Name: בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: למדו הדמיה בזמן אמת של נדידת תאי לויקוציטים בתגובה ללויקוטריאן B4 באמצעות תאי דנדריטיים שמקורם במח העצם. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין קולטנים לחלבונים ציטופלסמיים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI-52381, CA138623 וקנטקי לחקר סרטן הריאות פורום תמיכה מוסדית של ג&#39;יימס גרהאם בראון Cancer Center.

<ol><li>Wess, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-protein-coupled+receptors%3A+molecular+mechanisms+involved+in+receptor+activation+and+selectivity+of+G-protein+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition.</a> FASEB J. 11, 346-354 (1997).</li>
<li>Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+molecular+mechanisms+involved+in+activation+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors.</a> Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).</li>
<li>Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven-transmembrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Seven-transmembrane receptors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).</li>
<li>Lefkowitz, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein-coupled+receptors.+III.+New+roles+for+receptor+kinases+and+beta-arrestins+in+receptor+signaling+and+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization.</a> J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).</li>
<li>Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+beta-arrestins+in+the+regulation+of+seven-membrane-spanning+receptor+trafficking+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling.</a> Biochem J. 375, 503-515 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-arrest%09or%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Beta-arrest	or.</a> Nature. 383, 447-450 (1996).</li>
<li>Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+mediator+networks+in+cell+signaling%3A+update+and+impact+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines.</a> Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).</li>
<li>Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLT1+and+BLT2%3A+the+leukotriene+B%284%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Leukot+Essent+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors.</a> Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).</li>
<li>Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins+Other+Lipid+Mediat%22%5BJournal%5D)">Leukotriene B4 receptors.</a> Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).</li>
<li>Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+leukotriene+B%284%29+receptor+in+mice+reveals+its+role+in+inflammation+and+platelet-activating+factor-induced+anaphylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis.</a> J Exp Med. 192, 433-438 (2000).</li>
<li>Subbarao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+leukotriene+B4+receptors+in+the+development+of+atherosclerosis%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukotrienes+and+atherosclerosis%3A+new+roles+for+old+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators.</a> Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).</li>
<li>Heller, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+atherogenesis+in+BLT1-deficient+mice+reveals+a+role+for+LTB4+and+BLT1+in+smooth+muscle+cell+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment.</a> Circulation. 112, 578-586 (2005).</li>
<li>Miyahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+leukotriene+B4+receptor+1+in+allergen-induced+airway+hyperresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).</li>
<li>Terawaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+leukotriene+B4+receptor+1+confers+resistance+to+airway+hyperresponsiveness+and+Th2-type+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses.</a> J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).</li>
<li>Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+leukotriene+B4+receptors+BLT1+and+BLT2%3A+a+critical+role+for+BLT1+in+collagen-induced+arthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice.</a> J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).</li>
<li>Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+requirement+for+the+leukotriene+B4+receptor+BLT1+for+neutrophil+recruitment+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis.</a> J Exp Med. 203, 829-835 (2006).</li>
<li>Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-independent+beta-arrestin+translocation+and+internalization+of+leukotriene+B4+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors.</a> J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).</li>
<li>Jala, V. R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li>
<li>Del Prete, A., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors%3A+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li>
<li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li>
<li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה תא חי הוא כלי רב עוצמה כדי להדגים את הפונקציה ואת האינטראקציות של חלבונים מסוימים כפי שהם מתרחשים בזמן אמת. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מראים בבירור כי LTB 4 יכול לגרום להגירה מהירה של תאים דנדריטים. שיטות אלה לא רק להרחיב את ההיבטים של פונקציה 4 LTB לסוגי תאים שונים, הם מאפשרים בשיטות דומות כדי להיות מיושם על מגוון רחב של chemokines אחרות ובדיקת יעילותם כסוכני chemotactic על תת אוכלוסיות שונות ליקוציט. דימות פלואורסצנטי במערכת זו מאפשר ניטור אירועים אית...

<table><tbody><tr><td>שבץ תאי לוקמיה בסיפילים של חולדה (RBL-2H3) או תאי HEK293.</td><td>ATCC</td><td>CRL-2256</td><td></td></tr><tr><td>דלבקו (Delbecco)&amp;rsquo;Eagle המשונה&amp;rsquo;מצע DMEM (DMEM Medium)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>RPMI או DMEM ללא פנול אדום</td><td>Invitrogen</td><td>11835-030</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי בקר</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומייצין (10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, 0.05% (1X) עם EDTA 4Na, נוזל</td><td>Invitrogen</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות Fluoro סטריליות בעלות תחתית זכוכית של כיסוי (בעובי 0.17 מ"מ) בקוטר 35 מ"מ (WillCo-dish)</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>קובית Gene Pulser סטרילית (מרווח אלקטרודות של 0.4 ס"מ) (Bio-Rad)</td><td>Bio-Rad</td><td>16552088</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורציה Gene Pulser II </td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת Epi-Fluorescence מדגם TE-FM המחוברת למיקרוסקופ הבלתי תלוי Nikon Eclipse TE300</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Metamorph</td><td>דימות אוניברסלי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות אנכי</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-Forge M-900</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור הידראולי MO-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מניפולטור ידני גס, MN-188NE</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;חזק&gt;מבני cDNA:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA של קולטן המצומד לג'י-פרוטאין המסומן בחלבון פלואורסצנטי אדום בקצה ה-C (hBLT1-RFP)</td><td>ג'אלה ואחרים 2005</td><td></td><td></td></tr><tr><td> cDNA של חלבון ציטוזולי המסומן ב-GFP (&amp;#946;(-arrestin1-GFP במחקר הנוכחי).</td><td>ג'אלה ואחרים 2005</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בזמן אמת הדמיה של leukotriene b 4 cell migration מתווכת ו blt1 אינטראקציות עם β-arrestin

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) שייכים למשפחת seven חלבון הטרנסממברני ולתווך התמרה של אותות תאיים לתגובות תאיים. GPCRs לשלוט תפקודים ביולוגיים מגוונים כגון chemotaxis, שחרור סידן תוך תאי, ויסות הגנים באופן ליגנד תלוי דרך heterotrimeric G-חלבונים 1-2. ליגנד גורם מחייב סדרה של שינויים קונפורמציה המוביל heterotrimeric ההפעלה של ה-G-חלבונים לווסת את רמות שליחים second כגון monophosphate מחזורי אדנוזין (cAMP), אינוסיטול טריפוספט (IP3) וגליצרול diacyl (DG). בד בבד עם הפעלת הכריכה ליגנד לקולטן גם יוזם סדרה של אירועים, כדי לרכך את הקולטן איתות באמצעות קיבוע הפחתת רגישות, ו / או הפנמה. תהליך הפחתת רגישות של GPCRs מתרחשת באמצעות זירחון רצפטור על ידי G-חלבון קולטן קינאז (GRKs) ומחייבת הבאות של β-arrestins 3. β-arrestins הם חלבונים cytosolic ו translocate קרום על הפעלת GPCR, קשירה לקולטנים פוספורילציה (ברוב המקרים) לשם הקלת הפנמה קולטן 4-6. Leukotriene B 4 (LTB 4) הוא מולקולה הפרו דלקתי שומנים שמקורם מסלול חומצה arachidonic ומתווך פעולותיה באמצעות GPCRs, LTB 4 קולטן 1 (BLT1; קולטן זיקה גבוהה) ו LTB 4 קולטן 2 (BLT2; קולטן זיקה נמוכה ) 7-9. מסלול 4-BLT1 LTB הוכח להיות קריטי מספר מחלות דלקתיות, כולל דלקת מפרקים אסטמה, טרשת עורקים 10-17. המאמר הנוכחי מתאר את מתודולוגיות שפותחו כדי לפקח LTB 4-Induced הגירה ליקוציט ואת האינטראקציות של BLT1 עם β-arrestin ו, טרנסלוקציה קולטן בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ טכניקות הדמיה 18-19. מוח העצם נגזר מן התאים הדנדריטים C57BL / 6 עכברים בודדו בתרבית כפי שתואר לעיל 20-21. תאים אלו נבדקו שיטות הדמיה לחיות תא להפגין LTB 4 הגירה המושרה תא. BLT1 האדם היה מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי אדום (BLT1-RFP) בתחנה הסופית-C ו-β-arrestin1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (β-arr-GFP) ו transfected הן פלסמידים לתוך עכברוש Basophilic Leukomia (RBL-2H3) שורות תאים 18-19. קינטיקה של האינטראקציה בין החלבונים האלה ולוקליזציה נוטרו באמצעות מיקרוסקופ וידאו חי התא. מתודולוגיות במאמר הנוכחי מתארים את השימוש בטכניקות מיקרוסקופיות לחקור את התגובות תפקודית של G-חלבון קולטנים יחד בתאים חיים. המאמר הנוכחי מתאר גם את השימוש Metamorph התוכנה לכמת את עוצמות הקרינה כדי לקבוע את הקינטיקה של הקולטן אינטראקציות חלבון cytosolic.

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה כדי לקבוע את התגובה chemotactic של לויקוציטים אל ligands ספציפיים לזהות אינטראקציות בין משטח קולטני התא וחלבונים cytosolic באמצעות טכניקות הדמיה תא חי.

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

קולטנים המצומדים לחלבון G‏ (GPCRs) שייכים למשפחת החלבונים בעלי שבעת המעברים ממברנתיים ומתווכים את העברתם של אותות חוץ-תאיים אל...

לוקוטריאן B4 הוא מולקולה פרו-דלקתית המתווכת את פעולתה באמצעות הקולטנים המצומדים לחלבון G, ‏BLT1 ו-BLT2, במגוון של תאי דלקת. נראה כי נתיב ה-LTB4-BLT1 הוא קריטי במספר מחלות דלקתיות, כולל אסתמה, דלקת מפרקים ואתרוסקלרוזיס. קולטנים מצומדים לחלבון G (או GPCR) מתווכים את העברתם של אותות חוץ-תאיים המביאים לתגובות תוך-תאיות, כגון כימוטקסיס, שחרור סידן תוך-תאי ובקרת גנים.קישור של ליגנד חוץ-תאי משרה סדרה של שינויים קונפורמציונליים שמובילים להפעלה של חלבוני G הטרוטרימריים. חלבוני G מווסתים לאחר מכן את רמותיהם של שליחים שניים, כגון cyclic adenosine monophosphate, adenosine triphosphate ו-diacylglycerol, כדי לנטר נדידה תאית המתווכת על ידי leukotriene B4 בזמן אמת. תאים דנדריטיים המופקים ממח עצם (BMDCs) מדויים בעוד שליגנד מועבר באמצעות זרימה מבוקרת ממיקרו-פיפט. דימוי Time-lapse מבוצע כדי להעריך את הנדידה.באמצעות טכניקות אלו של דימוי בזמן אמת של תאים חיים, המעבדה שלנו גילתה כי הקולטן leuko trend B four BT one מבוטא באופן תפקודי בתאים דנדריטיים. זיהינו גם מנגנוני הפנמה של BT one התלויים בphosphoryltion וב-beta arrest. ד"ר Jla, מרצה במעבדה שלנו שפיתחה רבות מהטכניקות הללו, תדגים הן נדידה של תאים חיים והן הפנמה של קולטנים. כדי להכין תאים דנדריטיים המופקים ממח עצם (B MDCs) לבדיקות נדידה של תאים, זרעו 0.5 מיליון תאים במצע גידול RPMI 1640 המכיל FPS, recombinant G-M-C-S-F ו-recombinant FLT three בצלחית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר.לאחר הזריעה בצלחות, דגרו את התאים למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר 16 שעות, הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS ולאחר מכן שאבו את הנוזל. חזרו על שטיפה זו לפחות פעמיים נוספות לאחר השאיבה האחרונה, והוסיפו שני מיליליטר של PBS לצלחת.התאים מוכנים כעת לניסוי ויש לשמור אותם בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. עד אז, מערכת הדימיון המשמשת לניסויים בסרטון זה מורכבת ממערכת A-T-E-F-M epi fluorescent המחוברת למיקרוסקופ הפוך Nikon eclipse TE 300, המצויד בבמה מחוממת ובמצלמת CCD שחור-לבן דיגיטלית מסוג cool SNAP hq.אורכי הגל של העירור והפליטה נשלטים באמצעות גלגלי מסננים ובאמצעות בקר גלגלי מסננים מסוג Lambda 10-2. בקרת החומרה ורכישת התמונות מנוהלות על ידי תוכנת metamorph. שני מיקרו-מניפולטורים מחוברים לבמה של המיקרוסקופ כדי להחזיק את הפפיטות, אותן ניתן להכין לפי ההוראות בטקסט הנלווה או לרכוש.העבירו 1.5 milliliters של תמיסת מלאי בריכוז 100 nanomolar של הליגנד הפרו-דלקתי leukotriene B four או LTB four אל תוך מבחנה לסרך (fuge tube) בנפח 1.5 milliliter. מלאו מחדש את המיקרו-פיפטה על ידי הנחת קצה המיקרו-פיפטה בתוך התמיסה והמתנה לכניסת התמיסה; שיטה זו של טעינה תמנע היווצרות בועות אוויר בקצה המיקרו-פיפטה. לאחר מכן, מלאו מזרק טוברקולין של 1 cubic centimeter המחובר למחט microfill עם 1 milliliter של LTB four.לאחר מכן, השתמש בו כדי למלא לאט מיקרו-פיפטה מלמעלה, תוך חיבור צינורית ל-LTB. לאחר מכן, חבר את המיקרו-פיפטה והצינורית למחט בכיול 21 gauge ואורך של one and a half inch, המחוברת למזרק של 1 ml שמולא אף הוא בליגנד. כעת, קבע בזהירות את המיקרו-פיפטה המלאה בליגנד לאחד המיקרו-מניפולטורים על שולחן המיקרוסקופ כדי לבצע דימוי של תאים חיים של תאי דנדריטים המופקים ממחית עצם.בתגובה להחלת הליגנד LTB four, הוצא את ה-b MDCs הבלתי בוגרות מהאינקובטור והנח אותן על הבמה המחוממת של המיקרוסקופ. הבא את התאים למבט באמצעות עדשת שמן של 60x. מצא אזור שבו התאים אינם צפופים מדי, כך שניתן יהיה לנטר את הנדידה בצורה תקינה.הסר את המכסה ממיכל הפלואורו. לאחר מכן, באמצעות המניפולטור הידני הגס, הורד בזהירות את הפיפטה הטעונה בליגנד והקרב אותה למרחק קרוב מאוד מהתאים באמצעות המיקרו-מניפולטור ההידראולי העדין.הבא את הפ pipette למיקוד. הפעל לחץ קטן מהמזרק כדי להתחיל שחרור איטי של LTB four ligand מקצה הפ pipette; ה-ligand אמור להתפשט באיטיות לתוך המדיה באמצעות דיפוזיה. לאחר מכן, באמצעות תוכנת metamorph, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה כך שיתבצעו רכישת תמונת brightfield בכל 15 שניות למשך שעתיים.המשיכו במעקב מדי חמש דקות כדי לבחון את התקדמות הנדידה לעבר הליגנד. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה שימשה לקביעת נדידת תאי דנדריטיים לעבר leukotriene B4. במקרה זה, נבדקה נדידה של תאים דנדריטיים המופקים ממחול השומן של עכבר לעבר 100.סרטון דימוי בזמן אמת זה מציג נדידה של תאי B MDCs חיים לעבר ltb four. ניתן ליישם שיטות דומות כדי לקבוע את התגובה הכימותקטית של סוגי תאים רבים למגוון של חומרים מושכי-כימיים (chemo attractants). סוג זה של דימוי, בשילוב עם מולקולות תיוג של חלבון פלואורסצנטי, יכול לשמש למעקב אחר תנועות ואינטראקציות של מולקולות בזמן אמת בתאים חיים.כאן אנו מדגימים בזמן אמת את האינטראקציות של קולטן leukotriene B four receptor one המסומן בתג פלואורסצנטי עם beta arrestin. RBL two H three הוא שורת תאי לוקמיה בסיפילים של חולדה שבודדה מחולדות Wister, אותה ניתן להשיג מ-A TCC. תאים אלו אינם מבטאים רבבמני קולטנים לכימוקינים, אך הם מחזיקים במרכיבים התאיים הדרושים לתיווך מסלולי איתות תלויים כימוקינים.כדי להעריך בזמן אמת את ההפנמה (internalization) של BT1 המשרה על ידי ליגנד, תאי RBL 2H3 עוברים טרנספקציה של BT1 RFP ושל beta arrestin GFP. במהלך הדמיית time-lapse, מתווסף ליגנד לצלחת. ניתן להעריך שינויים במיקום של חלבונים אלו באמצעות ניתוח תמונות.כדי לחקור את ההפנמה של G PCR R בזמן אמת, בצע טרנספקציה של B LT one RFP ו-beta arrest ו-GFP לתאי RBL two H three בהתאם להוראות בטקסט המצורף. לאחר מכן, העבר 300 µL של תערובת התאים שעברו אלקטרופורציה ומצע גידול רגיל לתוך צלחות פלואור של 35 mm המכילות 2 mL של מצע גידול רגיל. מקם את התאים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית של 95% אוויר ו-5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר להם להיצמד לתחתית הצלחת.לאחר שעה אחת, החליפו את מצע הטרנספקציה במצע גידול רגיל והחזירו את התאים לאינקובטור למשך 18 עד 24 שעות נוספות. לאחר האינקובציה, שטפו את התאיים פעמיים או שלוש פעמים על ידי הוספת 2 ml של RPMI חם ללא phenyl red המכיל 10 mM HEPES ישירות לפלטה ושאיבת המצע. לאחר מכן, הוסיפו 1.8 ml נוספים.בשלב הבא, הניחו את צלחת התרבית על במה של מיקרוסקופ מחומם. דגמו תמונות בהגדלה של 600 x באמצעות עדשת טבילה בשמן של 60 x. לאחר מכן, עברו למסנן הפלואורסצנציה המתאים.בחרו תא בריא המבטא HBL BT one RFP על פני השטח של התא וצלמו את התמונה. בעזרת מסנן RFP, עברו למסנן GFP, וודאו ש-beta arrest ו-GFP מבוטאים בציטופלזמה וצלמו את התמונה. לאחר מכן, בחנו את התמונות הממוזגות בצבעי פסאודו כדי לוודא שלא חלה דליפת פלואורסצנציה שעלולה להתרחש כתוצאה משיבוש.אינה מתרחשת התמסדות של הרצפטורים בין RFP ל-GFP. לאחר מכן, הזנו כאן את הפרמטרים להדמיית Time-lapse. תמונות של 16 bit נרכשות כאשר הגדרת המצלמה היא one by one.תמונות פלואורסצנציה באדום ובירוק נלכדות ברצף באמצעות מסנני פלואורוכרום RFP ו-GFP באמצעות מפחית קרן R-F-P-G-F-P. הגדירו בתוכנה לכידת תמונות במרווחי זמן של 32 שניות למשך שעה אחת. הגדירו את זמני החשיפה של המצלמה כך שיתקבלו טווחים דינמיים דומים.עבור עוצמת הפלואורסצנציה של RFP ו-GFP. אסוף תמונות למשך דקה אחת, ולאחר מכן, בזמן t שווה לאפס, הוסף 200 µL של הליגנד ישירות לתוך הפלטה מבלי להפריע לה.המשיכו לאסוף תמונות פלואורסצנציה למשך 60 דקות. לאחר הוספת הליגנד, ככל שהתמונות נרכשות, הן יישמרו באופן אוטומטי כתמונות TIFF עם שמות קבצים רציפים. לאחר מכן ניתן לצפות בקבצים כתמונות בודדות או כרצף תמונות משולב באמצעות התוכנה.לבסוף, לאחר שכל תמונות התאים נרכשו, רכשו תמונות של מצע בלבד ללא תאים תוך שימוש באותן הגדרות. שמרו את הקבצים לשימוש כתמונות רקע לצורך ניתוח התמונות. השתמשו בפונקציית image subtract ב-metamorph כדי להפחית את הרקע מתמונות הנתונים הממשיות שהתקבלו לעיל.פעולה זו תתחשב בכל רקע או autofluorescence מהמצע. לאחר מכן, בתפריט הקבצים, פתחו את האפשרות של קובץ הערימה (stack) הסופי שנוצר ופתחו את ערימות התמונות הבודדות. לאחר מכן, תחת מדידות אזור (region measurements), בחרו ב-eclipse region trace region וסמנו את אזורי העניין (regions of interest); בחרו אזורים שפתיים (surface) וציטוזוליים (cytosolic) כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של RFP ו-GFP המתאימה ל-BLT 1 ולהעתקה (translocation) של beta arrestin.באמצעות אפשרות רישום הנתונים (log data), המקשרת באופן אוטומטי ל-Excel, רשמו את ערכי עצימות הפלואורסצנציה כפונקציה של הזמן. גרף זה יספק מידע על קינטיקת התעתוק של מולקולה נתונה. ניתוח התמונה יכול לחשוף את הלוקליזציה של G PCR R וחלבונים ציטוזוליים וגרעיניים.כאן נראה ביטוי של BT1-RFP על פני השטח של תא RBL-2H3. תמונה זו מראה את מיקומי beta-arrestin ו-GFP בציטוזול של אותו תא, וכאן נראה pNuke-CFP בגרעין. התמונה המשולבת המוצגת כאן מעידה על הלוקליזציה התאית המובחנת של כל פלואורוכרום; ניתן להעריך כאן גם אינטראקציה המודעת על ידי ליגנד בין GPCRs על פני השטח לבין חלבון ציטוזולי.מעבר (translocation) של קולטן BLT1 ושל beta arrestin בהשראת ליגנד. סרטון זה מציג הדמיה חיה של תא המבטא BLT1 RFP ו-beta arrestin GFP. לאחר הוספה של 1 µM LTB4, ניתן לנטר את הכמות של דפוסי המעבר באמצעות תוכנת metamorph.סריקת קו של עוצמות פלואורסצנציה בתא מייצג מוצגת בזמן T השווה לאפס. BT1 RFP נראה בממברנה ו-beta arrestin GFP נראה בציטוזול. עם הוספת הליגנד, נצפתה חפיפה בין קווי ה-RFP וה-GFP, מה שמעיד על קולוקליזציה של הרצפטור וה-beta arrestin.בנוסף, ניתן לקבוע כאן את קינטיקת תנועת החלבונים. נבחנו קינטיקת ההפנמה של הרצפטור והטרנסלוקציה של beta arrestin לאחר הוספת 1 µM LTB4.עוצמות הפלואורסצנציה נמדדו כפונקציה של זמן במיקומי הממברנה והציטוזול של התא. הוספת הליגנד LTB4 ל-BLT1-RFP ו-β-arrestin-1-GFP בתאי HEK293 שטרנספקטו, מובילה לטרנסלוקציה של β-arrestin-1-GFP מהציטוזול לממברנה, דבר הנראה כהיווצרות של טבעת צהובה בתוך דקה אחת. עם האינטראקציה עם β-arrestin-1-GFP, ה-BLT1-RFP יוצר קומפלקס של רספטור ו-β-arrestin-1-GFP ועובר טרנסלוקציה דרך הציטוזול בצורה של אנדוזומים, כפי שניתן לראות מהופעת נקודות צהובות בתוך חמש דקות. באמצעות שיטות אלו, ניתן לקבוע את מצב הפעלת הרספטור התלוי בליגנד ואת מוטיבים או תהליכים קריטיים המעורבים בהפעלת הרספטור.הדבר החשוב ביותר בניסוי הוא לעקוב אחר הבאפר בלוחית במהלך הפעלתה. זאת מאחר שהניסוי נמשך מעל שעה מרגע התחלת הפיתוח. טכניקה זו הופיעה עבור חוקרים בתחום הכמוקינים והקולטנים כדי לבחון נדידת תאים ואינטראקציות בין קולטן לליגנד בסוגים שונים של תאי יונקים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להקים ניסויי דימוי בזמן אמת הכוללים כימוקינים והקולטנים שלהם, ואת האינטראקציות שלהם עם חלבונים ציטוזוליים כגון beta arrestins.

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו מתארים פולשני שני הפוטונים (2P) הגישה מיקרוסקופיה ללמוד ליקוציט ביות ב שודד את העכבר. אנו דנים בהיבטים הטכניים של ההכנה שלנו רקמות הדמיה ללכת את הקורא דרך בניסוי אופייני הראשונית להגדיר לאוסף ביצוע ונתונים.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

זוהי שיטה לדמיין הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי בלחץ שנקטפו. הטכניקה מאפשרת ללמוד הידבקות כלי דם תחת זרם גזירה עם לחצים שונים intraluminal עד 200 מ"מ כספית ובכך לחקות-ing התנאים pathophysiological של לחץ דם גבוה.

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal

אנו מתארים פרוטוקול של מיקרוסקופיה brightfield intravital למדידת דינמי נויטרופילים-אנדותל האינטראקציות התא במהלך לגיוס נויטרופילים בתגובה מקור chemoattractant נויטרופילים in vivo. זחילה נויטרופילים intraluminal, הגירה chemotaxis transendothelial ו ברקמת השריר cremaster העכבר הם דמיינו עם הצילום בזמן שחלף וידאו מעקב עם ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

כדוריות דם לבנות לחצות את monolayer אנדותל באמצעות paracellular או מסלול transcellular. פיתחנו assay פשוט כדי לעקוב אחר חלוקת junctional אנדוגני VE-cadherin וPECAM-1 במהלך נדידת transendothelial יקוציט תחת זרימה פיזיולוגית להפלות בין שני מסלולי הגלגול.

הדמיה בזמן אמת של תאי תאי צומת האנדותל במהלך נויטרופילים גלגול תחת פיזיולוגית זרימה

יישום פשוט זה של מיקרוסקופיה תוך-חיונית של ורידי מזנטריה בעכברים יכול לשמש במודלים שונים של דלקת כדי לצפות באינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וטסיות-לויקוציטים.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

אנו מפרטים פרוטוקול לניטור התנהגותם של נויטרופילים ומונוציטים בוורידים מזנטריים במצב יציב ובתנאים דלקתיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך-חיונית בעכברים מורדמים.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

לויקוציטים בלהיטות אינטראקציה עם טסיות הדם והתאים כלי הדם לאחר פציעה קיר הספינה או בעת דלקת. כאן, אנו מתארים assay מבוסס זרימה שכבתית פשוטה כדי לאפיין את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס האינטראקציות בין לויקוציטים ושותפים הסלולר שלהם.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

בפרוטוקול זה, בדיקת מיקרופלואידים ביומימטיים, שיכולה לשכפל סביבה מיקרו-וסקולרית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ולשכפל את כל מפל ההידבקות/הגירה של לויקוציטים, מועסקת כדי לחקור אינטראקציות של תאי לויקוציטים-אנדותל במחלות דלקתיות.

מערכת מיקרופיזיולוגית לחקר אינטראקציה תאי לויקוציטים-אנדותל במהלך דלקת

הדמיה ב-vivo של המפרקים היא טכניקה חשובה לחשיפת התנהגות הנדידה של לויקוציטים ודינמיקה מולקולרית בתוך המפרקים הדלקתיים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להדמיה בתוך המפרקים באמצעות מודל עכברי לדלקת מפרקים מסוג II המושרה על ידי קולגן (CIA).

In Vivo הדמיה חושפת את ההתנהגות הנדידה של לויקוציטים בתוך המפרקים

למדו הדמיה בזמן אמת של נדידת תאי לויקוציטים בתגובה ללויקוטריאן B4 באמצעות תאי דנדריטיים שמקורם במח העצם. שיטה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות בין קולטנים לחלבונים ציטופלסמיים בזמן אמת.

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B₄ Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

גלה סרטונים נוספים