Name: 96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: למדו שיטה ליצירת ביופילמים של Candida albicans בלוחות מיקרוטיטר 96 ובדיקת רגישות לתרופות נגד פטריות. השיטה פשוטה, זולה ומתאימה למעבדות מחקר וקליניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biofilm הקשורות לעבודה במעבדה ממומנת על ידי מענק ממוספרים R21DE017294 ו R21AI080930 מהמכון הלאומי למחקר דנטלי &amp; Craniofacial לבין המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (JLL ל-R.). התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIDCR, את NIAID או NIH.

1. הכנת ג אלביקנס ג אלביקנס היא קבוצת סיכון מיקרואורגניזם 1/BSL1. זכרו תמיד להשתמש בטכניקות aseptic / סטרילי טוב לעבוד עם בקטריה זו ופעל נהלים מוסדיים לסילוק נאות של חומרים Biohazard. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תרבות הלילה של C. אלביקנס בינוני (שמרים Peptone דקסטרוז) YPD נוזלי על ידי inoculating מושבה אחת של ג אלביקנס לתוך 25 מ"ל של YPD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תרבות שייקר מסלולית (בערך 180 סל"ד) בשעה 30 ° C במשך הלילה. רוב ג אלביקנס זנים יגדלו כמו תאים שמרים בתנאים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבויות בין לילה (כ -3,000 סל"ד, 5-10 דקות), לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי, resuspend את הכדור האחרון על 20-25 מ"ל של מדיום 1640 RPMI שנאגרו עם חומצה 165 mM morpholinepropanesulfonic עד 7.0 pH מראש חימם בשעה 37 ° C (מעתה והלאה המדיום הזה נקרא בפשטות "RPMI 1640"). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemacytometer. לאחר הספירה, להכין ההשעיה של תאים בצפיפות הסופי של 1.0 x 10 6 תאים / מ"ל RPMI 1640. הערה: מאחר תאים יש נטייה צבירה, חשוב מערבולת במרץ בין כביסות ולפני pipetting. </li></ol> 2. הקמת 96-היטב פלייט microtiter להיווצרות של biofilm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב להוסיף 100 μL של C. אלביקנס ההשעיה לתוך בארות נבחר הצלחת-96 גם microtiter (-s). אל תוסיף התאים בארות בעמודה 12, כמו אלה ישמש שולטת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת microtiter שלם עם מכסה המקורי, חותם עם parafilm, מקום בתוך החממה דגירה של 24 שעות ב 37 ° C. אורכו של הדגירה ניתן להתאים תכנון הניסוי הספציפי. לדוגמה, אפשר לבחון את קינטיקה של היווצרות biofilm על פני תקופה של 24-48 שעות על ידי זריעת הצלחות מרובות ועיבוד כל צלחת בנקודות זמן שונות (כלומר 2, 4, 8, 12, 24 ו - 48 ח) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היווצרות biofilm, בעזרת פיפטה רב לשאוב את המדיום בזהירות לא לגעת ולשבש את biofilms כי נוצרו בכל אחת הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב צלחות לשטוף שלוש פעמים PBS סטרילית (200 μL לכל היטב). לחלופין, להשתמש מכונת כביסה אוטומטיות צלחת microtiter. בין שוטף, ובעיקר לאחר לשטוף האחרון, לנקז את צלחות בעמדה הפוכה על ידי סופג עם מגבות נייר כדי להסיר כל PBS שיורית. בנקודה זו נוצר biofilms בתחתית בארות צריך להיות לעין גם בעין בלתי מזוינת, ויכול גם להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1). Biofilms מוכנים כעת להיות מעובד עבור מבחני רגישות בדיקות נגד פטריות. (אם המטרה העיקרית של הניסוי היא להעריך את מידת היווצרות biofilm, צלחות מוכנים להיות מעובד בשיטת colorimetric. לשם כך, מגיב XTT / menadione (ראה שלב 3 להלן), ניתן להוסיף את הצבע וכתוצאה מכך לקרוא באמצעות קורא צלחת microtiter). </li></ol> 3. בדיקה של רגישות נגד פטריות Biofilms <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מ פתרונות מניות או אבקה, להכין פתרון עובד בינוני 1640 RPMI של פטריות כל להיבדק. ריכוזים גבוהים אופייניים 1,024 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור fluconazole, ו -16 מיקרוגרם / מ"ל ​​הן amphotericin B ו caspofungin. ריכוזים אחרים עשויים לשמש סוכנים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טפטפת רב, להוסיף 200 μL של ריכוז גבוה של עובדים נגד פטריות על בארות המקביל בעמודה 1 של כל צלחת microtiter המכיל biofilms פטרייתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של RPMI 1640 היטב כל בעמודות 2-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של RPMI 1640 לבארות בעמודה 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 100 μL של סוכן פטריות מבארות הטור 1 ולהוסיף את בארות הסמוך בעמודה 2 (כבר המכיל 100 μL של מדיום). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את תוכנו על ידי pipetting מעלה ומטה כדי לבצע דילול הכפלת סדרתי, ולהסיר את עצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור זז ימינה עד בארות הטור 10, שלאחריו נפח סופי 100 μL מבארות הטור 10 לאחר ערבוב נמחקת. בדרך זו, סדרה של דילולים הכפלה של הסוכן שלך (-ים) של עניין נוצרו; מן מרוכז רוב הבארות של טור 1 עד לפחות מרוכזת בארות של טור 10. Biofilms הבלתי מעורער בעמודה 11 ישמש שולטת חיובית, בארות ריק בעמודה 12 ישמש שולטת שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם, חותם עם parafilm ו דגירה של 24 -48 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה לשטוף את הצלחות כמו לפני שלב 2.4 (3 x PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רב להוסיף 100 μL של פתרון XTT / menadione זה היטב המכיל biofilm מראש שטף כמו גם בארות שליטה שלילי למדידת רקע XTT-colorimetric רמות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> XTT מוכן כפתרון רווי ב 0.5 g / L ב לקטט רינגר של סטרילית, PBS או תמיסת מלח, אשר צריך להיות פילטר עיקור באמצעות 0.22 מיקרומטר, מסנן גודל הנקבוביות. הפתרון XTT אור רגיש, כך זה צריך להיות מכוסה בנייר אלומיניום במהלך ההכנה. מוכן ברגע ולסנן-מעוקרים, aliquot תוך 10 כרכים עובד מ"ל, ולאחסן ב -70 ° C. הגנה על צינורות מן האור באמצעות רדיד אלומיניום. הפשירי רק צינורות רבים ככל הדרוש לניסוי מסוים רק לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Menadione מוכן כפתרון 10 mM המניות אצטון 100%, aliquoted לתוך נפח קטן יותר (כ - 50 μL) ומאוחסנים ב -70 ° C. הכן את הפתרון XTT / menadione רק לפני השימוש, על ידי הוספת 1 μL של פתרון המניות של menadione אל צינור המכיל 10 מ"ל של התמיסה XTT מופשר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום דגירה בחושך במשך שעות 2 ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הצלחות. בעזרת פיפטה רב להסיר 80 ​​μL של supernatant בצבע הנובע גם כל העברת לתוך בארות המקביל צלחת microtiter חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את צלחת (-ים) קורא microtiter צלחת ב 490 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את ריכוזי נייחים מעכבות מינימום SMIC50 ו SMIC80, המהווים את ריכוזי פטריות בו ירידה של 50% או 80% בקריאה colorimetric מזוהים בהשוואה לשלוט biofilms שנוצר בהעדר תרופה נגד פטריות (במקרה זה הערכים עבור העמודה 11 , זכור גם לחסר ערכים שליליים שולטת מבארות בעמודה המכילה 12 XTT בלבד). תוצאות SMIC יכול להיות מוצג כטבלה (כלומר מבודד מרובים נגד antifungals מרובים) או לחילופין, התוצאות עבור כל פטרייתי הפרט לבודד נגד פטריות כל אחד יכול להיות מוצג בגרף על ידי התוויית עיכוב אחוז לעומת ריכוז פטריות. </li></ol> דוגמה: לאחר הפחתת ערכי בבקרה שלילית, OD הממוצע של biofilms לשלוט נוצר בטור 11 הוא 1.32. SMIC50 הוא הריכוז הנמוך ביותר נגד פטריות מוביל להפחתה&gt; 50% בקריאה colorimetric, במקרה הזה פחות מ 1.32 x 50 / 100 = 0.66. כמו כן, SMIC80 הוא הריכוז הנמוך ביותר נגד פטריות מוביל להפחתה&gt; 80% בקריאה colorimetric, במקרה הזה פחות מ 1.32 x 20/100 = 0.264. 4. נציג תוצאות איור 1 מציג microphotograph של C. אלביקנס biofilm נוצר בתחתית באר בצלחת 96 microtiter גם נלקח באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. איור 2 מראה XTT-colorimetric קריאות (OD 490 ערכים) עבור כל אחד 11 biofilms של C. זן אלביקנס סוג בר נוצרו בכל אחת 8 שורות שונות של צלחת 96 microtiter אותו היטב. איור 3 מראה את הפעילות של amphotericin B בריכוזים שונים נגד ג אלביקנס biofilms; החצים מצביעים SMIC50 ו SMIC80 ערכים. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. (א) לוח מראה microphotograph נלקח באמצעות מצלמה מחוברת מיקרוסקופ הפוכה של C. אלביקנס biofilm נוצר בתחתית הבאר לאחר השאיפה של המדיום RPMI ו כביסות הבאים עם PBS. (ב) מיקרוסקופ של ג אופייני אלביקנס biofilm דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. ברים הם 100 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר עבור לוחות A ו-B בהתאמה. <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. כינונה של C. המקבילה מרובים אלביקנס biofilms ב 96-היטב צלחות microtiter. קריאות Colorimetric (OD 490 ערכים) מן XTT הפחתת מבחני של biofilms שהוקמה על ידי ג אלביקנס סוג בר בארות של צלחות microtiter. ערכים הם עבור 11 biofilms עצמאי שנוצר בכל אחת 8 שורות שונות של צלחת 96 microtiter אותו היטב. תוצאות עבור השורות שונה הושוו על ידי ניתוח חד סטרי השונות באמצעות בדיקה של ברטלט על ההומוגניות של שונויות והשוואה מרובים של Bonferroni שלאחר הבדיקה. ההבדלים לא היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית ציין כאשר משווים את כל זוגות של שורות זה לזה (P&gt; 0.05). <img src="/files/ftp_upload/2287/2287fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. תוצאות אופייניות של בדיקות רגישות נגד פטריות ג אלביקנס biofilms. גרף המתאר תוצאות אופייני היעילות של ריכוזים שונים amphotericin B נגד biofilms של C. אלביקנס זן פראי סוג. ערכים הם כפי שבאה לידי ביטוי בקריאה אחוזים בממוצע colorimetric עבור XTT הפחתת מבחני לעומת שליטה בארות. SMIC50 ו SMIC80 ערכים מסומנים על ידי חצים.

<ol><li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activity+of+caspofungin+against+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).</li>
<li>Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+2%2C3-bis%282-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl%29-5-%5B%28phenylamino%29carbonyl%5D-2H-t+etrazolium+hydroxide+%28XTT%29+colorimetric+method+with+the+standardized+National+Committee+for+Clinical+Laboratory+Standards+method+of+testing+clinical+yeast+isolates+for+susceptibility+to+antifungal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents.</a> J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).</li>
<li>Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+and+limitations+of+the+XTT+assay+in+studies+of+Candida+growth+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism.</a> J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).</li>
<li>Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+susceptibility+of+Candida+biofilms%3A+Unique+efficacy+of+amphotericin+B+lipid+formulations+and+echinocandins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).</li>
<li>Nobile, C. J., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+albicans+transcription+factor+Bcr1p%3A+a+regulator+of+cell-surface+genes+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biol%22%5BJournal%5D)">C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation.</a> Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+biofilms%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Candida biofilms: an update.</a> Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Bachmann, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+combinations+against+Candida+albicans+biofilms+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pharmacodynamic+properties+of+three+antifungal+agents+against+preformed+Candida+albicans+biofilms+determined+by+time-kill+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).</li>
<li>Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+endpoint+determination+system+for+antifungal+susceptibility+testing+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).</li>
<li>Nett, J., Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+development%2C+modeling+a+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction.</a> Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).</li>
</ol>

JLL-R מחזיקה בהון MicrobeHTS Technologies, Inc, המפתחת חומרים נגד פטריות. MicrobeHTS Technologies, Inc לא סיפקו תמיכה כספית עבור מחקרים אלו.

כאן אנו מתארים פשוט, מהיר, חסכוני מאוד לשחזור 96 microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilms קנדידה בשילוב עם שיטת colorimetric אשר מודד את הפעילות המטבולית של תאים בתוך biofilm באמצעות XTT. 96 זה microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilm פותחה במקור עבור ג אלביקנס אך יכול לשמש אחרים קנדידה spp. ומותאמת בקלות עבור אורגניזמים פטרייתיים אחרים. השיטה יכולה לשמש כדי לבחון פרמטרים רבים הגורמים המשפיעים על היווצרות biofilm ו לאמוד את היכולת של biofilm יוצרי מבודד פטריי...

<table><tbody><tr><td>אגר Sabouraud-dextrose</td><td>BD Biosciences</td><td>211584</td><td>להכנת צלחות עבור תרביות משנה טריות של בידודים פטרייתיים</td></tr><tr><td>YPD: Yeast peptone dextrose</td><td>US Biological</td><td>Y2076</td><td>מצע לגידול של תרביות נוזליות למשך לילה</td></tr><tr><td>RPMI-1640 ללא סודיום ביקרבונט, מועשר ב-L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>50-020-PB</td><td>מצע נוזלי ליצירת ביופילם</td></tr><tr><td>חומצה מורפוליןפרופאנסולפונית (MOPS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td>לביצוע באפרינג של RPMI 1640</td></tr><tr><td>סליין מתוחבפוספט, PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>בופר לשטיפות</td></tr><tr><td>מלח נתרן של XTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4251</td><td>ראה למעלה להוראות הכנה</td></tr><tr><td>Ringer&amp;rsquo;s lactate</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC0409-7953-09</td><td>להכנת תמיסת XTT</td></tr><tr><td>Menadione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5625</td><td>זהירות: מסוכן במגע עם העור, בשאיפה או בבליעה</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה קוניות של 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות צנטריפוגה קוניות של 50 ml</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>פלטות מיקרוטיטר של 96 בארות: פוליסטירן, תחתית שטוחה, מטופלות לתרבית רקמות</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה רב-ערוצית וטיפים</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קורא פלטות מיקרוטיטר</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס biofilms

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

קנדידה אלביקנס נשאר הגורם השכיח ביותר של זיהומים פטרייתיים האוכלוסייה המתרחבת של חולים נפרץ קנדידה עכשיו את הזיהום השלישי בשכיחותו בבתי חולים בארה&quot;ב. ביטויים שונים של קנדידה המשויכים היווצרות biofilm, הן רקמות המארח ו / או מכשירים רפואיים (כלומר צנתרים). היווצרות biofilm נושאת השלכות קליניות שליליות, כמו תאים בתוך biofilms מוגנים מפני תגובות מארח החיסונית מפעולה של antifungals. פיתחנו מודל במבחנה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת ג biofilms אלביקנס באמצעות 96 היטב microtiter צלחות, אשר יכול לשמש גם עבור בדיקות רגישות biofilm נגד פטריות. Readout של assay זה colorimetric, המבוססת על הפחתת XTT (מלח tetrazolium) על ידי תאים פעילים מבחינה מטבולית biofilm פטרייתי. ניסוי טיפוסי לוקח כ 24 שעות ליצירת biofilm, עם 24 שעות נוספות לצורך בדיקות רגישות נגד פטריות. בגלל הפשטות שלה, את השימוש בחומרים במעבדה זמין בדרך כלל ציוד, טכניקה זו democratizes מחקר biofilm מייצג צעד חשוב לקראת סטנדרטיזציה של בדיקות רגישות של פטריות biofilms פטרייתי.

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; Biofilms באמצעות 96 צלחות microtiter היטב השירות שלה בבדיקת רגישות פטריות של תאים בתוך biofilms.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

*Candida albicans* נותר הגורם השכיח ביותר לזיהומים פטרייתיים באוכלוסייה הולכת וגדלה של חולים עם מערכת חיסונית מוחלשת, וכנדיידוזיס (candidiasis) היא כעת הסיבה השלישית...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקים ביופילמים של candida albicans ולבחון את רגישותם לסוכנים אנטי-פטרייתיים. הדבר משיג תחילה על ידי היווצרות ביופילמים פטרייתיים אלה בבארות של לוחיות מיקרוטיטר בעלות 96 בארות, ולאחר מכן מוסיפים סוכנים אנטי-פטרייתיים לביופילמים שהוקמו ומדגירים אותם למשך 24 עד 48 שעות לאחר דגירה זו.שיטה קולורימטרית המודדת פעילות מטבולית של תאים בתוך הביופילמים משמשת למדידת הפעילות של חומרים אנטי-פטרייתיים אלו, במטרה לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של החומרים האנטי-פטרייתיים נגד ביופילמים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את היכולת ליצור ביופילמים ואת רגישותם לחומרים אנטי-פטרייתיים באמצעות שיטה פשוטה וקלה המבוססת על פלטת מיקרוטיטר של 96 בארות המשולבת עם קריאה קולורימטרית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, זולה יחסית, בעלת הדירות גבוהה, ומאפשרת יצירה של מספר ביופילמים שווי ערך.בנוסף, השיטה תואמת לטכנולוגיית פלטפורמת 96 הבארים הנפוצה ברוב המעבדות המחקריות והקליניות. ההשלכות של טכניקה זו משתמעות לטיפול בכלביים, שכן לעיתים קרובות זיהומים אלו קשורים להיווצרות של biofilm.בשימוש בטכניקות טיפול מיקרוביולוגיות נאותות, השג תבחין מלא בתאים מתרבוי משנה טרי של albicans על מצע SAU dextrose copperplate Alan והזרק אותו לבקבוק ארלנמאייר בנפח 125 milliliter המכיל 25 milliliters של מצע yeast pepane dextrose broth. הנח את התרבית במערער מסתובב (orbital shaker) המכוון ל-180 RRP M ו-30 degrees Celsius, והדגר למשך לילה. לאחר הדגרה של לילה, שפוך את תרביות השמרים למבחנות קוניות בנפח 50 milliliter וסובב במערבל צנטריפוגי במהירות 3000 RBM למשך חמש עד 10 דקות. השלך את הנוזל העליון (supernatant) ובצע ערבוב במערבל וורטקס.ערבבו את המשקע בעוצמה כדי להפריד את התאים. לאחר מכן, הוסיפו PBS סטרילי לשטיפה לפני סבב נוסף של סבב צנטריפוגה לתרביות. חזרו על שלב שטיפה זה פעם נוספת ולאחר מכן השעיות את התאים.בכ-20 מיליליטר של RPMI 1640, מצע שמוסנן ל-pH 7.0. באמצעות תמיסה של 165 מילימולארית mops שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס, הכין מתליה זו דילול של 1 ל-100 באמצעות hemo cytometer סטנדרטי ומיקרוסקופ שדה בהיר. ספור את התאים.לאחר מכן, הכין תרחיף סופי של תאים בריכוז של 1×10⁶ פר מילילטר בתוספת RPMI 1640 חמים ומסנן. באמצעות פפיט רב-ערוצי, העבר 100 µL מתרחיף ה-sea albican לבארים נבחרות בלוח מיקרוטיטר סטרילי בעל 96 בארים עם תחתית שטוחה. השאר את הבארים בעמודה 12 ריקות, כיוון שהן ישמשו כביקורות שליליות.לאחר כיסוי ואיטום הפלטה באמצעות פאראפילם, דגרו אותה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות כדי לאפשר את היווצרות הביופילמים. עם סיום הדגירה, שאבו בעדינות והשליכו את המצע מכל באר, תוך הקפדה שלא להפריע לביופילמים שהיווצרו בתחתית.כדי לשטוף, הוסיפו 200 µL של PBS לכל באר ורוקנו אותם על ידי היפוך זהיר של הפלטה וספיגה של הנוזלים בערימה של נייר סופג. חזרו על שלב שטיפה זה שלוש פעמים. בשלב זה, ניתן לזהות את הביופילמים בעין ולהדמיות שלהם ניתן להגיע באמצעות מיקרוסקופ הפוך או SEM.ניתן להבחין כי הביופילמים מורכבים מתערובת שזורה של filaments ותאי שמרים. לאחר שאישרו את היווצרות הביופילם, ניתן להתחיל בבדיקה של סוכנים אנטי-פטרייתיים באמצעות מצע RPMI 1640 מובחן; הכינו תמיסות עבודה בריכוז גבוה של הסוכנים האנטי-פטרייתיים לבדיקה. ריכוזים גבוהים טיפוסיים הם 1024 µg/mL עבור fluconazole ו-16 µg/mL עבור amphotericin B ו-CASPO fungi beri.בשלב הבא, הוסיפו 200 µL של תמיסות נוגדי פטריות לבארים בעמודה הראשונה, ו-100 µL של מצע RPMI 1640 עם בופר לבארים בעמודות שתיים עד 11. בצעו סדרת מהלולי דילול כפולים על ידי העברה של 100 µL מתמיסות נוגדי הפטריות בריכוז הגבוה מהבארים בעמודה הראשונה לבארים בעמודה השנייה.לאחר שאיבה עדינה למעלה ולמטה לצורך ערבוב, העבירו בפיפטה 100 µL מבארות עמודה שתיים לבארות עמודה שלוש, וכן הלאה עד עמודה 10. אין להוסיף תמיסת נוגדי פטריות לעמודה 11, שכן היא תשמש כביקורת חיובית, ויש להשליך את 100 µL האחרונים מבארות עמודה 10. כל הבארות, למעט אלו בעמודה 12.הנפח הסופי כעת צריך להיות 100 µL. כסו את הפלטה, אטמו אותה עם Parafilm והדגירו אותה בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר לתרופות האנטי-פטרייתיות להשפיע לאחר ההדגרה. לאחר שטיפת הפלטה שלוש פעמים ב-PBS כפי שתואר בעבר, הוסיפו 100 µL של תמיסת XTT medium לכל באער, כולל באערי ביקורת השלילה.בעמודה 12. כסו את הפלטה, עטפו אותה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מהאור והדגירו אותה ב-37 degrees Celsius למשך שעתיים. כדי לאפשר התפתחות של הצבע לאחר ההדגרה, הסירו את העטיפה מהפלטה.תמיסת ה-XTT, שהייתה שקופה בתחילה, תהפוך לכתומה לאחר עיבוד על ידי תאים פעילים מטבוליים. העבירו 80 µL של העל-נוזלים הצבועים ללוח מיקרוטיטר חד בעל תחתית שטוחה. השתמשו בקורא לוחות מיקרוטיטר קולורימטרי המכוון לאורך גל של 490 nm כדי לקרוא את הלוח כפי שמוצג כאן. בהיעדר חומרי אנטי-פטרייתיים, הקריאות הקולורימטריות היו של דגימות שלא טופלו.הביופילמים של המבקשים ב-SEA בשורות שונות הם שקולים. על מנת להעריך את ההשפעה של התרכובות האנטי-פטרייתיות שנבחנו תחילה, החסר את ערך הרקע הממוצע שהתקבל מבחורי הביקורת השלילית בעמודה 12 מכל שאר הערכים. לאחר מכן, חשב את אחוז העכבה באמצעות ביקורות החיוביות בשורה 11.הערכים המקסימליים, ריכוזי נוגדי הפטריות שבהם מזוהה ירידה של 50% או 80% בקריאות הצבעיות, ידועים כריכוזי העיכוב המינימליים של Cecil. ערכים אלה משמשים בדרך כלל כמדד ייחוס לעוצמתו של תרכובת. באמצעות שיטה פשוטה זו בעלת תפוקה גבוהה, ניתן להקים ביופילמים פטרייתיים in vitro תוך 24 שעות, ולסרוק תרכובות נבחרות לבחינת פעילות נוגדת פטריות לאחר פיתוחן הראשוני.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המיקולוגיה הרפואית לחקור את היווצרות הביופילם ולבחון את הפעילות של סוכנים נוגדי פטריות. שוב, התאים בביופילמים.

a-96-well-microtiter-plate-based-method-for-monitoring-formation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

Assay מתאר אמצעי מהיר למדוד היווצרות biofilm מוקדם חיידקים ופטריות. שיטה זו משתמשת צלחת microtiter כמו לתשתית להיווצרות חיידקים biofilm ו biofilm היא דמיינו באמצעות סגול זן קריסטל. Assay מספק גם assay איכותי או כמותי ליצירת biofilm מוקדם.

Biofilm microtiter תבשיל גיבוש Assay

פיתחנו פלטפורמה בצפיפות גבוהה microarray המורכב 3D ננו biofilms...

קנדידה אלביקנס biofilm צ&#39;יפ (ע&quot;א BChip) להקרנה תפוקה גבוהה תרופות נגד פטריות

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לסינון תרכובות אנטי פטרייתיות באמצעות בדיקת מיקרודילוציה של מרק. תרכובות הבדיקה מדוללות באופן סדרתי בצלחת מיקרוטיטר ומודגרות עם חיסון פטרייתי. לאחר הדגירה, הצלחת נבדקת עבור בארות ללא צמיחה פטרייתית נראית לעין כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי פטרייתי של תרכובות הבדיקה ואת הריכוז המעכב המינימלי שלהם (MIC).

בדיקת מיקרודילוציה במבחנה של מרק להקרנה של תרכובות אנטי פטרייתיות

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר השפעת נוגדנים על ביופילמים פטרייתיים. הפטרייה הפתוגנית Candida tropicalis מפרישה גורם אלים המופרש aspartyl proteinase 2 (Sap2), מה שמקל על היווצרות ביופילם. עם החדרת סרום מומת חום המכיל נוגדנים ספציפיים ל-Sap2 המעכבים את הבשלת הביופילם, נבדקת הכדאיות של התאים הפטרייתיים באמצעות בדיקה כרומוגנית.

בדיקת מבחנה להערכת השפעת נוגדנים על ביופילם קנדידה טרופיקליס

אנו מציגים הליך ניסיוני של התפתחות ביופילם של קנדידה אלביקנס במודל תת עורי של עכבר. ביופילמים פטרייתיים כומתו על ידי קביעת מספר היחידות היוצרות מושבה ועל ידי הדמיית ביולומינסנציה לא פולשנית, כאשר כמות האור המופקת תואמת את מספר התאים הקיימאים.

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

שיטת microdilution מרק קל וישימה לסינון תרכובות פטריות ותמציות.

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול stepwise לחקור את הנשימה מיטוכונדריאלי והתפקוד glycolytic ב קנדידה אלביקנס באמצעות עם מנתח נוסף השטף.

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

כדי להציג ולכמת את התכונות הפנימיות של קנדידה אלביקנס ביוילאמים, אנו מכינים דגימות שלמות קבוע כי מובהר על ידי השבירה המדד התאמה. לאחר מכן ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אופטית כדי להשיג נתוני תמונה תלת-ממדיים למרות העובי המלא של הנתונים.

הבהרת והדמיה של קנדידה ביוביאמים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקבלת נתונים כמותיים על הפעילות האנטי-פטרייתית של פפטידים ותרכובות אחרות, כגון חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות, כנגד קנדידה אלביקנס. השימוש בו בצפיפות אופטית במקום לספור יחידות יוצרות מושבה כדי לכמת עיכוב גדילה חוסך זמן ומשאבים.

כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס

פרוטוקול מבוסס צלחת מיקרוטיטר 96-well המשתמש ב-2,3-ביס(2-מתוקסי-4-ניטרו-5-סולפופניל)-5-קרבוקסילייד-2H-tetrazolium (XTT) מתואר כאן, כדי לחקור את השפעת הנוגדנים על ביופילמים שנוצרו על ידי C. tropicalis. ניתן להשתמש בפרוטוקול in vitro זה כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות אנטי-פטרייתיות חדשות פוטנציאליות על הפעילות המטבולית של תאי מין קנדידה בביופילמים.

בדיקת הפחתה מסיסה המבוססת על טטרזוליום להערכת השפעת נוגדנים על ביופילמים של קנדידה טרופיקליס

למדו שיטה ליצירת ביופילמים של Candida albicans בלוחות מיקרוטיטר 96 ובדיקת רגישות לתרופות נגד פטריות. השיטה פשוטה, זולה ומתאימה למעבדות מחקר וקליניות.

96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

גלה סרטונים נוספים