Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

נוירונים מההיפוקמפוס ומהקורטקס שימשו רבות למחקר של קיטוב נוירונלי במערכת העצבים המרכזית, צמיחת אקסונים ודנדריטים, והיווצרות ותפקוד של סינפסות; היתרון בגידול של נוירונים אלו הוא שהם מקוטבים בקלות ומגבשים אקסונים ודנדריטים מובחנים על מצע דו-ממדי בצפיפויות נמוכות מאוד. סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד, תרבית והטרנספקציה של נוירונים עובריים של עכבר מההיפוקמפוס ומהקורטקס באמצעות נוקלאופקציה, המאפשרת ביטוי של חלבוני היתוך המסומנים בفلורסצנציה בשלב מוקדם של ההתפתחות, כארבע עד שמונה שעות לאחר הזריעה. הביטוי של החלבונים המסומנים בفلורסצנציה נשמר לאורך כל חיי הנוירון, למשך יותר משני חודשים בתרבית. דבר זה מאפשר את חקר תפקודי החלבונים במהלך אירועי התפתחות מוקדמים, כגון צמיחת אקסונים, ואירועים מאוחרים יותר, כגון סינפטוגנזה ופלסטיות סינפטית.

ראשית, מבודדים תאי גליה מהםיספירות קורטיקליות של גורי עכבר בני יום אחד עד שלושה לאחר הלידה, וזורעים אותם בבקבוקons. לאחר הגעה ל-70 עד 100% התמלאות (confluency), תאי הגליה נזרעים מחדש על כיסויי זכוכית (coverslips).

לאחר מכן, מבודדים נוירונים מההיפוקמפוס או מקורטקס של עכברים ביום העוברים E 15.5, ומבצעים טרנספקציה באמצעות נוקלאואפקציה (nucleofection) עם פלסמידים המקודדים לחלבוניהם של חלבונים פלואורסצנטיים, כגון חלבון פלואורסצנטי אדום. הנוירונים שעברו טרנספקציה נזרעים לאחר מכן בתאי דימות למחקרים קצרי טווח. עבור תרביות ארוכות טווח, מניחים תאי גליה על כיסויי זכוכית (coverslips) באופן הפוך מעל תרביות של נוירונים מההיפוקמפוס או מהקורטקס כדי לספק תמיכה טרופית; לאחר מכן ניתן לדמות נוירונים בודדים כדי להראות את הלוקליזציה הדינמית של חלבוני היתוך לאורך האקסונים או הדנדריטים של הנוירונים.

שלום, אני אריק דנט, פרופסור עוזר לאנטומיה באוניברסיטת ויסקונסין מדיסון. היום, שלושה מהסטודנטים לתואר ראשון שלי, כריס וזלמן, ג'ייסון בווה ודרק לומבארד, ידגימו הליך לבידוד, זריעה ותחזוקה של תרביות נוירונים קורטיקליים ונוירונים מההיפוקמפוס לתרביות לטווח קצר וארוך. ניתן להשתמש בתרביות אלו כדי לחקור את הדינמיקה של חלבוני היתוך פלואורסצנטיים לאורך ההתפתחות הנוירונלית, החל מהצמיחה הראשונית של נוריטים, דרך התפתחות אקסונים ודנדריטים ועד לסנפטוגנזה.

כדי להכין את התאים לצילום, השתמש בנוירונים עובריים של עכבר מההיפוקמפוס ומהקורטקס. התחל עם צלחות פטרי בקוטר 35 מילימטר עם חורים בקוטר 15 מילימטר שנקדחו בתחתית, לאחר שהוסרו כל השבבים. המס תערובת של פראפין ווזלין ביחס של שלושה לאחד בתוך מבחנה קונית על ידי הנחתה במקלח מים רותחים.

לאחר מכן, השתמש במברשת צבע קטנה כדי למרוח את החלק התחתון של הצלחת מסביב לחור. הקפד לערבב את תערובת הפרפין והוזלינ (paraffine petroleum jelly) בין התאים, כיוון שהיא נוטה להיפרד. הנח את לביבת הכיסוי מעל החור.

לאחר שכל הצלחות הוכנו, הניחו אותן בתנור בטמפרטורה של 80 °C עד שתערובת הפרפין תימס. תהליך זה אמור להימשך כ-10 דקות. לאחר מכן, הוציאו את הצלחות למשטח שטוח והניחו לתערובת הפרפין להתמצק למשך דקה אחת לפחות.

הפכו את הצלחות והניחו אותן תחת מapay. הדליקו את נורת ה-UV למשך 30 דקות כדי לעקר הן את החלק הפנימי של המכסים והן את תחתית התאים. לאחר מכן בצעו ציפוי.

מטפטפים poly D lycine על כיסויי התא של התא למשך שעה אחת. לאחר מכן, שוטפים ביסודיות את הכיסויים המצופים שלוש עד חמש פעמים במים דה-יוניים מסוננים וסטריליים כדי להסיר את כל שאריות ה-bore buffer. לאחר השטיפה האחרונה, משתמשים בוואקום כדי לייבש את התאים. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי או לאחסנם בחדר לתרביות רקמה לשימוש מאוחר יותר.

יש להשתמש בתאים מצופים בתוך שבוע מההכנה במקרה של הכנת תרביות לטווח ארוך. יש להתחיל את הכנת שכבות המזינים של גלייה קורטיקלית שבועיים עד שלושה שבועות לפני המשך עם ההפרדות של הקורטקס או ההיפוקמפוס. יש להניח את מוחותיהם של ארבעה גורי עכבר בשלבי P1 עד P3 בצלחת המכילה מדיום הפרדה קר ולהניח אותה תחת מיקרוסקופ ההפרדה.

הסיר את הפקעות הריחניות (olfactory bulbs), את שתי המיספרות המוחיות ואת הקרומים. העבר את המיספרות לכלי חדש שאינו מכיל מצע גידול. בעזרת להב תעריל סטרילי ונקי, קצץ את קליפות המוח (cortices) באופן דק ככל האפשר.

לאחר מכן, באמצעות פיפט פלסטיק, העבירו את הרקמה הקצוצה למבחנה קונית של 50 milliliter המכילה 12 milliliters של Medium לניתוח קר. הוסיפו trypsin ו-DNase עד לריכוזים סופיים של 0.25% ו-0.1% בהתאמה. הדגרימו באמבט מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך 10 דקות תוך써 ערבולת (swirling) לסירוגין.

לאחר הדגירה, הוצא את המבחנה מאמבט המים ונקה אותה ביסודיות עם 70% ethanol לפני העברתה למטבע הרקמות. שאב את רקמת קליפת המוח (cortical tissue) למעלה ולמטה באמצעות פיפטה.

בעזרת פיפט של 10 מיליליטר, בצעו שאיבה והחזרה כ-10 עד 15 פעמים או עד שרוב הגושים ייעלמו, והחזירו את המבחנה למקלחת המים ל-10 דקות נוספות תוך סיבובים לסירוגין. שוב, נקו ביסודיות את המבחנה ב-70% ethanol והחזירו אותה למכסה הרקמות.

בצעו פיפטאז (pipette) של הרקמה הקורטיקלית מעלה ומטה. כפי שנעשה בעבר, הפעם באמצעות פיפטה של 5 ml, הוסיפו 15 ml של מצע גליאלי (glial medium) חמים וסובבו בצנטריפוגה ב-1000 RPM למשך 10 דקות. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את התאים שהשקיעו (pelleted cells) ב-20 ml של מצע גליאלי טרי.

השתמשו ב-hemo cytometer כדי לספור את התאים. לאחר מכן, זרעו 5 עד 7.5 מיליון תאים ב-15 milliliters של מצע גליאלי (glial medium) לכל בקבוק (flask) של 75 centimeter squared. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius; לאחר יום אחד, ובכל יומיים עד שלושה ימים לאחר מכן בתרבית, השחרריו תאים לא קשורי על ידי הקשה של הבקבוק כנגד פני השטח של מכן העבודה (hood).

הסיר את המצע יחד עם תאים שהשתחררו והחלף אותו ב-15 milliliters של מצע גליאלי טרי. ניתן לקצור תאי גליא לאחר שבוע עד שבועיים של גידול בבקבוקים, כאשר הם קרובים ל-100%confluent. כדי להכין לוחות כיסוי בודדים מצופים בגליא, התחל בהנחת שישה לוחות שנקיים בחומצה חנקית ועומדרו.

הניחו כיסויות זכוכית עגולות בקוטר 25 מילימטר בתוך צלח של 10 סנטימטר, ובעזרת מכחול קטן, הניחו שלוש נקודות של תערובת פראפין ווזלין ביחס של 3:1 על כל כיסוי זכוכית בתבנית משולשת. הניחו שתי נקודות בשולי כיסוי הזכוכית כדי לקבע אותו לצלח.

טפל בצלחות פתוחות באמצעות אור UV למשך 30 דקות. צפה את כיסויי הזריקה (cover slips) ב-poly D lysine למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטוף היטב שלוש עד חמש פעמים במים דה-יוניים מסוננים וסטריליים והנח להם להתייבש, והוצא את תאי הגלייה מהאינקובטור.

שפוך את המצע ושטוף עם חמישה מיליליטר של trypsin שחומם מראש. הוסף שלושה מיליליטר של trypsin לבקבוק והדגר למשך דקה אחת ב-37 °C. לאחר שהתאים השתחררו, הוסף חמישה מיליליטר של מצע גליאלי כדי לעצור את פעולת ה-trypsin.

הסיר את ה-GL מהבקבוק על ידי פיפוט למעלה ולמטה 10 עד 15 פעמים. לאחר מכן, העבר את המצע למבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר וסבב במערך צנטריפוגה במהירות של 1000 RPM למשך שמונה דקות. בעקבות הצנטריפוגה, השהה את התאים ב-10 מיליליטר של מצע גליאלי.

לאחר ספירת התאים, זרעו 5×10⁵ תאים ב-12.5 מיליליטר של מצע גליאלי לכל צלחת בקוטר 10 סנטימטר המכילה את כיסויי הזכוכית (coverslips). החליפו את המצע במצע גליאלי טרי שחומם מראש מדי יומיים עד שלושה ימים. ביום שלפני דיסקציה של הנוירונים, הסירו את המצע הגליאלי והחליפו אותו במצע נטול סרום.

השתמש במצע ללא סרום עבור תנאי גליאלי זה מאוחר יותר. בעת הצפת תרביות קורטיקליות או היפוקמפליות, מוסיפים C לריכוז סופי של five micromolar. כדי למנוע התרבות גליאלית של רכיבי נוקלאו-אפקציה, הוסף את רכיבי הטרנספקציה לפי הוראות היצרן, ולאחר מכן חמם את התמיסה לטמפרטורת החדר.

הניחו צלחת המכילה מוחות עכברים בשלב התפתחותי E 15.5 בתוך תּוך דיסקציה קר. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו במחט טונגסטן כפופה כדי להסיר את שתי הנאו-קורטקסים (neo cortices). לאחר מכן, בעזרת פינצטה מיקרוסקופית, הסירו את קרומי המוח (meninges) והעבירו את הקורטקסים לצלחת חדשה עם תוך דיסקציה קר.

ניתן לראות את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח לאורך הצד המדיאלי של חצ이는 המוח באמצעות מספרי איריס קטנים. הסר בזהירות את ההיפוקמפוס. לאחר מכן, הסר את שארית קליפת המוח.

חזרו על הנתיחה במוחות של כל השגרייה. העבירו את קליפות המוח וההיפוקמפוס למבחנות מיקרו של 1.5 מיליליטר נפרדות, הממולאות ב-1 מיליליטר של מדיום נתיחה קר. הניחו את המבחנות על קרח לאחר נתיחת כל הקליפות וההיפוקמפוסים.

הוסיפו 110 µL של 2.5% trypsin למבחנות הסנטריפוגה המכילות את הרקמה, והניחו את המבחנות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. באמצעות פיפט P 1000, הסירו מהמבחנה כמה שיותר נוזל. לאחר מכן, הוסיפו מילילטר אחד של מצע זריעה לכל מבחנה ושטפו את הרקמה על ידי היפוך עדין של מבחנת הסנטריפוגה.

חזור על השטיפה פעמיים. לאחר השטיפה האחרונה, הוסף מיליליטר אחד של מצע זריעה. השתמש בפיפט P 1000 כדי לערבב את הגושים (chunks) 15 פעמים. לאחר מכן, העבר את העלילית והתאים לנבובת קונית חדשה בנפח 15 מיליליטר המכילה ארבעה מיליליטרים של מצע זריעה, והשאר את הגושים שנותרו בתוך נבובת המיקרו-צנטריפוגה.

סובב את המבחנה בנפח 15 מיליליטר במהירות של 350 RPM למשך שבע דקות עם כיבוי הבלם (break) בסיום הסבב, השלך את supernatant והוסף 100 µl של תמיסת nuclear affection בטמפרטורת החדר שהוכנה מראש עבור כל transfection; בצע פיפטינג למעלה ולמטה חמש פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, העבר 100 µl של תערובת תאי ה-nuclear affection והתאים לכל מבחנה מיקרו-צנטריפוגה חדשה המכילה כמות מתאימה של DNA; כמות של 1-2 µg של DNA ל-transfection עבור תרביות ארוכות תסמן פחות מ-10% מהנוירונים בתרבית.

בעוד ששימוש ב-5 עד 10 µg של DNA לכל טרנספקציה יוביל ליעילות טרנספקציה גבוהה יותר עבור התרבית, יש להוסיף את תרחיף התאים ותערובת ה-DNA למבחנת electroporation. לאחר מכן, מקם את המבחנה במכשיר ה-electro. עבור נוירונים ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של עכברים, הגדר את תוכנית ה-nucleo effector ל-oh 0 0 5; תוך עבודה מהירה, הוסף 500 µL של מצע זריעה שחומם מראש והגיע לשיווי המשקל למבחנה והעבר את תמיסת התאים למבחנת microfuge חדשה בנפח 1.5 mL.

הוסיפו מספיק מצע זריעה כדי להביא את הנפח של כל טרנספקציה ל-1 ml. לאחר ספירת התאים, זרעו 3-5 × 10³ תאים לסמ"ר עבור תרביות צעירות, או 5-10 × 10³ תאים לסמ"ר עבור תרביות לטווח ארוך; בדרך כלל משתמשים ב-5 × 10⁵ או 1 × 10⁶ תאים לכל טרנספקציה להכנת תרביות לטווח קצר.

שעה לאחר הזריעה, הצפו את צלחות התרבית בנפח 35 מילימטר בשני מיליליטר של מצע ללא סרום, חמים ומאוזן עם פחמן דו-חמצני. תאי הדמיה מביאים לתוכן סרום נמוך מאוד, פחות מ-0.5%. תרביות לטווח קצר אינן דורשות גידול עם שכבת תאי תמיכה גליאליים (glial feeder layer) ואינן דורשות הזנה חוזרת. להכנת תרביות לטווח ארוך, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת תנאי גליאה (glial condition) למצע ללא סרום.

הסר כיסוי זכוכית (GL) המכיל שלוש נקודות של וזלין פראפיני והפוך אותו מעל החור בקוטר 15 מילימטר במנתחת 35. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד נוסף של מצע כדי להזין את התרביות לטווח ארוך. החלף שליש מהמצע נטול הסרום מדי יומיים עד שלושה ימים.

לאחר חמישה עד שבעה ימים בתרבית, מוסיפים cytosine Arab IDE או aee עד לריכוז סופי של 5 µM כדי למנוע פרליפרציה גליאלית. התמונות הזוגיות הבאות של נוירונים היפוקמפליים חיים מייצגים מציגות הן תמונת ניגוד הפרעה דיפרנציאלית (DIC) והן מיקרוגרף פלואורסצנטי תואם. כל אחד מהתאים הללו עבר טרנספקציה עם EGFP, tubulin ו-DS red two בוקטורים של PA.

במהלך השלב הראשון, נוירונים יתחברו תחילה ובמהלך של יום בערך, יוציאו למלופודיה (lamellipodia) דמויי יריעות ופילופודיה (filopodia) דמויי אצבעות מסביב להיקף גוף התא. במהלך השלב השני, הבליטות הראשוניות יתמיינו למספרה של נוריטים הנובעים מגוף התא, אשר בדרך כלל יישארו באורך של כ-30 עד 50 microns. במהלך השלב השלישי, באופן סטוכסטי, אחד הנוריטים יתחיל להתארך במהירות כדי להפוך לאקסון.

הנויריטים האחרים נשארים קצרים ומכונים בליטות מינוריות. רוב הנוירונים ההיפוקמפליים והקורטיקליים הגיעו לשלב השלישי תוך יומיים עד שלושה ימים בתרבית. במהלך שלב ארבע, המתרחש במהלך השבוע או השבועיים הבאים, הבליטות המינוריות מעбеות, מתארכות ומתפצלות כדי להפוך לדנדריטים; כאן הם מוצגים בירוק. במקביל, האקסון הופך לדק יותר ככל שהוא ממשיך לגדול ולהתפצל עד לשבועיים עד שלושה שבועות.

בתרבית, דנדריטים מבדילים את עצמם על ידי יצירת קוצים דנדריטיים, בליטות קטנות לאורך הדנדריטים. נוירונים בשלב חמישי יגלו שונות בצורה ובגודל, אך רובם אמורים לעבור את סדרת שלבי ההתפתחות הזו. נוירונים שעברו טרנספקציה עשויים שלא להתקדם בשלבים אלו אם ביטוי יתר של חלבונים משבש את התפתחות הנוירונים.

בנוסף, ייתכן שנוירונים לא יתקדמו דרך כל שלבי ההתפתחות. אם לוחות כיסוי הזכוכית אינם מנוקים כראוי או אם הפוליליזין אינו נצמד כראוי, גליות עשויות גם הן להתרבות באופן נרחב, במיוחד אם לא נעשה שימוש ב-C. זוהי תמונת ניגודיות פאזה (phase contrast) של תרבית בת שבועיים, שבה הגליות השתלטו על התרבית בתרביות ארוכות טווח.

החלפת המצע בתדירות גבוהה מדי או נמוכה מדי עלולה לפגוע בחיוניותם של הנוירונים. זוהי תמונת ניגודיות פאזה של תרבית שבה רוב הנוירונים מתו, ולנוירונים הנותרים יש גופי תא מכווצים ובליטות דמויות חרוזים (beaded processes). להשוואה, זוהי תמונת ניגודיות פאזה של נוירוני היפוקמפוס בריאים לאחר שבועיים בתרבית. שימו לב לגופי התא הגדולים יותר ולהיעדר החרוזים בבליטות.

בשלב זה, תהליכים דנדריטיים התעבו וקיימת רשת עדינה ונרחבת של תהליכים אקסונליים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע חיתוך של עוברים, קורטקס ודיסקציה, טרנספקציה וזריעה של שגרייה שלמה של עוברים תוך שעתיים, במידה שהתהליך מבוצע כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שנוירונים מההיפוקמפוס ומהקורטקס רגישים מאוד לשיבוש מכני.

כמו כן, חשוב לשמור על התמיסות קרות ככל האפשר במהלך בידוד הנוירונים כדי לשמור על פעילות מטבולית נמוכה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון דימוי תאים חיים (live cell imaging) והקלטה פיזיולוגית של הפעילות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האופן שבו חלבוני היתוך פלואורסצנטיים רלוונטיים מופרשים לאזורים שונים בנוירון, אם לוקליזציית החלבון קשורה לשינויים בפעילות הסינפטית, או כיצד תפקודי חלבונים אלו מושפעים מטיפולים פרמקולוגיים שונים.