השימוש Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl אסתר (CFSE) לפקח הפצת הלימפוציטים
12 באוקטובר 2010
CFSE קוולנטית תוויות חיים ארוכים מולקולות תאיים עם צבע פלואורסצנטי, carboxyfluorescein. ככזה, כאשר תא CFSE שכותרתו מתחלק, הצאצאים שלה יש מחצית מכמות הקרינה, אשר יכול לשמש ובכך להעריך את חלוקת התא. מאמר זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור תיוג לימפוציטים עכבר עם CFSE.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לתייג לימפוציטים עם הצבע הפלואורסצנטי התוך-תאי, CFSE, כך שניתן יהיה לנטר לימפוציטים לחלוקת תאים על ידי זרימה ציטומטרית. זה מושג על ידי ערבוב לימפוציטים עם CFDA se, שהיא צורת הדיאצטיל של CFSE. שתי קבוצות האצטיל מאפשרות לצבע להיכנס במהירות לתאים בתוך לימפוציטים.
אסטראזים מסירים את קבוצות האצטיל מה-C-F-D-A-S-E, ויוצרים את צורת ה-CFSE של הצבע. ללא קבוצות האצטיל, CFSE הופך פלואורסצנטי והוא גם פחות חדיר לממברנה, ובכך מרכז את הצבע בתוך התאים. שרשרת הצד האמינו התגובתי של CFSE מצמידה את הצבע לחלבונים תוך-תאיים, ובכך הופכת את התאים לפלואורסצנטיים כמעט לצמיתות.
ניתן להשתמש ב-CFSE כדי לנטר חלוקת לימפוציטים על סמך הנוכחות הרציפה של עוצמת הקרינה של תאי הבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון שילוב תימידין טריטי, הוא שניתן לנטר תאים בודדים לחלוקת תאים. מי שידגים את ההליך יהיה בן קווה, עמית מחקר מהמעבדה שלי על מנת לסמן תאים.
התחל עם לימפוציטים מבודדים טריים מהטחול או מבלוטות הלימפה של עכברים והוסף ריכוז של בין חצי ל -10 מיליון תאים למיליליטר של מדיום תרבית, בתוספת 5% חום. סרום עגל עוברי מושבת משהה ביסודיות את התאים ומעביר בזהירות מיליליטר אחד לתחתית צינור חרוטי טרי של 10 מיליליטר. הנח את הצינור אופקית בזהירות.
הוסף 110 מיקרוליטר PBS לחלק העליון של הצינור בחלק הלא רטוב של הפלסטיק, וודא שהוא לא יוצר מגע עם תמיסת התא. הוסף תמיסת צבע טרי של 1.1 מיקרוליטר ממלאי חמשת המילימולרים של C-F-D-A-S-E ל-110 מיקרוליטר של PBS. מכסה במהירות את הצינור והפוך ומערבולת היטב כדי לקבל ערבוב אחיד מהיר של התמיסות מכיוון שהצבע הופך לפלואורסצנטי ובכך נוטה להלבנה.
הגן על הצינור מפני אור על ידי כיסוי הצינור בנייר אלומיניום. דגרו את התאים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר שטפו את התאים על ידי דילול ב-10 נפחים של 20 מעלות צלזיוס, PBS המכיל 5% H-I-F-C-S משקע על ידי צנטריפוגה ב-300 Gs למשך חמש דקות ב-20 מעלות צלזיוס והשלכת הסופרנטנט. חזור על הכביסה פעמיים נוספות.
לאחר מכן ניתן ליישם תאים על פרוטוקול מעניין לאינדוקציה של חלוקת תאים. ניתן להשתמש בתאים מסומנים הן במבחני מבחנה והן במבחני invivo. בסיום בדיקת ההתפשטות, התאים נקצרים ומנותחים על ידי ציטומטריית זרימה.
בדוגמה זו, תיוג CFSE משמש במבחנה כדי למדוד כיצד תאי T מעכברים טרנסגניים מהונדסים גנטית מגיבים לתאים דנדריטיים פועמים בריכוזים שונים של אנטיגן. שיאי הדילול הלא מוצללים של CFSE מתארים CD טרנסגני שמונה תאי T חיוביים שהתחלקו פעם עד שלוש. ניתן לראות שיותר תאי T מתחלקים בריכוזים הגבוהים יותר של האנטיגן.
שיטת התיוג CFSE ניתנת גם למבחני in vivo כמו ניסויי העברה מאמצים. כאן משתמשים בפקס כדי לזהות את אוכלוסיית תאי ה-T המעניינים את העכברים המקבלים. פרופיל התפשטות CFSE עוקב מתאר CD שמונה תאי T חיוביים שהתחלקו פעם אחת עד שש פעמים בהתבסס על שיאי דילול CFSE לאחר התפתחותו.
הליך זה סלל את הדרך לחוקרים ולאימונולוגיה לחקור את התפשטות הלימפוציטים במהלך תגובה חיסונית.
סקירה
מאמר זה מתאר את הנוהל לסימון לימפוציטים מעכברים עם הצבע הפלואורסצנטי CFSE, המאפשר ניטור של חלוקת תאים באמצעות ציטומטריית זרימה. השיטה מאפשרת לחוקרים לעקוב אחר ריבוי לימפוציטים במהלך תגובות חיסוניות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ציטומטריית זרימה
רקע
- CFSE הוא צבע פלואורסצנטי המשמש לסימון חלבונים תוך-תאיים.
- הוא מאפשר הערכה של חלוקת תאים על ידי מדידת דילול הפלואורסצנטיות בתאי בת.
- טכניקה זו מציעה יתרונות על פני שיטות מסורתיות כמו שילוב תימידין מיוצר טריטיום.
- סימון CFSE יכול לשמש בבדיקות in vitro ו-in vivo כאחד.
מטרת המחקר
- להדגים את טכניקת סימון CFSE לניטור חלוקת לימפוציטים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים לעקוב אחריו.
- להדגיש את היישום של CFSE בחקר תגובות תאי T לנוגדנים.
שיטות בשימוש
- בידוד לימפוציטים מטחול עכבר או מבלוטות לימפה.
- ערבוב לימפוציטים עם CFDA SE כדי להקל על כניסת הצבע.
- דגירה ושטיפת תאים להסרת עודף הצבע.
- ניתוח ציטומטריית זרימה להערכת חלוקת תאים על בסיס דילול CFSE.
תוצאות עיקריות
- סימון CFSE מאפשר מעקב אחר חלוקת תאי T בתגובה לריכוזי אנטיגן משתנים.
- ציטומטריית זרימה מגלה שיאים מובחנים המתאימים לרמות חלוקה שונות של תאי T.
- השיטה יעילה הן ליישומים in vitro והן in vivo.
- התוצאות מדגימות את התועלת של CFSE במחקר אימונולוגי.
מסקנות
- סימון CFSE היא שיטה אמינה לחקר ריבוי לימפוציטים.
- טכניקה זו משפרת את ההבנה של תגובות חיסוניות.
- חוקרים יכולים להשתמש בשיטה זו לעיצובים ניסויים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
CFSE labeling enables precise tracking of lymphocyte proliferation, supporting target validation in immunology-focused drug discovery. By quantifying division at single-cell resolution, it de-risks mechanistic hypotheses and informs go/no-go decisions in early discovery. The method’s compatibility with multi-color flow cytometry enhances assay scalability and cross-functional data integration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring antigen-driven T cell division in response to varying stimulus concentrations.
- Operational Value: Provides quantitative, single-cell readouts that clarify pathway activation and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing biologically active compounds from inert controls based on proliferation profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, low-variance fluorescent labeling compatible with high-throughput flow cytometry workflows.
- Reproducibility: Enables consistent detection of up to eight division cycles, supporting assay qualification across sites and operators.
- Multiplexing Capacity: Integrates with other fluorochromes for simultaneous phenotyping and functional readouts in complex immune assays.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antigen-specific T cell responses applicable to vaccine, autoimmune, and oncology indications.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo validation via adoptive transfer models, preserving proliferation tracking fidelity.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by correlating proliferation depth with mechanistic potency and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
CFSE labeling functions as a discovery-phase tool that connects hypothesis testing in early immunology to lead optimization through quantifiable proliferation metrics.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses by linking antigen exposure to lymphocyte division kinetics, reducing ambiguity in target function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence dilution data enabling reliable comparison of test conditions across compound libraries.
- Analytics: Generates resolvable flow cytometry peaks corresponding to division cycles, supporting statistical comparison of proliferation indices.
- Translational Research: Enables continuity from reductionist in vitro assays to physiologically relevant in vivo models without re-labeling or assay redesign.
- Enterprise Reuse: Serves as a modular, plug-and-play labeling platform applicable across multiple immune cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving individual cell division histories obscured in bulk assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization through covalent, stable labeling with minimal technical variance and no requirement for radioactive handling.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by confirming target-mediated biological activity early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Enables objective, data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on proliferation efficacy and specificity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell handling, flow cytometry compensation, and fluorescence interpretation to avoid artifacts from dye quenching or aggregation.
- Dependent on access to calibrated flow cytometers with appropriate laser and filter sets for FITC-channel detection.
- Necessitates standardized washing protocols to remove extracellular dye and ensure signal specificity to intracellularly retained CFSE.
- Must account for potential dye toxicity at high concentrations or prolonged incubation, though source notes low toxicity under standard conditions.
- Requires light protection during staining and handling to prevent photobleaching and maintain signal integrity.
