בזמן אמת הדמיה של leukotriene B ₄ Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

לוקוטריאן B4 הוא מולקולה פרו-דלקתית המתווכת את פעולתה באמצעות הקולטנים המצומדים לחלבון G, ‏BLT1 ו-BLT2, במגוון של תאי דלקת. נראה כי נתיב ה-LTB4-BLT1 הוא קריטי במספר מחלות דלקתיות, כולל אסתמה, דלקת מפרקים ואתרוסקלרוזיס. קולטנים מצומדים לחלבון G (או GPCR) מתווכים את העברתם של אותות חוץ-תאיים המביאים לתגובות תוך-תאיות, כגון כימוטקסיס, שחרור סידן תוך-תאי ובקרת גנים.

קישור של ליגנד חוץ-תאי משרה סדרה של שינויים קונפורמציונליים שמובילים להפעלה של חלבוני G הטרוטרימריים. חלבוני G מווסתים לאחר מכן את רמותיהם של שליחים שניים, כגון cyclic adenosine monophosphate, adenosine triphosphate ו-diacylglycerol, כדי לנטר נדידה תאית המתווכת על ידי leukotriene B4 בזמן אמת. תאים דנדריטיים המופקים ממח עצם (BMDCs) מדויים בעוד שליגנד מועבר באמצעות זרימה מבוקרת ממיקרו-פיפט. דימוי Time-lapse מבוצע כדי להעריך את הנדידה.

באמצעות טכניקות אלו של דימוי בזמן אמת של תאים חיים, המעבדה שלנו גילתה כי הקולטן leuko trend B four BT one מבוטא באופן תפקודי בתאים דנדריטיים. זיהינו גם מנגנוני הפנמה של BT one התלויים בphosphoryltion וב-beta arrest. ד"ר Jla, מרצה במעבדה שלנו שפיתחה רבות מהטכניקות הללו, תדגים הן נדידה של תאים חיים והן הפנמה של קולטנים. כדי להכין תאים דנדריטיים המופקים ממח עצם (B MDCs) לבדיקות נדידה של תאים, זרעו 0.5 מיליון תאים במצע גידול RPMI 1640 המכיל FPS, recombinant G-M-C-S-F ו-recombinant FLT three בצלחית עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר.

לאחר הזריעה בצלחות, דגרו את התאים למשך 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. לאחר 16 שעות, הוסיפו שלושה מיליליטר של PBS ולאחר מכן שאבו את הנוזל. חזרו על שטיפה זו לפחות פעמיים נוספות לאחר השאיבה האחרונה, והוסיפו שני מיליליטר של PBS לצלחת.

התאים מוכנים כעת לניסוי ויש לשמור אותם בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. עד אז, מערכת הדימיון המשמשת לניסויים בסרטון זה מורכבת ממערכת A-T-E-F-M epi fluorescent המחוברת למיקרוסקופ הפוך Nikon eclipse TE 300, המצויד בבמה מחוממת ובמצלמת CCD שחור-לבן דיגיטלית מסוג cool SNAP hq.

אורכי הגל של העירור והפליטה נשלטים באמצעות גלגלי מסננים ובאמצעות בקר גלגלי מסננים מסוג Lambda 10-2. בקרת החומרה ורכישת התמונות מנוהלות על ידי תוכנת metamorph. שני מיקרו-מניפולטורים מחוברים לבמה של המיקרוסקופ כדי להחזיק את הפפיטות, אותן ניתן להכין לפי ההוראות בטקסט הנלווה או לרכוש.

העבירו 1.5 milliliters של תמיסת מלאי בריכוז 100 nanomolar של הליגנד הפרו-דלקתי leukotriene B four או LTB four אל תוך מבחנה לסרך (fuge tube) בנפח 1.5 milliliter. מלאו מחדש את המיקרו-פיפטה על ידי הנחת קצה המיקרו-פיפטה בתוך התמיסה והמתנה לכניסת התמיסה; שיטה זו של טעינה תמנע היווצרות בועות אוויר בקצה המיקרו-פיפטה. לאחר מכן, מלאו מזרק טוברקולין של 1 cubic centimeter המחובר למחט microfill עם 1 milliliter של LTB four.

לאחר מכן, השתמש בו כדי למלא לאט מיקרו-פיפטה מלמעלה, תוך חיבור צינורית ל-LTB. לאחר מכן, חבר את המיקרו-פיפטה והצינורית למחט בכיול 21 gauge ואורך של one and a half inch, המחוברת למזרק של 1 ml שמולא אף הוא בליגנד. כעת, קבע בזהירות את המיקרו-פיפטה המלאה בליגנד לאחד המיקרו-מניפולטורים על שולחן המיקרוסקופ כדי לבצע דימוי של תאים חיים של תאי דנדריטים המופקים ממחית עצם.

בתגובה להחלת הליגנד LTB four, הוצא את ה-b MDCs הבלתי בוגרות מהאינקובטור והנח אותן על הבמה המחוממת של המיקרוסקופ. הבא את התאים למבט באמצעות עדשת שמן של 60x. מצא אזור שבו התאים אינם צפופים מדי, כך שניתן יהיה לנטר את הנדידה בצורה תקינה.

הסר את המכסה ממיכל הפלואורו. לאחר מכן, באמצעות המניפולטור הידני הגס, הורד בזהירות את הפיפטה הטעונה בליגנד והקרב אותה למרחק קרוב מאוד מהתאים באמצעות המיקרו-מניפולטור ההידראולי העדין.

הבא את הפ pipette למיקוד. הפעל לחץ קטן מהמזרק כדי להתחיל שחרור איטי של LTB four ligand מקצה הפ pipette; ה-ligand אמור להתפשט באיטיות לתוך המדיה באמצעות דיפוזיה. לאחר מכן, באמצעות תוכנת metamorph, הגדר את פרמטרי רכישת התמונה כך שיתבצעו רכישת תמונת brightfield בכל 15 שניות למשך שעתיים.

המשיכו במעקב מדי חמש דקות כדי לבחון את התקדמות הנדידה לעבר הליגנד. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה שימשה לקביעת נדידת תאי דנדריטיים לעבר leukotriene B4. במקרה זה, נבדקה נדידה של תאים דנדריטיים המופקים ממחול השומן של עכבר לעבר 100.

סרטון דימוי בזמן אמת זה מציג נדידה של תאי B MDCs חיים לעבר ltb four. ניתן ליישם שיטות דומות כדי לקבוע את התגובה הכימותקטית של סוגי תאים רבים למגוון של חומרים מושכי-כימיים (chemo attractants). סוג זה של דימוי, בשילוב עם מולקולות תיוג של חלבון פלואורסצנטי, יכול לשמש למעקב אחר תנועות ואינטראקציות של מולקולות בזמן אמת בתאים חיים.

כאן אנו מדגימים בזמן אמת את האינטראקציות של קולטן leukotriene B four receptor one המסומן בתג פלואורסצנטי עם beta arrestin. RBL two H three הוא שורת תאי לוקמיה בסיפילים של חולדה שבודדה מחולדות Wister, אותה ניתן להשיג מ-A TCC. תאים אלו אינם מבטאים רבבמני קולטנים לכימוקינים, אך הם מחזיקים במרכיבים התאיים הדרושים לתיווך מסלולי איתות תלויים כימוקינים.

כדי להעריך בזמן אמת את ההפנמה (internalization) של BT1 המשרה על ידי ליגנד, תאי RBL 2H3 עוברים טרנספקציה של BT1 RFP ושל beta arrestin GFP. במהלך הדמיית time-lapse, מתווסף ליגנד לצלחת. ניתן להעריך שינויים במיקום של חלבונים אלו באמצעות ניתוח תמונות.

כדי לחקור את ההפנמה של G PCR R בזמן אמת, בצע טרנספקציה של B LT one RFP ו-beta arrest ו-GFP לתאי RBL two H three בהתאם להוראות בטקסט המצורף. לאחר מכן, העבר 300 µL של תערובת התאים שעברו אלקטרופורציה ומצע גידול רגיל לתוך צלחות פלואור של 35 mm המכילות 2 mL של מצע גידול רגיל. מקם את התאים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית של 95% אוויר ו-5% פחמן דו-חמצני כדי לאפשר להם להיצמד לתחתית הצלחת.

לאחר שעה אחת, החליפו את מצע הטרנספקציה במצע גידול רגיל והחזירו את התאים לאינקובטור למשך 18 עד 24 שעות נוספות. לאחר האינקובציה, שטפו את התאיים פעמיים או שלוש פעמים על ידי הוספת 2 ml של RPMI חם ללא phenyl red המכיל 10 mM HEPES ישירות לפלטה ושאיבת המצע. לאחר מכן, הוסיפו 1.8 ml נוספים.

בשלב הבא, הניחו את צלחת התרבית על במה של מיקרוסקופ מחומם. דגמו תמונות בהגדלה של 600 x באמצעות עדשת טבילה בשמן של 60 x. לאחר מכן, עברו למסנן הפלואורסצנציה המתאים.

בחרו תא בריא המבטא HBL BT one RFP על פני השטח של התא וצלמו את התמונה. בעזרת מסנן RFP, עברו למסנן GFP, וודאו ש-beta arrest ו-GFP מבוטאים בציטופלזמה וצלמו את התמונה. לאחר מכן, בחנו את התמונות הממוזגות בצבעי פסאודו כדי לוודא שלא חלה דליפת פלואורסצנציה שעלולה להתרחש כתוצאה משיבוש.

אינה מתרחשת התמסדות של הרצפטורים בין RFP ל-GFP. לאחר מכן, הזנו כאן את הפרמטרים להדמיית Time-lapse. תמונות של 16 bit נרכשות כאשר הגדרת המצלמה היא one by one.

תמונות פלואורסצנציה באדום ובירוק נלכדות ברצף באמצעות מסנני פלואורוכרום RFP ו-GFP באמצעות מפחית קרן R-F-P-G-F-P. הגדירו בתוכנה לכידת תמונות במרווחי זמן של 32 שניות למשך שעה אחת. הגדירו את זמני החשיפה של המצלמה כך שיתקבלו טווחים דינמיים דומים.

עבור עוצמת הפלואורסצנציה של RFP ו-GFP. אסוף תמונות למשך דקה אחת, ולאחר מכן, בזמן t שווה לאפס, הוסף 200 µL של הליגנד ישירות לתוך הפלטה מבלי להפריע לה.

המשיכו לאסוף תמונות פלואורסצנציה למשך 60 דקות. לאחר הוספת הליגנד, ככל שהתמונות נרכשות, הן יישמרו באופן אוטומטי כתמונות TIFF עם שמות קבצים רציפים. לאחר מכן ניתן לצפות בקבצים כתמונות בודדות או כרצף תמונות משולב באמצעות התוכנה.

לבסוף, לאחר שכל תמונות התאים נרכשו, רכשו תמונות של מצע בלבד ללא תאים תוך שימוש באותן הגדרות. שמרו את הקבצים לשימוש כתמונות רקע לצורך ניתוח התמונות. השתמשו בפונקציית image subtract ב-metamorph כדי להפחית את הרקע מתמונות הנתונים הממשיות שהתקבלו לעיל.

פעולה זו תתחשב בכל רקע או autofluorescence מהמצע. לאחר מכן, בתפריט הקבצים, פתחו את האפשרות של קובץ הערימה (stack) הסופי שנוצר ופתחו את ערימות התמונות הבודדות. לאחר מכן, תחת מדידות אזור (region measurements), בחרו ב-eclipse region trace region וסמנו את אזורי העניין (regions of interest); בחרו אזורים שפתיים (surface) וציטוזוליים (cytosolic) כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של RFP ו-GFP המתאימה ל-BLT 1 ולהעתקה (translocation) של beta arrestin.

באמצעות אפשרות רישום הנתונים (log data), המקשרת באופן אוטומטי ל-Excel, רשמו את ערכי עצימות הפלואורסצנציה כפונקציה של הזמן. גרף זה יספק מידע על קינטיקת התעתוק של מולקולה נתונה. ניתוח התמונה יכול לחשוף את הלוקליזציה של G PCR R וחלבונים ציטוזוליים וגרעיניים.

כאן נראה ביטוי של BT1-RFP על פני השטח של תא RBL-2H3. תמונה זו מראה את מיקומי beta-arrestin ו-GFP בציטוזול של אותו תא, וכאן נראה pNuke-CFP בגרעין. התמונה המשולבת המוצגת כאן מעידה על הלוקליזציה התאית המובחנת של כל פלואורוכרום; ניתן להעריך כאן גם אינטראקציה המודעת על ידי ליגנד בין GPCRs על פני השטח לבין חלבון ציטוזולי.

מעבר (translocation) של קולטן BLT1 ושל beta arrestin בהשראת ליגנד. סרטון זה מציג הדמיה חיה של תא המבטא BLT1 RFP ו-beta arrestin GFP. לאחר הוספה של 1 µM LTB4, ניתן לנטר את הכמות של דפוסי המעבר באמצעות תוכנת metamorph.

סריקת קו של עוצמות פלואורסצנציה בתא מייצג מוצגת בזמן T השווה לאפס. BT1 RFP נראה בממברנה ו-beta arrestin GFP נראה בציטוזול. עם הוספת הליגנד, נצפתה חפיפה בין קווי ה-RFP וה-GFP, מה שמעיד על קולוקליזציה של הרצפטור וה-beta arrestin.

בנוסף, ניתן לקבוע כאן את קינטיקת תנועת החלבונים. נבחנו קינטיקת ההפנמה של הרצפטור והטרנסלוקציה של beta arrestin לאחר הוספת 1 µM LTB4.

עוצמות הפלואורסצנציה נמדדו כפונקציה של זמן במיקומי הממברנה והציטוזול של התא. הוספת הליגנד LTB4 ל-BLT1-RFP ו-β-arrestin-1-GFP בתאי HEK293 שטרנספקטו, מובילה לטרנסלוקציה של β-arrestin-1-GFP מהציטוזול לממברנה, דבר הנראה כהיווצרות של טבעת צהובה בתוך דקה אחת. עם האינטראקציה עם β-arrestin-1-GFP, ה-BLT1-RFP יוצר קומפלקס של רספטור ו-β-arrestin-1-GFP ועובר טרנסלוקציה דרך הציטוזול בצורה של אנדוזומים, כפי שניתן לראות מהופעת נקודות צהובות בתוך חמש דקות. באמצעות שיטות אלו, ניתן לקבוע את מצב הפעלת הרספטור התלוי בליגנד ואת מוטיבים או תהליכים קריטיים המעורבים בהפעלת הרספטור.

הדבר החשוב ביותר בניסוי הוא לעקוב אחר הבאפר בלוחית במהלך הפעלתה. זאת מאחר שהניסוי נמשך מעל שעה מרגע התחלת הפיתוח. טכניקה זו הופיעה עבור חוקרים בתחום הכמוקינים והקולטנים כדי לבחון נדידת תאים ואינטראקציות בין קולטן לליגנד בסוגים שונים של תאי יונקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להקים ניסויי דימוי בזמן אמת הכוללים כימוקינים והקולטנים שלהם, ואת האינטראקציות שלהם עם חלבונים ציטוזוליים כגון beta arrestins.