Assaying β עמילואיד רעילות באמצעות טראנסגנטי ג elegans דגם

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את הרעילות של פפטיד הבטא עמילואיד במערכת מודל InVivo. יכולת השחזור והפשטות היחסית של בדיקה זו מאפשרת בדיקה מהירה של תרופות, תנאים סביבתיים או שינויים גנטיים על רעילות בטא עמילואיד. גורם מפתח בפיתוח בדיקה זו הוא יצירת תולעי cl egan טרנסגניות עם ביטוי מעורר טמפרטורה ספציפית לשריר של פפטיד בטא עמילואיד.

ביטוי רגיש לטמפרטורה זה מהונדס על ידי בניית טרנסגן המכיל אזור לא מתורגם באורך חריג של שלושה ראשוניים, מה שהופך את ה-mRNA הטרנסגן למטרה של ביטוי מעקב ה-mRNA של טרנסגן זה ולכן גרוע בתולעים מסוג בר עם מערכת מעקב mRNA פונקציונלית עקב פירוק ה-mRNA הטרנסגן. אם טרנסגן זה מוחדר לרקע גנטי המכיל מוטציה במרכיב חיוני של מערכת המעקב mRNA, ביטוי הטרנסגן יהיה גבוה משמעותית. אם הרקע הגנטי מכיל מוטציה רגישה לטמפרטורה במערכת המעקב mRNA, אז התפשטות הזן הטרנצ'גני הזה בטמפרטורה הלא מתירנית תחסום את פירוק ה-mRNA של גן התעלה ותגרום לביטוי גן תעלה גבוה תולעים טרנצ'גניות המשתמשות במערכת זו כדי לווסת את ביטוי שרירי דופן הגוף של העלאת טמפרטורת פפטיד בטא עמילואיד מ-16 מעלות צלזיוס ל-25 מעלות צלזיוס. מביא להצטברות גבוהה של תפקוד לקוי של פפטיד בטא עמילואיד של תאי השריר ושיתוק של מדידת התולעים באותה תקופה.

נדרשת אוכלוסייה של תולעים טרנסגניות אלה כדי להפוך למשותקת לאחר הטמפרטורה. Upshift היא בדיקה רגישה לרעילות בטא עמילואיד. זה מושג על ידי הכנת לוחות מדיה לגידול נמטודות טריים לבדיקת השיתוק, מה שעוזר למזער משתנים סביבתיים שיכולים להשפיע על שיעורי השיתוק.

כשלב שני, אוכלוסיות מסונכרנות גיל של תולעים טרנסגניות או יוזמות, זה ממזער את ההשפעות של שלב ההתפתחות על ביטוי טרנסגנים. לאחר מכן, שלב הזחל השלישי המסונכרנים הם העלאת הילוכים מ-16 מעלות צלזיוס ל-25 מעלות צלזיוס, מה שמגביר את היציבות של mRNA טרנסגן ומוביל להצטברות של פפטיד בטא עמילואיד. מדידת הזמן מהעלאת הילוכים לשיתוק עבור כל תולעת לוכדת את קצב תפקוד השרירים הלקוי, ובכך בודקת את ההשפעות הרעילות של הצטברות פפטיד בטא עמילואיד מתקבלות תוצאות המראות את ההשפעה של טיפולים ספציפיים על הרעילות של פפטיד בטא עמילואיד המתבטא באופן אנדוגני.

אז היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו, בניגוד לשימוש במודלים של עכברים טרנסגניים כדי לבחון את פעילות הסמים, הוא שאנחנו יכולים לעשות את שלנו הרבה יותר מהר והרבה פחות יקר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית. קשה מאוד ללמוד את הניקוד של תולעים L ארבע בבדיקת שיתוק.

אז כשאתה קולע תולעת L ארבע משותקת, מה שאתה רוצה להסתכל עליו הוא תנועת ההילה המבודדת של אזור הראש של התולעת. ברגע שזה זז וכל הגוף של התולעת משותק, היינו מדרגים את התולעת כמשותקת. מאמרי שיתוק מבוצעים על צלחות של מצע גידול נמטודות סטנדרטי או NGM המשמש באופן שגרתי להתפשטות וגנטיקה של CL egan.

להכנת חיטוי צלחות, תמיסת ה-NGM המכילה נתרן כלורי, אגר ופפטיד בבקבוק ארלנמאייר, ולאחר מכן הוסף את הכמויות המתאימות של התמיסות הסטריליות הבאות שניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב הנלווה. הכניסו 10 מיליליטר של NGM נוזלי לכל צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר על 15 מילימטר. הניחו ל-NGM להתמצק למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

אם בודקים את ההשפעות של תרכובות או תמציות, יש להצמיד את התמצית לכל צלחת ולהשתמש במפזר כדי לפזר אותה באופן שווה על פני הצלחת. הניחו לצלחות להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. נפחים מעל מיליליטר אחד ידרשו יותר זמן לייבוש.

לאחר מכן, כל צלחת עם 250 מיקרוליטר של זן אי קולי OP 50 שגדל במדיה LB בן לילה לצפיפות אופטית של 0.4 עד 0.6, מאפשר לחיידקים להתייבש למשך הלילה בטמפרטורת החדר. לגיל הצלחת יש השפעה משמעותית על קצב השיתוק, וככזה צלחות ישנות יותר נוטות להתייבש. יש לשפוך צלחות תוך שבוע מבדיקת השיתוק.

באופן אידיאלי, אתה רוצה להשתמש בצלחות שנשפכו שלושה עד ארבעה ימים לפני הטלת הביצים הסינכרוניות שלך צלחות המשמשות בכל ניסוי צריכות להגיע מאותה אצווה המשנה את גודל הדשא או שהחיידקים ישנו גם את התנהגות התולעים ניתן לבצע בדיקות שיתוק באמצעות זני אי קולי חלופיים. לדוגמה, HT one 15 משמש בניסויי RNAi. עם זאת, זה עשוי לשנות את הקינטיקה של בדיקת השיתוק.

לכן, עליך להשתמש בבקרות פנימיות המתאימות למתח. CL 476 משמש לרוב לבדיקת שיתוק הנגרם על ידי בטא. זן זה ומודלים טרנסגניים אחרים זמינים לחוקרים אקדמיים תמורת תשלום סמלי מהמרכז הגנטי סנט אהדי.

כדי למקסם את סנכרון הגיל של אוכלוסיית הבדיקה, עדיף. התחל עם דור הורים מסונכרן. שבוע לפני תחילת בדיקת השיתוק של אוכלוסיית הבדיקה, השתמש בקוטף תולעי פלטינה כדי להעביר 20 עד 30 בוגרים קברים על כמה לוחות NGM של 10 סנטימטרים.

מורחים עם OP 50 למשך שעתיים הטלת ביצה בחום של 16 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה המתירנית עבור CL 4 1 76. הסר את הבוגרים של GR ואפשר לצאצאים לגדול במשך שבעה ימים ועד אז הם יהיו בוגרים קברים ביום השני. כוח המשיכה של היום השני.

מבוגרים משמשים להכנת אוכלוסיות הבדיקה הסינכרוניות לגיל עבור כל תנאי ניסוי. המטרה היא ליצור לוחות משולשים המכילים תולעים סינכרוניות בגילאי 50 עד 75 באמצעות קוטף תולעי פלטינה להעביר 10 עד 12 ביום, שני בוגרים חמורים יותר על לוחות NGM של 60 מילימטר שזוהו עם OP 50. אפשרו לתולעים להטיל ביצים בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, ואז קטפו את הבוגרים ואפשרו לביצים לבקוע ולגדול בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס.

בשלב זה, עדיף שיהיה מישהו שלא יקלע את הלוחות כדי לקודד אותם כך שהציון יהיה עיוור לתנאי הניסוי. שלב ההתפתחות העוברית בעת הטלת הביצים, שהוא בערך שלב 26 התאים עבור תולעים מסוג בר בתנאים אופטימליים, הוא פונקציה של גיל בוגר ותזונה. אם הכבידה הבוגרת המשמשת להטלת הביצים מבוגרת יותר או מורעבת, יוטלו ביצים בשלבים מאוחרים יותר והאוכלוסייה הסינכרונית לא תושג, ובכך תשפיע על הקינטיקה של בדיקת השיתוק.

חיוני להשתמש בתרביות חיידקים מונוגניות כגון אי קולי, OP 50 מכיוון שזיהום חיידקי מכל סוג יכול להשפיע קשות על בדיקה זו. יכולת השחזור היא הגבוהה ביותר אם לצלחות המשולשות שלך יש מספר דומה של תולעים כדי לגרום לטרנסגן ולבצע את בדיקת השיתוק. לוחות העלאת הילוך ל-25 מעלות צלזיוס.

48 שעות לאחר סיום הטלת הביצים הסינכרונית תולעת צריכה להיות בשלב הזחל השלישי. יש לסדר את הצלחות מבלי לערום בחממה של 25 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לצלחות להגיע לטמפרטורה זו. במקביל, התחל לנקד את שיתוק התולעים 18 עד 20 שעות לאחר תחילת העלייה.

בשלב זה, כל התולעים באוכלוסייה היו צריכות להגיע לשלב הזחל הרביעי, להמשיך לקלוע במרווחים של שעתיים עד שכל התולעים בכל אחת מהלוחות משותקות. מסיבות לא ידועות, שיתוק אינו אפילו לאורך הגוף. אזור הראש הוא החלק האחרון של התולעת שמפסיק לנוע.

לפיכך, תולעים שהחלו לאחרונה בשיתוק אינן יכולות לתרגם את הצלחת, אלא יכולות להזיז את ראשיהן, ובכך לנקות חיידקים סביב החלק הקדמי שלהן ולהשאיר הילה של חיידקים מנוקים. תולעים אלו תמיד יהפכו למשותקות לחלוטין ולכן תולעים עם הילות מאופיינות כמשותקות. לחלק מהתולעים לא יהיו הילות, אך גם לא יראו תנועה ספונטנית.

אלה נבדקים על ידי דחיפה עם קוטף התולעים. אם תולעת נדחפת אינה יכולה לעבור התפשטות גלי גוף מלאים בעת הדחיפה, היא גם מדורגת כמשותקת לניקוד יעיל. הכי קל להעביר את התולעים המשותקות לחלק לא מנוקד של הצלחת כדי שלא יקבלו ניקוד מחדש בטעות בתקופת הניקוד הבאה.

זה גם מאפשר לתולעים שסווגו באופן שגוי להפגין תנועה, מה שמאפשר תיקון ניקוד ליצור עקומת שיתוק. בכל נקודת זמן, חלק התולעים בכל צלחת שלא היו משותקות מומר לאחוז, והאחוז הממוצע שאין שני לו משורטט כנגד הזמן מרגע תחילת העלייה. העקומה המתקבלת מקבילה רשמית לעקומת הישרדות ולכן ניתן לנתח אותה באמצעות סטטיסטיקת הישרדות לא פרמטרית סטנדרטית.

העלאת תולעי הבטא הטרנסגניות של מיו שלוש A חייבת להתבצע באמצע שלב L ארבע על מנת להתחיל שיתוק. מקדם Myo Three מוסדר מבחינה התפתחותית. ברגע שהתולעים הגיעו ל-L ארבע או לבגרות, רמת הביטוי ירדה משמעותית.

הביטוי של הטרנסגן נחסם אם התולעים מורעבות, ולכן חיוני מאוד שהתולעים יוזנו היטב לאורך כל הניסוי. מעולם לא ראינו תולעת משותקת מתאוששת בשום תנאי. לאחר 12 עד 16 שעות של העלאת הילוכים, CL 41 76 יהפוך למשותק, ללא קשר אם אתה מוריד הילוך ל-16 מעלות במתח, CL 41 76 של ביטוי הטרנסגנים הגורם לשיתוק יכול להתרחש בטמפרטורות נמוכות יותר.

עם זאת, שימו לב שקצב השיתוק יושפע בעיתוי שלו. קצב השיתוק תלוי בזן הטרנסגן הספציפי בו נעשה שימוש. בנינו זני בטא של myo three A בעלי קצב שיתוק מהיר ואיטי יותר מה-CL 41 76, וככזה, עליך להתאים את חלון הניקוד שלך לבדיקת השיתוק בהתאם.

מוצגת כאן תרשים של עקומת שיתוק עבור CL 4 1 76, שניהם לא מטופלים וחשופים לקפאין 6.27 מילי-מולרי. טיפול זה מביא לעיכוב מובהק סטטיסטית בשיתוק של כארבע שעות, שאנו מפרשים כאינדיקציה לדיכוי רעילות בטא. במודל זה, ניסוי זה בדק את ההשפעות של תרכובת אחרת שנמצאת בקפה.

העלילה אופיינית לטיפולים שאינם משפיעים על רעילות בטא. שימו לב שבשני הניסויים, כמחצית מאוכלוסיות CL 4 1 76 הלא מטופלות משותקות ב-24 שעות והשיתוק הושלם ב-28 שעות. אלה מסגרות זמן אופייניות לשיתוק שליטה.

CL 4 1 7 6 סטיות משמעותיות מתזמון זה מעידות על שינוי בתנאי הסביבה או מחיקה ספונטנית של עותקים טרנסגנים. עיין בפרוטוקול הנלווה למידע נוסף על זן CL 4 1 76. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את גיל הצלחות, שלב אוכלוסיית התולעים והיכולת להעריך את קצב השיתוק של התולעים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להשתמש במערכת אלגן הים הזו כדי לבדוק בזהירות רעילות בטא עמילואיד. אתה אמור להיות מסוגל לזהות השפעות עדינות למדי על הרעילות הזו של מגוון טיפולים סביבתיים או תרופתיים. חשוב לשים לב למשתנים שדיברנו עליהם מכיוון שזה יאפשר לך לבצע את הבדיקה בצורה מאוד שחזורית ועם קינטיקה עקבית של שיתוק

זה למעשה די חשוב אם אתם רוצים להשוות את התוצאות שלכם שנעשו במעבדה שלכם בזמנים שונים על ידי אנשים שונים, או להשוות את התוצאות שלכם לחוקרים אחרים שמשתמשים במערכת המודל הזו.