide+toxicity+by+overexpression+of+the+HSP-16.2+small+chaperone+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein.</a> J Biol Chem. 283, 784-7891 (2008).</li>
<li>Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V., Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AIP-1+ameliorates+beta-amyloid+peptide+toxicity+in+a+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Hum Mol Genet. 18, 2739-2747 (2009).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+beta-amyloid+peptide+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9368-9372 (1995).</li>
<li>Link, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+in+a+transgenic+Caenorhabditis+elegans+Alzheimer%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model.</a> Neurobiol Aging. 24, 397-413 (2003).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta-induced+pathological+behaviors+are+suppressed+by+Ginkgo+biloba+extract+EGb+761+and+ginkgolides+in+transgenic+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 26, 13102-13113 (2006).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול שתיארנו ניתן להשתמש ביעילות כדי assay את ההשפעות הרעילות של תרכובות על Aβ. פורסם דוגמאות כוללות את השפעת גינקו בילובה תמצית המרכיבים (וו et al. 2006) ו - רסרפין (אריה et al. 2009). תרכובות כי כבר מגן מפני רעילות Aβ במערכות אחרות יש גם הוכח להיות מגן במודל זה (למשל, ממנטין, התוצאות שלנו לא פורסם). הרציונל חשוב להקמת מודל זה היא כי מפותח כלים גנטיים ומולקולריים זמין ב C. elegans יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים של רעילות Aβ. לפיכך, השפעת מוטציות ספציפיות על רעילות Aβ ניתן assayed (למשל, את ההשפעה של הפחתת דמוי אינסולין איתות על ידי החדרת daf-2-הפסד של פונקציית מוטציה, Florez-מקלור et al. 2007), המודל הזה יכול גם ניתן להשתמש כדי לבחון את ההשפעות של מעל ביטוי transgenes (פונטה et al. 2008). עשינו לאחרונה שימוש נרחב במודל זה כדי לבחון את ההשפעות על הרעילות של יחיד החלפות חומצות אמינו Aβ (נתונים שלא פורסמו). המודל המתואר כאן מהונדס מבחני ההשפעה של הביטוי Aβ חריפה על תפקוד תא שריר. בזמנו של שריר תאים שיתוק sarcomere שלהם הם שלמים; את הפנוטיפ שיתוק אינו תוצאה של מוות של תאים בשריר. עם זאת, לאחר שיתוק (~ 48 שעות לאחר upshift הראשונית) יש פירוט של שלמות השריר ועל המוות הסופי של התולעים. אנחנו לא בחנו את האפקט הזה במורד הביטוי Aβ או השתמשו בו כסמן רעילות. Aβ ועין מתנהלת ביטוי המודל המתואר כאן אינו מתאים חוקרת טיפולים לווסת β עמילואיד היווצרות כשלעצמה. למרות תולעים מהונדס עם טופס ביטוי מכוננת Aβ פיקדונות עמילואיד לזיהוי בקלות (פיי et al 1998;.. Link et al 2001), תולעים מהונדס עם הביטוי Aβ ועין מתנהלת לעתים נדירות יש מרבצי העמילואיד ואת הפנוטיפ מופיע שיתוק עצמאית של בתצהיר עמילואיד (דרייק et al. 2003). תוצאות המחקר עולות בקנה אחד עם הדעה כי רעילות חריפה הנגרמת ביטוי בתוצאות Aβ מהצטברות של Aβ oligomeric מסיסים, לא בתצהיר עמילואיד.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ריאגנטים </td><td> Quantity/2L </td><td> החברה / קטלוג # </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 6g </td><td> סיגמא אולדריץ / S9888 </td><td></td></tr><tr><td> אגר </td><td> 40 גרם </td><td> סיגמא אולדריץ / A7002 </td><td></td></tr><tr><td> Peptone </td><td> 5g </td><td> סיגמא אולדריץ / P0556 </td><td></td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 2L </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M CaCl 2 </td><td> 2ml </td><td></td><td> 147.02mg/mL ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> אורציל </td><td> 2ml </td><td></td><td> 2mg/mL ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> כולסטרול </td><td> 2ml </td><td></td><td> 5mg/mL באתנול (לא החיטוי) </td></tr><tr><td> 1M MgSO 4 </td><td> 2ml </td><td></td><td> 246.5mg/mL ב DDH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KPO 4 </td><td> 50 מ&quot;ל </td><td></td><td> 98mg KH 2 PO 4. מ&quot;ל, 48mg K2HPO4/mL ב DDH 2 O, ה-pH </td></tr><tr><td> Erlenmeyer Flask </td><td></td><td> VWR </td><td></td></tr></tbody></table>

assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

Assaying &beta;-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model

הצטברות של הפפטיד β עמילואיד (Aβ) הוא האמין בדרך כלל להיות מרכזי הגיוס של מחלת אלצהיימר, אך המנגנון הרלוונטי (ים) של רעילות עדיין אינם ברורים. Aβ מופקד גם לתוך שריר ב שררת הכללה גוף, מיופתיה אדם חמורה. תולעת למד באינטנסיביות נמטודות Caenorhabditis elegans יכול להיות מהונדסים transgenically להביע Aβ האדם. בהתאם הרקמה או העיתוי של הביטוי Aβ, תולעים מהונדס יכול לקבל פנוטיפים מדידים בקלות המשמשים לקריאה מתוך רעילות Aβ. לדוגמה, תולעים מהונדס עם הביטוי הפאן העצבית Aβ יש פגמים היא למידה אסוציאטיבית (Dosanjh et al 2009.), בעוד תולעים מהונדס במבט המכונן שריר ספציפי להראות תלויי גיל מתקדם, שיתוק הפנוטיפ (קישור, 1995; כהן ואח&#39; . 2006). אחת שימושית במיוחד C. elegans מודל מעסיקה מוטציה טמפרטורה רגיש במערכת מעקב mRNA מהנדס טמפרטורה ועין מתנהלת הביטוי שריר transgene Aβ, וכתוצאה מכך פנוטיפ שיתוק לשחזור על upshift טמפרטורה (Link et al. 2003). טיפולים נגד רעילות Aβ במודל זה [למשל, הביטוי של transgene מגן (חסן et al. 2009) או חשיפה תמציות גינקו בילובה (וו et al. 2006)] reproducibly לשנות את שיעור שיתוק הנגרם על ידי upshift הטמפרטורה של אלה מהונדס תולעים. כאן אנו מתארים פרוטוקול שלנו למדידת שיעור השיתוק הזה ג מהונדס דגם אלגנס, עם תשומת לב מיוחדת משתנים ניסיוניים, כי זה יכול להשפיע על המדידה.

התולעת נמטודות למד באינטנסיביות<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; יכול להיות מהונדסים transgenically לבטא את הפפטיד האדם β עמילואיד (Aβ). ביטוי מושרה של Aβ ב<em&gt; ג elegans</emשריר&gt; מוביל פנוטיפ, שיתוק לשחזור מהיר שיכול לשמש כדי לפקח על טיפולים לווסת רעילות Aβ.

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

ההצטברות של פפטיד ה-&beta;-amyloid ‏(A&beta;) נחשבת באופן כללי למרכזית בהשראה של מחלת האלצהיימר, אך ה... הרלוונטיים...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון את הרעילות של פפטיד בטא-עמילואיד במערכת מודל InVivo. השחזוריות והפשטות היחסית של בדיקה זו מאפשרות בדיקה מהירה של תרופות, תנאים סביבתיים או שינויים גנטיים על רעילות בטא-עמילואיד. גורם מרכזי בפיתוח בדיקה זו הוא יצירת תולעי cl egan's טרנסגניות עם ביטוי של פפטיד בטא-עמילואיד הניתן להשראה תרמית וספציפי לשרירים.ביטוי תלוי טמפרטורה זה끔 הנדס על ידי בניית טרנסגן המכיל אזור לא מתורגם (UTR) של' 3 ארוך באופן חריג, ההופך את ה-mRNA של הטרנסגן למטרה של מערכת הפיקוח על mRNA. לפיכך, הביטוי של טרנסגן זה הוא דל בתולעים מסוג פרא בעלות מערכת פיקוח תקינה על mRNA, עקב פירוק ה-mRNA של הטרנסגן. אם טרנסגן זה מוחדר לרקע גנטי המכיל מוטציה ברכיב חיוני של מערכת הפיקוח על mRNA, ביטוי הטרנסגן יהיה גבוה משמעותית. אם הרקע הגנטי מכיל מוטציה תלוית טמפרטורה במערכת הפיקוח על mRNA, הרי שהנחלה של זן טרנסגני זה בטמפרטורה לא מאפשרת תחסום את פירוק ה-mRNA של הטרנסגן ותביא לביטוי גבוה של הטרנסגן. תולעים טרנסגניות המשתמשות במערכת זו כדי לווסת את הביטוי של פפטיד בטא-עמילואיד בשרירי דופן הגוף, יעניקו תגובה להעלאת הטמפרטורה מ-16 °C ל-25 °C בצורה של הצטברות גבוהה של פפטיד בטא-עמילואיד, תפקוד לקוי של תאי השריר ושיתוק של התולעים, תוך מדידה של הזמן.נדרש אוכלוסייה של תולעים טרנסגניות אלו כדי להגיע לשיתוק לאחר העלאת טמפרטורה. העלאה זו מהווה בדיקה רגישה לרעילות של beta amyloid. הדבר מושג על ידי הכנת מצעי גידול טריים לנמטודות עבור בדיקת השיתוק, דבר המסייע בצמצום משתנים סביבתיים העלולים להשפיע על שיעורי השיתוק.כשלב שני, מקימים אוכלוסיות מסונכרנות גילאים של תולעים טרנסגניות, דבר הממזער את השפעות שלב ההתפתחות על ביטוי הגן הטרנסגני. לאחר מכן, תולעים מסונכרנות בשלב הזחל השלישי מועברות מטמפרטורה של 16 °C ל-25 °C, מה שמגביר את יציבות ה-mRNA של הגן הטרנסגני ומוביל להצטברות של פפטיד בטא-עמילואיד. מדידת הזמן מרגע העלאת הטמפרטורה ועד להופעת שיתוק בכל תולעת מאפשרת לקבוע את קצב הליקוי התפקודי של השרירים, ובכך לבחון את ההשפעות הרעילות של הצטברות פפטיד בטא-עמילואיד; התוצאות המתקבלות מראות את השפעתם של טיפולים ספציפיים על הרעילות של פפטיד בטא-עמילואיד המבטא באופן אנדוגני.היתרון המרכזי של הטכניקה שלנו, לעומת שימוש במודלים של עכברים טרנסגניים לבדיקת פעילות תרופתית, הוא היכולת לבצע אותה במהירות רבה יותר ובעלות נמוכה בהרבה. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. דירוג של תולעי L4 בבדיקת שיתוק הוא קשה מאוד ללמידה.לכן, כאשר אתם מעריכים תולעת בשלב L4 משותקת, עליכם לבחון את התנועה המבודדת של אזור הראש של התולעת. ברגע שחלק זה נע בעוד שכל שאר גוף התולעת משותק, נגדיר תולעת זו כמשותקת. ניסויי שיתוק מבוצעים על מצע גידול סטנדרטי לנמטודות (NGM), המשמש באופן שגרה לגידול וגנטיקה של *C. elegans*.להכנת המצעים, עקרו באוטוקלב את תמיסת ה-NGM המכילה sodium chloride, agar ופפטיד בבליל ארלנמאייר, ולאחר מכן הוסיפו את הכמויות המתאימות של התמיסות הסטריליות הבאות המפורטות בפרוטוקול הכתוב המצורף. חלקו 10 milliliters של NGM נוזלי לכל צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר על 15 מילימטר. הניחו ל-NGM להת굳ד במהלך הלילה בטמפרטורת החדר.אם בודקים את השפעותיהם של תרכובות או תמציות, יש לחלק את התמצית למנות בכל צלחת ולהשתמש במפריד (spreader) כדי להפיץ אותה באופן שווה על פני שטח הצלחת. יש להניח לצלחות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. נפחים הגדלים מ-1 mL ידרשו זמן ייבוש ממושך יותר.לאחר מכן, טפטפו על כל צלחת 250 µL של זן *E. coli* OP 50 שגודל במצע LB למשך לילה עד לצפיפות אופטית של 0.4 עד 0.6, והמתינו לייבוש החיידקים למשך לילה בטמפרטורת החדר. לגיל הצלחת השפעה משמעותית על שיעור השיתוק, ובהתאם לכך צלחות ישנות נוטות להתייבש. יש למזוג את הצלחות תוך שבוע לפני ביצוע בדיקת השיתוק.באופן אידיאלי, מומלץ להשתמש בצלחות שנשפכו שלושה עד ארבעה ימים לפני הנחת הביצים הסינכרונית; כל הצלחות המשמשות בניסוי כלשהו צריכות להגיע מאותה סדרה. שינוי של גודל המצע (lawn) ו/או של חיידקי ה-bacteria ישנה גם הוא ישפיע על התנהגות התולעים. ניתן לבצע בדיקות שיתוק (Paralysis assays) באמצעות זני e coli חלופיים. לדוגמה, HT15 משמש בניסויי RNAi. עם זאת, דבר זה עשוי לשנות את הקינטיקה של בדיקת השיתוק.לפיכך, יש להשתמש בביקורות פנימיות המתאימות לזן. זן CL 476 הוא הנפוץ ביותר לבדיקת שיתוק המושרה על ידי בטא. זן זה ומודלים טרנסגניים אחרים זמינים לחוקרים אקדמיים תמורת תשלום סמלי ממרכז הגנטיקה של Saint Ahadi.כדי למקסם את סנכרון הגיל של אוכלוסיית הבדיקה, עדיף להתחיל עם דור הורים מסונכרן. שבוע לפני תחילת בדיקת השיתוק של אוכלוסיית הבדיקה, השתמשו במלקח תולעים מפלטינה כדי להעביר 20 עד 30 מבוגרים בשלב ה-grave למספר מצעי NGM של 10 סנטימטר.הפריסו עם OP 50 להטלת ביצים במשך שעתיים בטמפרטורה של 16 degrees Celsius, שהיא הטמפרטורה המאפשרת עבור CL 4 1 76. הסירו את המבוגרים של GR ואפשרו לצאצאים לגדול במשך שבעה ימים, עד לרגע שבו יהיו מבוגרים של היום השני לגרביטציה. גרביטציה של היום השני.משתמשים בבוגרים כדי להכין אוכלוסיות בדיקה סינכרוניות גיל עבור כל תנאי ניסויי. המטרה היא להפיק פלטות בשלוש חזרות המכילות 50 עד 75 תולעים סינכרוניות גיל באמצעות מחט פלטינה לבחירת תולעים. העבירו 10 עד 12 בוגרים בשיא פריונם (day two graver) אל פלטות NGM של 60 מילימטר המוכתמות ב-OP 50. אפשרו לתולעים להטיל ביצים בטמפרטורה של 16 degrees Celsius למשך שעתיים, לאחר מכן הסירו את הבוגרים ואפשרו לביצים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 16 degrees Celsius.בשלב זה, מומלץ שמי שלא יבצע את דירוג הפלטות יקודד אותן, כדי שהדירוג יתבצע באופן עיוור לתנאי הניסוי. שלב ההתפתחות העוברית בעת הנחת הביצים, שהוא בערך שלב 26 התאים עבור תולעים מסוג פרא בתנאים אופטימליים, הוא פונקציה של גיל המבוגרים והתזונה שלהם. אם המבוגרים ששימשו להנחת הביצים הם מבוגרים יותר או רעבים, יונחו ביצים בשלבים מאוחרים יותר ולא תושג אוכלוסייה סינכרונית, דבר שישפיע על הקינטיקה של בדיקת השיתוק.חיוני להשתמש בתרביות חיידקים מونو-גניות כגון e coli, OP 50, מכיוון שזיהום חיידקי מכל סוג עלול להשפיע קשות על בדיקה זו. השחזוריות היא הגבוהה ביותר כאשר בצלחות השלישייה יש מספר דומה של תולעים. כדי להשרות את הגן התחליפי ולבצע את בדיקת השיתוק, העלו את טמפרטורת הצלחות ל-25 degrees Celsius.48 שעות לאחר סיום הנחת הביצים הסינכרונית, התולעים צריכות להיות בשלב הלרוות השלישי. יש לסדר את הפלטות ללא ערימה בתוך אינקובטור בטמפרטורה של 25 degree Celsius כדי לאפשר לפלטות להגיע לטמפרטורה זו. במקביל, יש להתחיל בדירוג השיתוק של התולעים 18 עד 20 שעות לאחר תחילת העלאת הטמפרטורה.בשלב זה, כל התולעים באוכלוסייה אמורות היו להגיע לשלב הלרבה הרביעי; המשיכו בתיעוד התוצאות במרווחי זמן של שעתיים, עד שכל התולעים בכל אחת מהצלחות הפטרי יהיו משותקות. מסיבות לא ידועות, השתיקה אינה אחידה לאורך הגוף. אזור הראש הוא החלק האחרון של התולעת שחדל מלזוז.לפיכך, תולעים שרק החלו לעاني משיתוק אינן יכולות לנוע לאורך הפיתה, אך הן יכולות להניע את ראשיהן, ובכך לנקות את החיידקים מסביב לקדמת גופן ולהותיר הילה של חיידקים שנוקו. תולעים אלו יהפכו בהכרח למשותקות לחלוטין, ולכן תולעים בעלות הילות מאופיינות כמשותקות. חלק מהתולעים לא יציגו הילות, אך גם לא יראו תנועה ספונטנית.אלו נבדקים על ידי דקירה בעזרת דוקר התולעים. אם תולעת שנדקרה אינה מסוגלת לבצע התפשטות של גל גוף מלא בעקבות הדקירה, היא תיסמן גם היא כמשותקת לצורך דירוג יעיל. הדרך הקלה ביותר היא להעביר את התולעים המשותקות לסקטור בצלחת שאינו מסומן, כדי שלא ייסמנו שוב בטעות במועד הדירוג הבא.דבר זה מאפשר גם לתולעים שסווגו באופן שגוי להפגין תנועה, מה שמאפשר תיקון של הניקוד כדי להפיק עקומת שיתוק. בכל נקודת זמן, החלק של התולעים בכל צלחת שלא שותקו מומר לאחוזים, ואחוז התולעים שאינן משותקות בממוצע נסרט מול הזמן מרגע תחילת ה-upshift. העקומה המתקבלת היא אנלוגית מבחינה פורמלית לעקומת הישרדות, ולכן ניתן לנתח אותה באמצעות סטטיסטיקה סטנדרטית לא-פרמטרית של הישרדות.את העלאת המתח (upshift) של תולעי ה-beta-amyloid טרנסגניים המבטאים את החלבון תחת מקדם myo-3 יש לבצע עד אמצע שלב L4, כדי שיתחיל תהליך השיתוק. מקדם myo-3 מווסת התפתחותית. ברגע שהתולעים מגיעות לשלב L4 מאוחר או לבגרות, רמת הביטוי יורדת באופן משמעותי.הביטוי של הגן הטרנסגני נחסם אם התולעים רעבות, לכן חיוני מאוד שהתולעים יוזנו היטב לאורך כל הניסוי. מעולם לא צפינו תולעת משותקת מחלימה תחת שום תנאי. לאחר 12 עד 16 שעות של Upshift, זן CL 41 76 יהיה משותק, ללא קשר לשאלה אם תבצעו downshift ל-16 degrees; בזן CL 41 76, עלייה בביטוי הגן הטרנסגני הגורמת לשיתוק עשויה להתרחש גם בטמפרטורות נמוכות יותר.עם זאת, שימו לב כי עיתוי שיעור השיתוק יושפע. שיעור השיתוק תלוי בזן הטרנסגן הספציפי שבו נעשה שימוש. בנינו שלושה זני myo A beta ששיעור השיתוק שלהם מהיר יותר או איטי יותר מזה של CL 41 76, ולכן עליכם להתאים את חלון הדירוג עבור בדיקת השיתוק בהתאם.מוצג כאן גרף של עקומת שיתוק עבור CL 4 1 76, הן ללא טיפול והן לאחר חשיפה ל-6.27 millimolar של קפאין. טיפול זה גורם לעיכוב מובהק סטטיסטית בשיתוק של כארבע שעות, דבר שאנו מפרשים כאינדיקציה לדיכוי של רעילות בטא. במודל זה, ניסוי זה בחן את ההשפעות של תרכובת נוספת הנמצאת בקפה.הגרף אופייני לטיפולים שאינם משפיעים על רעילות בטא. שימו לב שבשני הניסויים, כמחצית מאוכלוסיות ה-CL 4 1 76 שלא טופלו היו משותקות לאחר 24 שעות, והשיתוק היה מלא עד לשעה ה-28. אלו הם לוחות זמנים טיפוסיים לשיתוק של קבוצת הביקורת.באוכלוסיות של CL 4 1 7 6, סטיות משמעותיות מעיתוי זה מעידות על תנאי סביבה שונים או על מחיקה ספונטנית של עותקים של הגן המועבר. עיינו בפרוטוקול המצורף לקבלת מידע נוסף על זן CL 4 1 76. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור את גיל המצעים, את שלב התפתחות אוכלוסיית התולעים ואת היכולת להעריך את שיעור השיתוק של התולעים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש במערכת של תולעי הים הללו כדי לבחון במדויק את הרעילות של בטא-עמילואיד. אתם תהיו מסוגלים לזהות השפעות עדינות למדי של טיפולים תרופתיים או סביבתיים שונים על רעילות זו. המשתנים שדנו בהם חשובים לתשומת לבכם, שכן הם יאפשרו לכם לבצע את הבדיקה באופן הדיר באופן רב ועם קינטיקת שיתוק עקבית.זהו למעשה נושא חשוב למדי אם ברצונכם להשוות את התוצאות שהושגו במעבדה שלכם בזמנים שונים על ידי אנשים שונים, או להשוות את תוצאותיכם לאלו של חוקרים אחרים המשתמשים במודל מערכת זה.

assaying-amyloid-toxicity-using-a-transgenic-c-elegans-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

בסרטון זה, אנו מתארים שיטה להערכת ההשפעה הנוירו-פרוטקטיבית של תרכובת בדיקה, אסטרגלנית, על הישרדות עצבית ב- Caenorhabditis elegans מרעילות עצבית בתיווך polyQ. הבדיקה משתמשת ב- Caenorhabditis elegans המבטאים את החזרות polyQ המורחבות באופן חריג המאוחות ל- GFP בנוירוני ה- ASH שלהם כדי למדוד הישרדות עצבית לאחר טיפול בתרכובת בדיקה.

בדיקה לחקר ההשפעה של תרכובת בדיקה נגד רעילות עצבית בתיווך PolyQ בתולעים

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

התפשטות דמוית פריון של אגרגטים חלבוניים התגלתה לאחרונה כמעורבת במחלות ניווניות רבות. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר כיצד להשתמש בנמטודה C. elegans כמערכת מודל לניטור התפשטות חלבון ולחקירת תופעות דמויות פריון.

חוקר את החלבונים כמו פריון-הפצת ורעילות של שימוש במטזואניים דגם אורגניזם<em&gt; C. elegans</em

תיאר כאן היא מבוימת, התנהגות ההקרנה התנהגותית שניתן להשתמש בהם כדי המסך עבור תרכובות כי התערוכה יעילות vivo על התנהגויות מוטוריות קוגניטיבית ופונקציונלית מודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס β ו tauopathy. שיטות אלה מותאמות לתצוגת תרכובות עבור פעילות במשימות זיכרון לטווח קצר ולזיכרון עבודה.

הערכה של חלופה ספונטנית, זיהוי אובייקטים רומנטי ו Clbing איברים מודלים עכבר מהונדס של Amyloid-β ו נוירופתולוגיה טאו

אנו מתארים פרוטוקולים עבור באמצעות פלטפורמת מעקב נמטודות רחב שדה-of-view (WF-NTP), המאפשרת אפיון פנוטיפי תפוקה גבוהה של אוכלוסיות גדולות של Caenorhabditis elegans. פרוטוקולים אלה ניתן לאפיין שינויים התנהגותיים עדינים זנים מוטציה או בתגובה טיפול תרופתי באופן מדרגי במיוחד.

אוטומטיות התנהגותית ניתוח של גדול C. elegans אוכלוסיות שימוש רחב שדה-of-view מעקב פלטפורמה

שיטה כמותית פותחה כדי לזהות ולחזות את רעילות חריפה של כימיקלים על-ידי ניתוח באופן אוטומטי את פרופיל פנוטיפי של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מתאר כיצד להתייחס תולעים עם כימיקלים בצלחת 384-ובכן, לכידת וידאו, לכמת פנוטיפים קשורים רעילות.

וזמינותו תפוקה גבוהה עבור חיזוי של רעילות כימית על ידי אוטומטית פרופילים פנוטיפי של Caenorhabditis elegans

מוצרי העברה שאינם תלויי ATG הקשורים לחזרה מתגלים כתכונות פתוגניים של מחלות מבוססות הרחבה חוזרות. מטרת הפרוטוקול המתואר היא להעריך רעילות הנגרמת על ידי פפטידים אלה באמצעות בחני התנהגות הסלולר מערכת המודל C. אלגיה.

מדידת רעילות ב -C. אלגיה

ירידה פרוטאוסטלית היא סימן היכר של הזדקנות, להקל על תחילת מחלות ניווניות. אנו מתארים פרוטוקול כדי למדוד באופן כנותב פרוטאוסטזיס בשתי רקמות אלגנים שונים Caenorhabditis באמצעות ביטוי הטרולוגי של פוליגלוטמין חוזר התמזג לכתב פלואורסצנטי. מודל זה מאפשר ניתוח גנטי מהיר של פרוטאוסטזיס.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

כאן, אנו מציגים ומתארים נרחב נגיש מתודולוגיות ניצול כמה דגמים נמטודות צדדי, כולל היפרפעיל יון ערוץ המושרה נמק וחלבון הנגרמת המושרה נוירורעילות, כדי לפקח ולנתח את בסיס הסלולר והמולקולריים של מחלות ניווניות הקשורים גיל.

דוגמנות גיל הקשורים מחלות ניווניות בתוך האלאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להערכת הפעילויות הנוירו-הגנתיות של תרכובות בדיקה ב - Caenorhabditis elegans, כולל צבירה של פוליגלוטמין, מוות עצבי והתנהגות כימואבואידית, כמו גם שילוב מופתי של פנוטיפים מרובים.

Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לגילוי תרכובות ביו-אקטיביות נגד רעילות עצבית בתיווך פוליגלוטמין

למדו לבחון רעילות של פפטיד β-עמילואיד בדגם טראנסגני של Caenorhabditis elegans. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מהירה של שיתוק שרירים הנגרם מהצטברות Aβ, ומסייע בבדיקת השפעות תרופתיות וגנטיות על מחלת אלצהיימר.

Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

גלה סרטונים נוספים