96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ביופילמים של קנדידה אלביקנס, ולבחון את רגישותם לחומרים אנטי פטרייתיים. זה מושג על ידי יצירת הביופילמים הפטרייתיים הללו לראשונה על הבארות של 96. ובכן, לוחות מיקרוטיטר ואז אנטי-פטרייתיים מתווספים לביופילמים המוכנים מראש ומודגרים במשך 24 עד 48 שעות לאחר הדגירה הזו.

שיטה מטרית של צ'ול המודדת את הפעילות המטבולית של תאים בתוך הביופילמים משמשת למדידת הפעילות של תרופות אנטי-פטרייתיות אלה על מנת לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי של אנטי-פטריות כנגד ביופילמים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את היכולת ליצור ביופילמים ובדיקות רגישות אנטי פטרייתיות באמצעות שיטה פשוטה וקלה המבוססת על צלחת מיקרוטיטר 96 באר יחד עם קריאה מטרית צבעונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה, זולה יחסית, ניתנת לשחזור ומאפשרת היווצרות של מספר ביופילמים שווי ערך.

בנוסף, הוא תואם לטכנולוגיית פלטפורמת 96 בארות הזמינה בדרך כלל ברוב מעבדות המחקר והמעבדות הקליניות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הטיפול בכלבים. מכיוון שלעתים קרובות מאוד, זיהומים אלה קשורים להיווצרות הביופילם.

באמצעות טכניקות טיפול מיקרוביולוגיות מתאימות, שלפו לולאה מלאה בתאים מתת-תרבית טרייה של אלביקנים על לוחית נחושת דקסטרוז SAU Alan וחיסנו לבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של מרק דקסטרוז פפן שמרים, הניחו את התרבית בשייקר מסלולי המוגדר ב-180 RRP M ו-30 מעלות צלזיוס, והודגרו למשך הלילה לאחר הדגירה הלילית. יוצקים את תרביות השמרים לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב -3000 RBM למשך חמש עד 10 דקות. השליכו את מערבולת העל.

הכדור נמרץ כדי לבטל את ההפרדה בין התאים. לאחר מכן הוסף PBS סטרילי לשטיפה לפני שצנטריפוגה שוב את התרבויות. חזור על שלב הכביסה הזה פעם נוספת מאשר לכופף מחדש את התאים.

בכ-20 מיליליטר של RPMI 1640, בינוני חוצץ ל-pH 7.0. בעזרת תמיסה של מגבים של 165 מילי-מולרית ומחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס מהמתלה הזה, הכינו דילול של 1 עד 100 באמצעות ציטומטר המו רגיל ומיקרוסקופ שדה בהיר. ספור את התאים.

לאחר מכן הכינו השעיה סופית של תאים בפעם אחת 10 מתוך השישה למיליליטר בשימוש חם ב-RPMI 1640. שימוש בפיפטה רב-ערוצית ב-100 מיקרוליטר של תרחיף אלביקן ים לבארות נבחרות של צלחת מיקרוטיטר תחתונה שטוחה סטרילית של 96 בארות. השאר את הבארות בעמודה 12 ריקות מכיוון שהן ישמשו כבקרות שליליות.

לאחר כיסוי ואיטום הצלחת בפרפורם, דגרו אותה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי לאפשר לביופילם להיווצר. לאחר הדגירה יש לשאוב בעדינות ולהשליך את המדיה מכל באר. הקפדה לא לשבש את הביופילמים שנוצרו בתחתית.

לשטוף ב -200 מיקרוליטר PBS לכל באר ולנקז על ידי היפוך וניקוי הצלחת בזהירות על ערימת מגבות נייר. חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים. בשלב זה, ביופילמים ניתנים לזיהוי בעין וניתן לדמיין אותם באמצעות מיקרוסקופ הפוך באמצעות SEM.

אנו יכולים להעריך שהביופילמים מורכבים מתערובת שזורה של חוטים ותאי שמרים. לאחר אימות היווצרות הביופילם, ניתן להתחיל בבדיקה של חומרים אנטי פטרייתיים באמצעות RPMI 1640 בינוני מכין פתרונות עבודה בריכוז גבוה של החומרים האנטי פטרייתיים לבדיקה. ריכוזים גבוהים אופייניים הם 1024 מיקרוגרם למיליליטר עבור פלוקונזול ו-16 מיקרוגרם למיליליטר עבור אמפוטריצין B ופטריות CASPO ברי.

לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסות אנטי פטרייתיות לבארות בעמודה הראשונה ו -100 מיקרוליטר של RPMI 1640 חוצץ. בינוני עד בארות בעמודות 2 עד 11. בצע סדרה של דילול הכפלה סדרתי על ידי העברת 100 מיקרוליטר של התמיסות האנטי פטרייתיות בריכוז גבוה מבארות העמודה הראשונה לאלו של העמודה השנייה.

לאחר פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב פיפטה 100 מיקרוליטר מבארות של עמודה שתיים לאלה של עמודה שלוש וכן הלאה עד עמודה 10. אל תוסיף שום תמיסה נגד פטריות לעמודה 11, מכיוון שהיא תשמש כבקרה חיובית ותשליך את 100 המיקרוליטרים האחרונים מבארות עמודה 10. כל הבארות, למעט אלה שבעמודה 12.

כעת אמור להיות נפח סופי של 100 מיקרוליטר. מכסים את הצלחת, אוטמים אותה בבושם ודוגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר לתרופות האנטי-פטרייתיות לפעול לאחר הדגירה. ולאחר שטיפת הצלחת שלוש פעמים ב- PBS כמתואר קודם לכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת מדיון XTT לכל באר לכל הבארות, כולל בארות הבקרה השליליות.

בטור 12. מכסים את הצלחת, עוטפים אותה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מפני האור ומדגרים אותה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. כדי לאפשר התפתחות צבע לאחר הדגירה, פרקו את הצלחת.

תמיסת ה-XTT הברורה בתחילה תהפוך לכתומה לאחר שעובדה על ידי תאים פעילים מטבולית. העבירו 80 מיקרוליטר של הסופרנטנטים הצבעוניים לצלחת מיקרוטיטר תחתונה רעננה ושטוחה. השתמש בקורא לוחות מיקרוטיטר צבעוני המוגדר באורך גל של 490 ננומטר כדי לקרוא את הצלחת כפי שמוצג כאן בהיעדר תרופות אנטי-פטרייתיות, קריאות קולומטריות לא טופלו.

הביופילמים של מועמד SEA בשורות שונות הם שווי ערך. על מנת להעריך את ההשפעה של התרכובות האנטי פטרייתיות שנבדקו תחילה, הפחיתו ערך רקע ממוצע שהתקבל מבארות הבקרה השליליות בעמודה 12 מכל הערכים האחרים. לאחר מכן, חשב את אחוז העיכוב באמצעות הפקדים החיוביים בשורה 11.

כערכים המקסימליים, הריכוזים האנטי-פטרייתיים שבהם מזוהה ירידה של 50% או 80% בקריאות הצבעוניות, ידועים כריכוזים מעכבים מינימליים של ססיל. ערכים אלה משמשים בדרך כלל כמדד ייחוס לעוצמה של תרכובת. באמצעות שיטה פשוטה זו בתפוקה גבוהה, ניתן ליצור ביופילמים פטרייתיים במבחנה תוך 24 שעות, וניתן לסנן תרכובות נבחרות לפעילות אנטי פטרייתית לאחר התפתחותה הראשונית.

טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקולוגיה הרפואית לחקור את היווצרות הביופילם ולבחון את פעילותם של החומרים האנטי-פטרייתיים. שוב, התאים בביופילמים.