ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

סרטון זה מדגים פרוצדורה לניתוח המורפולוגיה של דנדריטים ואקסונים, הידועים יחד כנוריטים (neurites), באמצעות תוכנה חצי-אוטומטית במטרה לבחון שינויים מקומיים. ראשית, נעשה שימוש בתוכנת neuron J כדי לסמן תמונות TIFF של נוירונים ברזולוציה של שמונה ביט, במטרה לזהות את מיקומם של מקטעי הנוריטים. לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנת Neuron studio כדי להגדיר מידע מבני על הקישוריות בין הנוריטים.

לבסוף, מופעלת תוכנית ה-MATLAB מסוג bonfire כדי להפיק נתונים מורפולוגיים מהתאים, כולל ניתוח shoal, וכן את מספר נקודות הפיצול של הניוריטים וקצות הניוריטים. התוצאות מראות שינויים מקומיים במורפולוגיה של הניוריטים על בסיס ביצוע ניתוח shoal באזורי משנה של העץ הניוריטי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח shoal ידני, הוא שהתוכנית היא חצי-אוטומטית, מה שמעלה מאוד את יעילות הניתוח ומאפשר לבצע ביקורת על הנתונים כדי שניתן יהיה לאמת את דיוק הניתוח.

את הפרוצדורה תדגים Hirsch AWA, סטודנטית לתואר ראשון העובדת במעבדת Firestein במהלך הקיץ. כדי להשתמש בתוכנת Bonfire לניתוח המאפיינים המורפולוגיים של תמונות neurites בפורמט eight bit tiff, יש להשיג תמונות של נוירונים בודדים לאחר הורדת תוכנת Bonfire. יש להתאים את הגדרות התוכנה בהתאם לרזולוציית התמונות שברצונכם לנתח; בחלק של פרמטרי Bonfire בתוכנה, החליפו את הערך הנוכחי של המשתנה pixels conversion בערך רזולוציית התמונות שלכם.

על מנת ש-bonfire יוכל לנתח את הנתונים, על הקבצים להיות מאורגנים במבנה ספציפי, הכולל תיקייה ראשית, תיקיית bonfire המכילה את קבצי ה-MATLAB M של bonfire, תיקיות משניות המכילות כל אחד מהתנאים השונים, וקבצי תמונות התאים בתוך תיקיות התנאים השונות. התחילו בהכנת התמונה לעקיבה. בניסוי זה, רק הדנדריטים יעקובו על מנת לנתח שינויים במורפולוגיה דנדריטית. התחילו בהכנת התמונה לעקיבה.

פתחו את התמונה על ידי לחיצה על כפתור הפתיחה (open) בסרגל הכלים של neuron J ובחרו את התמונה שברצונכם לעקב. כעת, שנו את גודל התמונה על ידי לחיצה על כפתור ההרחבה (maximize) כדי להתאים את בהירות התמונה והניגודיות שלה, כך שתוכלו לראות את כל הניוריטים; בחרו ב-image בסרגל הכלים של neuron J, ולאחר מכן בחרו ב-adjust brightness contrast. כדי להתחיל בעקיבה, לחצו על כפתור ה-add traces בסרגל הכלים של neuron J. עקבו אחר היקף גוף התא.

לאחר מכן, בחרו בכפתור label tracings בסרגל הכלים של neuron J ובחרו ב-N one מהתפריט הנפתח של tracing ID, בחרו ב-type zero six בחלון התכונות (attributes) של neuron J ולחצו על Okay. כדי להתחיל בשרטוט של הניוריטים, בחרו בכפתור add traces בסרגל הכלים של neuron J והוסיפו שרטוט (trace) לאורך כל ענף ניוריטי רלוונטי. מומלץ שהמקטעים שתשרטטו יסתיימו בכל נקודת פיצול, כאשר כל ענף בת מתחיל מאותה נקודה כשרטוט חדש.

לחצו על כפתור save tracings בסרגל הכלים של neuron J ושמרו את השרטוט שיצרתם זה עתה באותה תיקייה שבה נמצא קובץ התמונה המקורי. לאחר מכן, ייצאו את קבצי השרטוט (trace files) ואת קבצי המזהה של השרטוטים (trace identifier files) מ-neuron J. לחצו על כפתור export trace בסרגל הכלים של neuron J. כעת, בחרו באפשרות tab delimited text files separate file for each tracings בתיבת הדיאלוג של הייצוא ב-neuron J ולחצו על okay; אפשרו ל-neuron J לבחור את שמות הקבצים ואת מיקום השמירה.

לחצו על כפתור measure tracings בסרגל הכלים של neuron J, ולאחר מכן בחרו באפשרות display tracings measurements בחלון המדידות של neuron J ולחצו על run. בחרו ב-Select file בחלון ה-tracings של neuron J, ולאחר מכן בחרו ב-save as ושמרו את הקובץ. שם הקובץ חייב להיות זהה בדיוק לשם קובץ התמונה המקורי, ולאחריו קו תחתון ומילה info, ואין לכלול סיומת קובץ בת שלוש אותיות. ודאו שהמחשב שלכם אינו מוסיף באופן אוטומטי סיומת קובץ XLS.

אם כן, יש למחוק את סיומת הקובץ באופן ידני. ראשית, ארגנו מחדש את התיקיות באמצעות bonfire load על ידי פתיחת matlab ולחיצה על כפתור שלוש הנקודות בפינה הימנית העליונה של חלון הפקודות. בחרו את תיקיית bonfire בתיקיית המאסטר שלכם בחלון החיפוש, הקלידו bonfire load בחלון הפקודות והקישו enter.

בחלון "חפש תיקייה", בחר את תיקיית התנאי שברצונך לנתח ולחץ על "אישור". פעולה זו תארגן מחדש את מבנה התיקיות על ידי יצירת תיקיות משנה לתאים, המכילות את כל הנתונים עבור כל תא בנפרד. כעת, כדי ליצור קבצי filename_premium.swc, הקלד bonfire_NDF2sWC בחלון הפקודות ולחץ על Enter.

בחלון בחירת התיקייה, בחרו את תיקיית התנאי שסודרה זה עתה באמצעות bonfire load, ולאחר מכן לחצו על אישור. פעולה זו תיצור קובץ WC בכל תיקיית תא עבור התנאי שנבחר. כל תיקיית תא תכיל חמישה קבצים.

תמונת ה-TIF המקורית, קובץ ה-NDF, מידע עם קו תחתון, קובץ מזהה העקבה, קובץ TXT וקובץ swc. לפני השימוש ב-Neuron Studio, אנו ממליצים שתכירו את תכונות התוכנה ואת קיצורי הדרך שלה. יש להם מדריך למשתמש מקוון מצוין, והכרת קיצורי המקלדת תחסוך לכם זמן רב.

כדי להתחיל, פתח את תוכנת neuron studio ובחר ב-file open בסרגל הכלים של neuron studio, מצא את תמונת ה-TIF של הנוירון שברצונך לערוך ופתח אותה. בחר ב-run settings והזן את הערך 1 בכל אחת משלוש המשבצות.

בחלון גודל הווקסל (voxel size), בחרו בייבוא קובץ s wc. בחרו את קובץ ה-s WC המתאים התואם לקובץ שבו תרצו לעבוד. כעת תופיע תמונית העקבה (trace image) כשכבה מעל קובץ התמונה.

יש להסב את גוף התא (soma) במעגל אדום כדי לקשר את הנוריטים. השתמש בכלי הנוריטים כדי לחבר צמתים, כך שכל נקודת פיצול המיוצגת על ידי צמתים צהובים תוכל ליצור שני ענפים בלבד. כל העקבות חייבים להיות רציפים עם גוף התא.

כעת, כדי לייצא נתונים מ-Neuron Studio, בחרו ב-file, לאחר מכן ב-save neurites, ושמרו בשם ברירת המחדג כדי לבדוק שגיאות בקבצי ה-swc על ידי הקלדת bonfire trace. עברו לחלון הפקודות (command window) ולחצו על enter. בחלון הבחירה (browse for folder), בחרו בתיקיית התנאי המכילה את הנתונים שעובדו זה עתה ולחצו על okay כדי לבדוק אם קיימות שגיאות באחת מהתמונות בתיקייה.

התוכנית תפיק תמונות המציגות את מיקום השגיאה לצורך חילוץ נתונים מורפולוגיים מקבצי ה-dot S WC. הקלידו bonfire בחלון הפקודות ולחצו על enter. בחלו את תיקיית התנאי שברצונכם לנתח בחלון בחירת התיקייה, ובחרו ב-okay עבור כל אחד מהנוירונים הרלוונטיים.

ניתוח ה-bonfire ייצור גרף של מורפולוגיה נוירונלית יחד עם טבעות הכתף (shoulder rings) ששימשו בניתוח. בנוסף, פקודת ה-bonfire תייצר קובץ MAT המכיל את כל המידע המורפולוגי שהופק מהניתוח. כדי לצפות בגרפים ראשוניים של סוג הנתונים, הקלידו bonfire בחלון הפקודות של MATLAB, בחרו בחלון "browse for folder" את תיקיית התנאי שברצונכם לבחון, ולחצו על Okay.

חלון הדפדפן לתיקיות ייסגר זמנית וייפתח מחדש כדי לאפשר בחירה של תנאים נוספים. לאחר בחירת התנאים, בחר ב-cancel כדי לצאת מתהליך הבחירה. תוצאות Bonfire יציגו תרשימי סיכום הכוללים את הנתונים מתיקיות התנאים שבחרת; כדי לייצא את הנתונים המורפולוגיים לקובץ Excel, הקלד bonfire Export בחלון הפקודות של MATLAB.

בחלון חיפוש התיקייה, בחרו את תיקיית התנאי המכילה את הנתונים שברצונכם לייצא ולחצו על אישור. תוכנת Bonfire Export תיצור קבצי Excel של הנתונים המורפולוגיים ותמקם אותם בתיקיית התנאי שנבחרה. כעת נראה דוגמה לנתונים שהופקו על ידי תוכנת Bonfire עבור סט נתונים המכיל שני תנאים.

אלו הן תמונות הפוכות לדוגמה של שני התנאים. ניתן לראות מתמונות אלו כי תנאי אחד מכיל יותר דנדריטים מאשר תנאי שני. תופעה זו ניתנת לצפייה גם במגוון גרפים המופקים על ידי תוכנית ה-bonfire.

מכיוון שתוכנת bonfire מבצעת את הניתוח שלה על תתי-אזורים של הדנדריטים, ניתן לזהות בקלות את העלייה במספר הדנדריטים בתנאי אחת. שרטוט עקומת ה-sholl של העץ הדנדריטי הכולל מראה כי קיימים יותר דנדריטים רחוקים מגוף התא עבור נוירונים בתנאי אחת. שרטוט המספר הממוצע של נקודות פיצול ונקודות קצה לכל תא מראה כי בתנאי אחת ישנם יותר נקודות פיצול ויותר נקודות קצה מאשר בתנאי שתיים. המספר הממוצע של שלוחות לכל תא מוצג עבור דנדריטים מסדר ראשון, שני, שלישי או סדר גבוה יותר. קיימים יותר דנדריטים מסדר שלישי ומסדר גבוה יותר עבור תנאי אחת. שרטוט המספר הממוצע של שלוחות לכל תא עבור דנדריטים של שורש, דנדריטים ביניים ודנדריטים קצביים מראה כי בתנאי אחת ישנן יותר שלוחות ביניים או שלוחות קצביות מאשר בתנאי שתיים.

מוצגות כאן עקומות ניתוח shoal ספציפיות לזהות הסגמנטים, שבהן הסגמנטים מקובצים כראשוניים, שניוניים, או שלישוניים ומעלה. העלייה בדנדריטים שלישוניים מתרחשת מרחוק מגוף התא עבור נוירונים במצב אחד. מוצגות עקומות ניתוח shoal ספציפיות לזהות הסגמנטים שבהן הסגמנטים מקובצים כסגמנטי שורש, סגמנטים ביניים, או סגמנטים טרמינליים.

העלייה בדנדריטים הביניים והסופיים בתנאי אחד מתרחשת במרחק מהגוף התאי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע ניתוח shoal באמצעות תוכנת bonfire כדי לצפות בשינויים מקומיים במורפולוגיה עצבית.