Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

נוירונים מההיפוקמפוס ומהקורטקס שימשו רבות למחקר של קיטוב נוירונלי במערכת העצבים המרכזית, צמיחת אקסונים ודנדריטים, ויצירת סינפסות ותפקודן; היתרון בתרבית של נוירונים אלה הוא שהם מקוטבים בקלות ומפתחים אקסונים ודנדריטים מובחנים על תשתית דו-ממדית בצפיפויות נמוכות מאוד. סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד, תרבית והטרנספקציה של נוירונים עובריים מההיפוקמפוס ומהקורטקס של עכבר באמצעות nucleofection, המאפשרת ביטוי של חלבונים מותחים עם תג פלואורסצנטי בשלב מוקדם של ההתפתחות, כ-4 עד 8 שעות לאחר הזריעה. הביטוי של החלבונים המתוגים פלואורסצנטית נשמר לאורך כל חיי הנוירון, למשך יותר מחודשיים בתרבית. דבר זה מאפשר לחקור את תפקוד החלבונים במהלך אירועי התפתחות מוקדמים, כגון צמיחת אקסונים, ואירועים מאוחרים יותר, כגון סינפטוגנזה ופלסטיות סינפטית.

ראשית, מבודדים תאי גליה מההמספרים הקורטיקליים של גורי עכבר בני יום אחד עד שלושה לאחר הלידה, וזורעים אותם בבקבוקונים. לאחר הגעה לרמת התרבות (confluency) של 70% עד 100%, תאי הגליה נזרעים מחדש על לבישי זכוכית.

לאחר מכן מבודדים נוירונים מההיפוקמפוס או מקליפת המוח של עכברים בשלב E 15.5, ומבצעים טרנספקציה באמצעות נוקלאופקציה (nucleofection) עם פלסמידים המקודדים לחלבונים מאוחדים פלואורסצנטיים, כגון חלבון פלואורסצנטי אדום. הנוירונים שעברו טרנספקציה נזרעים לאחר מכן בתאי הדמיה למחקרים לטווח קצר. עבור תרביות לטווח ארוך, תאי גליה על כיסויי זכוכית (cover slips) מועמדים באופן הפוך מעל התרביות של ההיפוקמפוס או קליפת המוח כדי לספק תמיכה טרופית; לאחר מכן ניתן להדמיות נוירונים בודדים כדי להראות את הלוקליזציה הדינמית של החלבונים המאוחדים לאורך האקסונים או הדנדריטים של הנוירונים.

שלום, אני אריק דנט, פרופסור עוזר לאנטומיה באוניברסיטת ויסקונסין מדיסון. היום, שלושה מהסטודנטים לתואר ראשון שלי, כריס וזלמן, ג'ייסון בווה ודרק לומבארד, ידגימו הליך לבידוד, זריעה ותחזוקה של תרביות של נוירונים קורטיקליים והיפוקמפליים לתרביות לטווח קצר וארוך. ניתן להשתמש בתרביות אלו כדי לחקור את הדינמיקה של חלבונים מאוחות פלואורסצנטיים לאורך ההתפתחות הנוירונלית, החל מהצמיחה הראשונית של נוריטים, דרך התפתחות האקסונים והדנדריטים ועד לשלב הסינפטוגנזה.

להכנת התאיים לצילום, השתמשו בנוירונים עובריים, נוירונים מההיפוקמפוס ונוירונים קורטיקליים של עכברים. התחילו עם צלחוני פטרי בקוטר 35 מילימטר עם חורים בקוטר 15 מילימטר שנקדחו בתחתית, לאחר שהסרתם את כל השבבים.

לאחר מכן, השתמש במברשת צבע קטנה כדי למרוח את הצד התחתון של הצלחת מסביב לחור. הקפד לערבב את תערובת הפרפין והוואזלין בין התאים, שכן היא נוטה להיפרד. הנח את זכוכית הכיסוי מעל החור.

לאחר שכל הצלחות הוכנו, הנח אותן בתנור בטמפרטורה של 80 °C עד להמסת תערובת הפרפין. פעולה זו צריכה להימשך כ-10 דקות. לאחר מכן, הוצא את הצלחות למשטח ישר והמת לפחות דקה אחת עד להת굳דות תערובת הפרפין.

הפכו את הצלחות והניחו אותן תחת מנדף. הדליקו את נורת ה-UV למשך 30 דקות כדי לעקר הן את פנים המכסים והן את תחתית התאים. לאחר מכן בצעו ציפוי.

מטפלים את כיסויי התאים ב-poly D lycine למשך שעה אחת. לאחר מכן, שוטפים ביסודיות את הכיסויים המצופים שלוש עד חמש פעמים במים דה-יוניים מסוננים וסטריליים כדי להסיר את כל השאריות של ה-bore buffer. לאחר השטיפה האחרונה, מייבשים את התאים באמצעות ואקום. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי או לאחסנם בחדר לתרביות רקמה לשימוש מאוחר יותר.

יש להשתמש בתאים המצופים תוך שבוע מהכנתם אם מכינים תרבימי לטווח ארוך. יהיה צורך להתחיל את הכנת שכבות הפיד של גליאל קורטיקלי שבועיים עד שלושה שבועות לפני המשך הדיסקציה של הקורטקס או ההיפוקמפוס. הניחו את מוחותיהם של ארבעה גורים של עכברים בגיל P1 עד P3 בתוך צלחת המכילה מדיום דיסקציה קר, והניחו אותה תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.

הסיר את הפקעות האפיתיות (olfactory bulbs), את שתי המיספרות המוחיות ואת הקרומים. העבר את המיספרות לצלה חדשה שאינה מכילה מדיום. באמצעות להב תעריל סטרילי ונקי, קצץ את קליפות המוח (cortices) עד לרמה הדקה ביותר האפשרית.

לאחר מכן, בעזרת פיפטה מפלסטיק, העבירו את הרקמה הקצוצה למבחנה קונית של 50 מיליליטר המכילה 12 מיליליטר של תווך דיסקציה (dissection Medium) קר. הוסיפו trypsin ו-DNase לריכוזים סופיים של 0.25% ו-0.1% בהתאמה. דגרו באמבט מים של 37 °C למשך 10 דקות תוך כדי ערבוב סיבובי לסירוגין.

בסיום הדגירה, הוצא את המבחנה מאמבט המים ונקה אותה ביסודיות עם 70% ethanol לפני הכנסתה למנדף תרביות הרקמות. בצע פיפטינג (שאיבה ודחיפה) של רקמת הקורטקס למעלה ולמטה.

בעזרת פיפט של 10 מיליליטר, בצעו שאיבה והחזרה כ-10 עד 15 פעמים או עד שרוב הגושים ייעלמו, והחזירו את המבחנה למקלח עם מים למשך 10 דקות נוספות תוך ערבוליות לסירוגין. שוב, נקו ביסודיות את המבחנה ב-70% ethanol והחזירו אותה למCב תרביות הרקמות.

בצעו פיפטינג (pipette) למעלה ולמטה של הרקמה הקורטיקלית. בדומה לשלב הקודם, אך הפעם באמצעות פיפטה של 5 מיליליטר, הוסיפו 15 מיליליטר של מצע גליאלי (glial medium) חמים וסבבו בצנטריפוגה ב-1000 RPM למשך 10 דקות. השליכו את העלייה (supernatant) ושחזרו את התאים ששקעו ב-20 מיליליטר של מצע גליאלי טרי.

השתמשו ב-hemo cytometer כדי לספור את התאים. לאחר מכן, זרעו בין 5 ל-7.5 מיליון תאים ב-15 milliliters של מצע גליאלי לכל בקבוק של 75 centimeter squared. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius; לאחר יום אחד, ובכל יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן בתרבית, שחררו תאים שאינם דבוקים על ידי הקשה של הבקבוק כנגד משטח המנדף.

הסיר את המצע יחד עם תאים שהשתחררו והחלף אותו ב-15 milliliters של מצע גליאלי טרי. ניתן לקצור גליות לאחר שבוע עד שבועיים של גידול בבקבוקים, כאשר הן קרובות ל-100%confluent. כדי להכין לביבות כיסוי בודדות מצופות בגליות, התחל בהנחת שש לביבות שנוקו בחומצה חנקית ועומסטרילו.

הניחו כיסויות עגולות בקוטר 25 מילימטר בתוך צלחת של 10 סנטימטר, ובעזרת מברשת צבע קטנה, הניחו שלוש נקודות של תערובת של פראפין ווזלין ביחס של שלושה לאחד על כל כיסוי, במבנה של משולש. הניחו שתי נקודות על קצוות הכיסוי כדי לעגנו לצלחת.

טפל בצלחות פתוחות באמצעות קרינת UV למשך 30 דקות. צפה את הזריקות (cover slips) ב-poly D lysine למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטוף ביסודיות שלוש עד חמש פעמים במים דה-יוניים מסוננים וסטריליים והנח להתייבש; הוצא את תאי הגליה מהאינקובטור.

שפכו את המצע ושטפו עם חמישה מיליליטר של טריפסין שחומם מראש. הוסיפו שלושה מיליליטר של טריפסין לבקבוק והדגירו למשך דקה אחת ב-37 degrees Celsius. ברגע שהתאים השתחררו, הוסיפו חמישה מיליליטר של מצע גליאלי כדי לעצור את פעולת הטריפסין.

הסיר את ה-GL מהבקית על ידי פיפוט למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן, העבר את המצע למבחנה קונית של 15 מיליליטר וסבב במערך צנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך שמונה דקות. לאחר הצנטריפוגציה, השהה את התאים ב-10 מיליליטר של מצע גליאלי.

לאחר ספירת התאים, זרעו 5×10⁵ תאים ב-12.5 מיליליטר של מצע גליאלי לכל צלחת של 10 סנטימטר המכילה את כיסויי הזכוכית. החליפו את המצע במצע גליאלי טרי שחומם מראש מדי יומיים עד שלושה ימים. ביום שלפני דיסקציית הנוירונים, הסירו את המצע הגליאלי והחליפו אותו במצע נטול סרום.

השתמש במצע ללא סרום לתנאי גליאל זה מאוחר יותר. בעת הצפת תרביות קורטיקליות או היפוקמפליות, מוסיפים C לריכוז סופי של חמישה micromolar. על מנת למנוע תהליכי שגשוג גליאליים, השתמש בריאגנטים הנוקלאואקטיביים לטרנספקציה כפי שמופיע בהוראות היצרן, ולאחר מכן חמם את התמיסה לטמפרטורת החדר.

הניחו צלחית המכילה מוחות עכברים בשלב התפתחותי E 15.5 בתוך תמיסת דיסקציה קרה. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו במחט טונגסטן כפופה כדי להסיר את שתי הניאוקורטקסים (הקליפות החיצוניות). לאחר מכן, בעזרת פינצטה מיקרוסקופית, הסירו את הקרומיות והעבירו את הקורטקסים לצלחית חדשה של תמיסת דיסקציה קרה.

ניתן לראות את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח לאורך הצד המדיאלי של ההמיספרה המוחית בעזרת מספרי איריס קטנים. הסר בזהירות את ההיפוקמפוס. לאחר מכן, הסר את יתר קליפת המוח.

חזור על הניתוח במוחות של כל השגר. הנח את קליפות ההיפוקמפוס (hippo Camp Cortices) במבחנות מיקרו של 1.5 מיליליטר נפרדות הממולאות ב-1 מיליליטר של Medium לניתוח קר. הנח את המבחנות על קרח לאחר ניתוח כל הקליפות וההיפוקמפוסים.

הוסיפו 110 µL של 2.5% trypsin למבחנות המיקרו-צנטריפוגה המכילות את הרקמה, והניחו את המבחנות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. בעזרת פ pipette P 1000, הסירו מהמבחנה כמה שיותר נוזל. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של מצע זריעה (plating medium) לכל מבחנה ושטפו את הרקמה על ידי היפוך עדין של מבחנת המיקרו-צנטריפוגה.

חזור על השטיפה פעמיים. לאחר השטיפה האחרונה, הוסף 1 milliliter של מצע זריעה. השתמש בפיפט P 1000 כדי לטריטורט (triturate) את הגושים 15 פעמים. לאחר מכן, העבר את העלייה (supernatant) ואת התאים לשפופרת קונית חדשה של 15 milliliter המכילה 4 milliliter של מצע זריעה, והשאר את הגושים שנותרו בשפופרת המיקרו-צנטריפוגה.

סובב את המבחנה בנפח 15 milliliter במהירות של 350 RPM למשך שבע דקות עם הפסקת בלימה (break) בסיום הסבוב, השלף את הנוזל העליון (supernatant) והוסף 100 microliters של תמיסת nuclear affection שהוכנה מראש בטמפרטורת החדר עבור כל transfection; בצע פיפוט למעלה ולמטה חמש פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, העבר 100 microliters של תערובת תאי ה-nuclear affection לכל מבחנה מיקרו-צנטריפוגה חדשה המכילה כמות מתאימה של DNA; כמות של 1-2 micrograms של DNA לכל transfection עבור תרביות ארוכות טווח תסמן פחות מ-10% מהנוירונים בתרבית.

בעוד ש-5 עד 10 מיקרוגרם של DNA לכל טרנספקציה יביאו ליעילות טרנספקציה גבוהה יותר עבור התרבית, הוסף את תמיחת התאים ותערובת ה-DNA לכלי אלקטרופורציה. לאחר מכן, הנח את הכלי בתוך מכשיר האלקטרופורציה. עבור נוירונים של CNS מעכבר, הגדר את תוכנית ה-nucleo effector ל-oh 0 0 5; תוך עבודה מהירה, הוסף 500 מיקרוליטר של מצע זריעה שחומם מראש והגיע לשיווי משקל לכלי, והעבר את תמיסת התאים למבוב מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.

הוסיפו מספיק מצע זריעה כדי להביא את הנפח של כל טרנספקציה ל-1 ml. לאחר ספירת התאים, זרעו 3 עד 5 שעות 10³ תאים לסמ"ר עבור תרביות צעירות, או 5 עד 10 שעות 10³ תאים לסמ"ר עבור תרביות ארוכות טווח; בדרך כלל משתמשים ב-5×10⁵ או 1×10⁶ תאים לכל טרנספקציה להכנת תרביות קצרות טווח.

שעה לאחר הזריעה, הצפו את צלחות התרבית בנפח 35 מילימטר בשני מיליליטר של מצע ללא סרום, חמים ומאוזן עם פחמן דו-חמצני. תאי הדמיה מניבים תכולת סרום נמוכה מאוד, פחות מ-0.5%. תרביות לטווח קצר אינן דורשות גידול עם שכבת תאי תמיכה גליאליים (glial feeder layer) ואינן דורשות הזנה חוזרת. להכנת תרביות לטווח ארוך, הוסיפו מיליליטר אחד של תמצית גליאלית (glial condition) למצע ללא סרום.

הסירה זכוכית כיסוי מצופה GL המכילה שלוש נקודות של וזלין פראפין והפוך אותה מעל החור בקוטר 15 מילימטר במנתח 35. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד נוסף של מצע כדי להזין את תרביות ארוכות הטווח. החלף שליש מהמצע נטול הסרום מדי יומיים עד שלושה ימים.

לאחר חמישה עד שבעה ימים בתרבית, מוסיפים Cytosine Arabinoside (Ara-C) לריכוז סופי של 5 µM כדי למנוע פרוליפרציה גליאלית. התמונות הזוגיות הבאות של נוירונים היפוקמפליים חיים מייצגים מציגות הן תמונת DIC (ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית) והן מיקרוגרף פלואורסצנטי תואם. כל אחד מהתאים הללו עבר טרנספקציה עם EGFP, Tubulin ו-DsRed2 בוקטורים של pA.

במהלך שלב אחד, נוירונים יתחברו תחילה, ובמשך יום בערך, יוציאו la melo podia דמויי לוחות ו-Filip podia דמויי אצבעות מסביב להיקף גוף התא. במהלך שלב שני, הבליטות הראשוניות יתמיינו למספר neurites הנובעים מגוף התא, אשר בדרך כלל נשארים באורך של כ-30 עד 50 microns. במהלך שלב שלוש, באופן סטוכסטי, אחד ה-neurites מתחיל להתארך במהירות כדי להפוך לאקסון.

הנוריטים האחרים נותרים קצרים ומכונים שלוחות משניות. רוב נוירוני ההיפוקמפוס והקליפה הגיעו לשלב שלושה תוך יומיים עד שלושה ימים בתרבית; במהלך שלב ארבע, המתרחש במהלך השבוע או השבועיים הבאים, השלוחות המשניות מעбеות, מתארכות ומסתעפות כדי להפוך לדנדריטים, אשר מוצגים כאן בירוק. במקביל, האקסון נהיה דק יותר בעודו ממשיך לגדול ולהסתעף עד לשבועיים עד שלושה שבועות.

בתרבית, דנדריטים מבצעים דיפרנציאציה על ידי יצירת קוצים דנדריטיים (dendritic spines), שהם בליטות קטנות לאורך הדנדריטים. נוירונים בשלב חמישה ישתנו בצורתם ובגודלם, אך רובם אמורים לעבור את סדרת שלבי התפתחות זו. ייתכן שנוירונים שעברו טרנספקציה לא יתקדמו בשלבים אלו אם ביטוי יתר של חלבונים משבש את התפתחות הנוירונים.

בנוסף, ייתכן שנוירונים לא יתקדמו דרך כל שלבי ההתפתחות. אם כיסויי הזכוכית (cover slips) לא נקיים כראוי או אם הפוליליזין אינו נצמד כראוי, גם גלייה עשויים להתרבות באופן נרחב, במיוחד אם לא נעשה שימוש ב-C. זוהי תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) של תרבית בת שבועיים, שבה הגלייה גדלו מעבר לתרבית בתרביות ארוכות טווח.

החלפת המצע בתדירות גבוהה מדי או נמוכה מדי עלולה לפגוע בחיוניות של הנוירונים. זוהי תמונת ניגודיות פאזה של תרבית שבה רוב הנוירונים מתו, ולנוירונים שנותרו יש גופי תא מכווצים ובלתיים (beaded processes) בתהליכים. להשוואה, זוהי תמונת ניגודיות פאזה של נוירונים בריאים מההיפוקמפוס לאחר שבועיים בתרבית. שימו לב לגופי התא הגדולים יותר ולהיעדר הבלתיים בתהליכים.

כמו כן, בשלב זה, התהליכים הדנדריטיים התעב próximos וישנו רשת עדינה ונרחבת של תהליכים אקסונליים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע דיסקציה של עוברים, הפרדה קורטיקלית, טרנספקציה והשתלה של שגר של עוברים שלמים תוך שעתיים, אם הפעולה מבוצעת כראוי. במהלך ניסיון ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי נוירונים מההיפוקמפוס ומהקורטקס רגישים מאוד לשיבוש מכני.

כמו כן, חשוב לשמור על התמיסות קרות ככל האפשר במהלך בידוד הנוירונים כדי לשמור על פעילות מטבולית נמוכה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון דימות תאים חיים והקלטה פיזיולוגית של פעילות, על מנת לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו חלבוניהם של חלבונים מאוחדים פלואורסצנטיים רלוונטיים מתפזרים לאזורים שונים בנוירון, או האם לוקליזציה של חלבונים קשורה לשינויים בפעילות סינפטית, או כיצד התפקוד של חלבונים אלו מושפע מטיפולים פרמקולוגיים שונים.