ביטוי גנים באמצעות אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות פרוסות היפוקמפוס של עכברים

התחל עם פרוסת היפוקמפוס ממוח עכבר שתורבת על תוספת תרבית בצלחת.

חותכים את התוספת המכילה את הפרוסה ומאבטחים אותה בתא אלקטרופורציה תחת מיקרוסקופ.

חדרו את החדר עם מאגר המכיל חוסם תעלות נתרן מגודר מתח כדי לעכב עירור יתר ולמנוע רעילות תאית.

מקם פיפטה המכילה פלסמידים עם הגן המעניין ליד הפרוסה.

שמרו על לחץ חיובי כדי למנוע סתימת פיפטה תוך התקרבות לנוירון מטרה בהיפוקמפוס עד שנוצרת גומת קרום.

עבור ללחץ שלילי כדי ליצור חותם עם הממברנה.

לסירוגין בין לחץ חיובי ושלילי כדי למזער את הנזק לתאים.

החל דופק אלקטרופורציה כדי לחדור את הממברנה באופן חולף, מה שמקל על כניסת פלסמיד.

משוך את הפיפטה תוך שמירה על לחץ חיובי, וחזור על אלקטרופורציה עבור נוירוני מטרה שכנים.

העבירו את הפרוסה החשמלית לתוספת טרייה ודגרו עליה כדי לאפשר ביטוי של הגן המעניין.

כדי להכין תרביות פרוסות לאלקטרופורציה, העבירו את תוספות התרבות המעניינות לצלחות פטרי בודדות של שלושה סנטימטרים עמוסות ב-900 מיקרוליטר של מדיום תרבית, והניחו את התרביות בחממת פחמן דו חמצני על השולחן. לאחר מכן, תוספות תרבית טרייה לפני הדגירה עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית פרוסות לכל תוספת בצלחת פטרי של 3.5 סנטימטר למשך 30 דקות לפחות, ועיקרו את קווי אסדת האלקטרופורציה עם 10% אקונומיקה למשך חמש דקות.

בתום הזילוף, שטפו את הקווים במים המיוננים למשך 30 דקות לפחות לפני החדרה עם aCSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 טטרודוטוקסין מילי-מולרי. הגדר את דופק האלקטרופורטור למשרעת של מינוס חמישה וולט, דופק מרובע, רכבת של 500 אלפיות השנייה, תדר של 50 הרץ ורוחב דופק של 500 מיקרו-שניות. מלאו פיפטה מזכוכית בחמישה מיקרוליטרים של תמיסה פנימית המכילה פלסמיד, והחליקו בעדינות והקישו על הקצה מספר פעמים כדי להסיר בועות כלואות.

השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהקצה אינו פגום, והצמד היטב את קצה הפיפטה לאלקטרודה. כאשר הקצה יוצר מגע עם ה-aCSF, רשום את קריאת התנגדות הפיפטה של האלקטרופורטור. כדי לבודד תרבית פרוסה, חותכים את קרום הכנסת התרבות עם להב חד, והשתמש במלקחיים בזווית חדה כדי להעביר בזהירות את תרבית הפרוסות לתא האלקטרופורציה.

ואז תקן את מיקום התרבות עם עוגן פרוסה. לצורך אלקטרופורציה של התאים המעניינים, הפעל לחץ חיובי על הפיפטה דרך הפה, והשתמש בפקדי הכפתור התלת מימדיים כדי לתמרן את קצה הפיפטה קרוב לפני השטח של תרבית הפרוסות. בצפייה בתרבית במיקרוסקופ, התקרב לתא המטרה עם הקצה, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על פני התא.

עם הדמיה של הגומה, הפעל במהירות לחץ שלילי קל דרך הפה כך שייווצר אטימה רופפת בין קצה הפיפטה לקרום הפלזמה. הממברנה תיכנס מעט לפיפטה. יש להבחין בעלייה של פי 2.5 בערך בהתנגדות הראשונית של הפיפטה, כפי שמצוין על ידי עלייה בטון מהרמקולים.

הפעל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שהגומה תשתנה. לאחר מכן השלם מיד לפחות שני מחזורי לחץ נוספים כפי שהודגם זה עתה ללא הפסקה. לאחר דופק הלחץ האחרון, החזק את הלחץ השלילי למשך שנייה אחת.

כאשר הצליל מהרמקולים מגיע לקודקוד יציב בגובה הצליל, השתמש בדוושת הרגל כדי לדופק במהירות את האלקטרופורטור. לאחר האלקטרופורציה, החזירו בעדינות את הפיפטה כ-100 מיקרון מהתא מבלי להפעיל לחץ, והפעילו שוב לחץ חיובי, וודאו שההתנגדות דומה לקריאת קו הבסיס לפני שמתקרבים לתא הבא. לאחר שכל התאים המעניינים עברו אלקטרופורציה, העבירו את תרבית הפרוסות לאחת מתוספות התרבית הטריות המוכנות, והניחו את התוספת בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים.