ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

סרטון זה מדגים פרוצדורה לניתוח המורפולוגיה של דנדריטים ואקסונים, המכונים יחד נוריטים, באמצעות תוכנה חצי-אוטומטית כדי לצפות בשינויים מקומיים. ראשית, נעשה שימוש בתוכנת neuron J כדי לעקוב אחר תמונות TIFF של נוירונים ברזולוציה של שמונה ביט לצורך זיהוי מיקומם של מקטעי נוריטים. לאחר מכן, נעשה שימוש בתוכנת Neuron studio כדי להגדיר מידע מבני על הקישוריות בין הנוריטים.

לבסוף, מריצים את תוכנית ה-MATLAB bonfire כדי להפיק נתונים מורפולוגיים מהתאים, כולל ניתוח shoal, וכן את מספר נקודות הפיצול של הניוריטים וקצות הניוריטים. התוצאות מראות שינויים מקומיים במורפולוגיה של הניוריטים על בסיס ביצוע ניתוח shoal בתתי-אזורים של העץ הניוריטי. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח shoal ידני, הוא שהתוכנה היא חצי-אוטומטית, מה שמעלה במידה ניכרת את יעילות הניתוח ומאפשר לבקר את הנתונים על מנת שניתן יהיה לאמת את דיוק הניתוח.

את הפרוצדורה תדגים Hirsch AWA, סטודנטית לתואר ראשון העובדת במעבדת Firestein במהלך הקיץ. כדי להשתמש בתוכנת bonfire לניתוח המאפיינים המורפולוגיים של תמונות neurites בפורמט eight bit tiff, יש להשיג תמונות של נוירונים בודדים לאחר הורדת תוכנת bonfire. יש להתאים את הגדרות התוכנה בהתאם לרזולוציית התמונות שברצונכם לנתח; בחלק הפרמטרים של תוכנת bonfire, החליפו את הערך הנוכחי עבור המשתנה picks conversion בערך רזולוציית התמונה של התמונות שלכם.

כדי ש-bonfire יוכל לנתח את הנתונים, הקבצים חייבים להיות מאורגנים במבנה ספציפי, הכולל תיקיית מאסטר, תיקיית bonfire המכילה את קבצי ה-MATLAB M של bonfire, תיקיות משנה המכילות כל אחד מהתנאים השונים, וקבצי תמונות התאים בתוך תיקיות התנאים השונות. התחילו בהכנת התמונה לעקיבה. בניסוי זה, רק הדנדריטים יעקבו כדי לנתח שינויים במורפולוגיה דנדריטית. התחילו בהכנת התמונה לעקיבה.

פתחו את התמונה על ידי לחיצה על כפתור הפתיחה (open) בסרגל הכלים של neuron J ובחרו את התמונה שברצונכם לעקוב אחריה. כעת, הגדילו את התמונה על ידי לחיצה על כפתור ההגדרה למסך מלא (maximize) כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של התמונה, כך שתוכלו להבחין בכל ה-Neurites; בחרו ב-image בסרגל הכלים של neuron J, ולאחר מכן בחרו ב-adjust brightness contrast. כדי להתחיל בעקיבה, לחצו על כפתור הוספת עקיבות (add traces) בסרגל הכלים של neuron J. עקבו לאורך היקף גוף התא.

לאחר מכן, בחרו את כפתור label tracings בסרגל הכלים של neuron J ובחרו N one מהתפריט הנפתח של tracing ID, בחרו type zero six בחלון ה-neuron J attributes ולחצו על Okay. כדי להתחיל בשרטוט הניוריטים, בחרו את כפתור add traces בסרגל הכלים של neuron J והוסיפו שרטוט לאורך כל ענף ניוריטי הרלוונטי. מומלץ שהמקטעים שתשרטטו יסתיימו בכל נקודת פיצול, כך שכל ענף בת יתחיל מאותה נקודה כשרטוט חדש.

בחרו את כפתור שמירת העקבות (save tracings) בסרגל הכלים של neuron J ושמרו את העקבה שיצרתם כעת באותה תיקייה של קובץ התמונה המקורי. לאחר מכן, ייצאו את קבצי העקבות ואת קבצי מזהה העקבות מ-neuron J. בחרו את כפתור ייצוא עקבות (export trace) בסרגל הכלים של neuron J. כעת, בחרו באפשרות קבצי טקסט מופרדים בטאבים (tab delimited text files) עם קובץ נפרד לכל עקבה (separate file for each tracings) בתיבת הדיאלוג של הייצוא ב-neuron J, ולחצו על אישור (okay) כדי לאפשר ל-neuron J לבחור את שמות הקבצים ואת מיקום השמירה.

לחצו על כפתור measure tracings בסרגל הכלים של neuron J, ולאחר מכן בחרו באפשרות display tracings measurements בחלון המדידות של neuron J ולחצו על run. בחרו את הקובץ בחלון ה-tracings של neuron J, ולאחר מכן בחרו ב-save as ושמרו את הקובץ. שם הקובץ חייב להתابق בדיוק לשם קובץ התמונה המקורי, ואחריו קו תחתון ומילה info, ללא סיומת קובץ בת שלוש אותיות. ודאו שהמחשב שלכם אינו מוסיף באופן אוטומטי סיומת קובץ XLS.

אם כן, יש למחוק ידנית את סיומת הקובץ. ראשית, ארגנו מחדש את התיקיות באמצעות bonfire load על ידי פתיחת matlab ולחיצה על כפתור שלוש הנקודות בפינה הימנית העליונה של חלון הפקודות (command window). בחלו את תיקיית bonfire בתוך תיקיית המאסטר שלכם בחלון בחירת התיקייה (browse for folder), הקלידו bonfire load לחלון הפקודות ולחצו על enter.

בחרו בחלון החיפוש את תיקיית התנאי שברצונכם לנתח ולחצו על אישור. פעולה זו תארגן מחדש את מבנה התיקיות על ידי יצירת תיקיות משנה לתאים, המכילות את כל הנתונים עבור כל תא בנפרד. כעת, כדי ליצור קובצי filename_premium swc, הקלידו bonfire_NDF2swc בחלון הפקודות ולחצו על Enter.

בחלון בחירת התיקייה, בחרו בתיקיית התנאי שזה עתה אורגנה מחדש באמצעות bonfire load, ולחצו על אישור. פעולה זו תיצור קובץ WC בכל תיקיית תא עבור התנאי שנבחר. כל תיקיית תא תכיל חמישה קבצים.

תמונת ה-TIF המקורית, קובץ ה-NDF, מידע עם קו תחתון, קובץ מזהה העקבה, קובץ TXT וקובץ swc. לפני השימוש ב-Neuron Studio, אנו ממליצים שתכירו את תכונות התוכנה ואת קיצורי הדרך שלה. יש להם מדריך משתמש מקוון מצוין, והכרת קיצורי המקלדת תחסוך לכם זמן רב.

כדי להתחיל, פתחו את תוכנת neuron studio ובחרו ב-file open בסרגל הכלים של neuron studio, ואתרו את תמונת ה-TIF של הנוירון שברצונכם לערוך ופתחו אותה. בחרו ב-run settings והזינו את הערך 1 בכל אחת משלוש תיבות הטקסט.

בחלון גודל הווקסל (voxel size), בחרו ב-file import s wc. בחרו את קובץ ה-s WC המתאים התואם לקובץ שבו תרצו לעבוד. קובץ התמונה יכוסה כעת על ידי תמונת העקיבה (trace image).

יש להניח מעגל אדום מעל גוף התא (soma) כדי לקשר את הנויריטים. השתמש בכלי הנויריטים כדי לחבר צמתים, כך שכל נקודת פיצול המיוצגת על ידי צמתים צהובים תוכל ליצור שני ענפים בלבד. כל העקבות חייבות להיות רציפות עם גוף התא.

כעת, כדי לייצא נתונים מ-Neuron Studio, בחרו ב-file, לאחר מכן ב-save neurites, ושמרו בשם ברירת המחדג כדי לבדוק שגיאות בקבצי swc על ידי הקלדת bonfire trace. עברו לחלון הפקודות ולחצו על enter. בחלון browse for folder, בחרו את תיקיית התנאים המכילה את הנתונים שעובדו זה עתה, ולחצו על okay כדי לבדוק אם קיימות שגיאות באחת מהתמונות בתיקייה.

התוכנה תפיק תמונות המציגות את מיקום השגיאה לצורך חילוץ נתונים מורפולוגיים מקבצי ה-dot S WC. הקלידו bonfire בחלון הפקודות ולחצו על enter. בחלונית בחירת התיקייה, בחרו את תיקיית התנאי שברצונכם לנתח, ואשרו בלחיצה על okay עבור כל אחד מהנוירונים הרלוונטיים.

ניתוח ה-bonfire יפיק גרף של מורפולוגיה נוירונלית יחד עם טבעות הכתף (shoulder rings) ששימשו בניתוח. בנוסף, פקודת ה-bonfire תפיק את קובץ ה-MAT המכיל את כל המידע המורפולוגי שהופק מהניתוח. כדי לצפות בגרפים ראשוניים של הנתונים, הקלידו bonfire בחלון הפקודות של MATLAB, בחרו בחלון "חפש תיקייה" (browse for folder) את תיקיית התנאי שברצונכם לצפות בו, ולחצו על "אישור" (Okay).

חלון בחירת התיקייה ייסגר זמנית וייפתח מחדש כדי לאפשר בחירה של תנאים נוספים. לאחר בחירת התנאים, יש לבחור ב-cancel כדי לצאת מתהליך הבחירה. תוצאות ה-Bonfire יציגו תרשימי סיכום הכוללים את הנתונים מתיקיות התנאים שבחרתם; כדי לייצא את הנתונים המורפולוגיים לקובץ Excel, הקלידו bonfire Export בחלון הפקודות של MATLAB.

בחלון בחירת התיקייה, בחרו את תיקיית התנאי המכילה את הנתונים שברצונכם לייצא ולחצו על אישור. תוכנת bonfire export תיצור קבצי Excel של הנתונים המורפולוגיים ותמקם אותם בתיקיית התנאי שנבחרה. כעת נראה לכם דוגמה לנתונים שהופקו על ידי תוכנת bonfire עבור סט נתונים המכיל שני תנאים.

אלו הן תמונות הפוכות לדוגמה של שני התנאים. ניתן לראות מתמונות אלו כי תנאי אחד מכיל יותר דנדריטים מאשר תנאי שניים. תופעה זו ניתנת לצפייה גם במגוון גרפים שנוצרו באמצעות תוכנת bonfire.

מכיוון שתוכנת bonfire מבצעת את הניתוח שלה על תתי-אזורים של הדנדריטים, ניתן לזהות בקלות את העלייה במספר הדנדריטים בתנאי אחד; שרטוט עקומת ה-sholl של העץ הדנדריטי הכולל מראה כי ישנם יותר דנדריטים מרוחקים מגוף התא עבור נוירונים בתנאי אחד. שרטוט המספר הממוצע של נקודות פיצול ונקודות קצה לכל תא מראה כי בתנאי אחד ישנן יותר נקודות פיצול ויותר נקודות קצה מאשר בתנאי שני. המספר הממוצע של שלוחות לכל תא מוצג עבור דנדריטים מסדר ראשון, שני, שלישי או סדר גבוה יותר. קיימים יותר דנדריטים מסדר שלישי ומסדר גבוה יותר בתנאי אחד; שרטוט המספר הממוצע של שלוחות לכל תא עבור דנדריטים של שורש, ביניים וקצה מראה כי בתנאי אחד ישנן יותר שלוחות ביניים או שלוחות קצה מאשר בתנאי שני.

מוצגות כאן עקומות ניתוח shoal ספציפיות לזהות הסגמנטים, שבהן הסגמנטים מקובצים כראשוניים, שניוניים או שלישוניים ומעלה. העלייה בדנדריטים שלישוניים מתרחשת במרחק מהגוף התאי עבור נוירונים בתנאי one. מוצגות עקומות ניתוח shoal ספציפיות לזהות הסגמנטים, שבהן הסגמנטים מקובצים כסגמנטי שורש, סגמנטים ביניים או סגמנטים טרמינליים.

העלייה הן בדנדריטים הביניים והן בדנדריטים הסופיים במצב הראשון מתרחשת מרחוק מגוף התא. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן ביצוע ניתוח shoal באמצעות תוכנית bonfire כדי להבחין בשינויים מקומיים במורפולוגיה העצבית.