Name: Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-23T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: למדו לזהות ביטוי שטחי של קולטנים כימוסנסוריים בתאי HEK293T באמצעות צביעת תאים חיים. פרוטוקול זה מדגים שימוש בנוגדנים ראשוניים ומשניים לזיהוי מיקום הקולטנים במיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי Matsunami מעבדה קריאה ביקורתית של כתב היד הזה.

1. נוהל: ההליך מורכב משלושה חלקים הושלמה לאורך זמן כולל של 3 ימים: העברת תאים, transfection ו immunocytochemistry, צעד אחד ביצע ליום. העברת transfection של תאים במהלך היומיים הראשונים חייב להתבצע בתנאים סטריליים בחדר זרימה למינרית. יום 1: העברה של תאים HEK293T עבור assay ביטוי על פני השטח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת בינוני (M10): מערבבים מדיום חיוני מינימום בתוספת 10% (לפי נפח) בסרום שור העובר במצב סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים confluency הרצוי בצלחת תרבות 100mm, תלוי במספר צלחות נדרש להגדיר. חשוב לקבוע את החלק היחסי של התאים יועברו כדי למנוע תאים מגודל או דליל: למשל, מתוך צלחת 100% ומחוברות 100 מ"מ, ניתן להעביר כ -3% לצלחת 35 מ"מ לקבל כ -30% confluency ב האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני העברת תאים, תא זרימה למינרית סטרילי, מעיל 22 X 22 מ"מ זכוכית עם מכסה מחליק סטרילי פולי D ליזין (1 מ"ג / מ"ל) ומקום אחד לכל צלחת 35 מ"מ בתא תרבות, הצד המצופה כלפי מעלה עבור תאים ציפוי (איור 1 ). אפשר פתרון להתייבש במשך 5 - 10 דקות. במהלך ההפסקה הזו, מקור UV בחדר למינרית עשוי להיות מופעל כדי לעקר את תלושי לכסות, אם תרצה בכך. פולי D ליזין מסייעת לתאי Heterologous להיצמד מחליק המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעביר תאים, לשאוב את המדיה הקיימים בצלחת 100mm, לשטוף היטב על ידי הוספת 8 מ"ל סטרילי PBS, לשאוב PBS ו trypsinize התאים באמצעות 3 mL 0.05% טריפסין-EDTA, כאשר תאים להתנתק המנה, לחסום תגובה אנזימטית נוספת על ידי הוספת 5 מ"ל M10. Triturate התאים והעברת נפח הדרושים צינור חרוטי סטרילית; צנטריפוגות ב 200 גרם במשך 5 דקות עד גלולה התאים. לשאוב את supernatant המכילה טריפסין-EDTA, עוזב את גלולה של תאים שלמים. כדי להעביר את התאים 35 מנות מ"מ, להוסיף 1 מ"ל M10 עבור כל מאכל triturate לנתק את התאים. הוסף 1 מ"ל של תאים resuspended על כל מנה. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Coat 22 X 22 מ"מ זכוכית coverslips עם פולי D ליזין ומקום צד אחד מצופה בתוך כל מנה 35 מ"מ. </li></ol> יום 2: transfection של תאים HEK293T. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18-24 שעות לאחר העברת התאים מוכנים transfection של הקולטן להיות assayed. השתמש הקולטן RTP1S משובטים של יונקים ביטוי וקטור PCI, מוכן מתרבויות חיידקי באמצעות Qiagen Miniprep פרוטוקול ערכת הבאים תיאר לפני 4. השתמש קולטנים הנמצאים N מתויג סופני עם 20 חומצה אמינו ארוך rhodopsin epitope כדי להקל immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1000ng של קולטן לבנות, 250 ננוגרם של RTP1S לבנות 50 ng של חלבון פלואורסצנטי ירוק כל transfection. בצע transfection באמצעות Lipofectamine 2000, לפי הוראות היצרנים. </li></ol> יום 3: Immunocytochemistry לחזות פני התא קולטנים מוכתם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, להכין מכתים ושטיפת פתרונות מגניב להם 4 ° C. מכתים בינוני: בינוני Essential Minimum, 45 מ"ל, סרום שור עוברית, 5 מ"ל; HEPES (1M), 500 μL (הריכוז הסופי 10mm); אזיד הנתרן (1.5M), 500 (ריכוז סופי 15mm) μL. לשטוף פתרון: HBSS, 500 מ"ל; HEPES (1M), 5 מ"ל (ריכוז 10mm הסופי); אזיד הנתרן (1.5M), 5 מ"ל (ריכוז סופי 15mm). שני הפתרונות עשוי להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר. הכינו פתרונות נוגדנים על ידי דילול נוגדנים הנדרשים לקפל בינוני 100 מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל immunochemistry עבור מכתים משטח קולטנים odorant על transfection 24 שעות הודעה. כדי לבצע מכתים תא חי, להגדיר את הניסוי חייב להיות מקורר 4 ° C: למלא גדול שהכיל קרח וללטף את פני השטח של קרח כדי לעשות את זה כמו גם ככל האפשר, במקום המגש על הקרח לרסס אותו עם 70% אתנול. חותכים פיסת parafilm (קטן יותר מאשר אורך המגש) ו להטביע אותו על מגש אתנול מרוסס, על מנת לקבל משטח חלק. העברת את מכסה זכוכית תלושי המכיל תאים transfected על parafilm, אחד בכל פעם, לצד התא למעלה, באמצעות פינצטה. שכבה לכסות כל להחליק עם פתרון 100 מכתים קר μL העיקרי, extruding בזהירות מפינת בתלוש (איור 2). אחרי כל שכבות תלושי לכסות עם פתרון נוגדן, מכסים את המגש כדי למנוע התייבשות של התמיסה באוויר. ביצוע הדגירה העיקרי 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה העיקרי, במהירות העברת תלושי לכסות את הכלים המקוריים תרבות 35mm, המכיל את התקשורת. לשאוב התקשורת להוסיף 2 פתרון מקורר מ"ל לשטוף בעדינות מהקצה של המנה, כדי למנוע אובדן תאים להחליק את המכסה. לשאוב את הפתרון לשטוף וחזור פעמיים כדי להשלים שלוש שוטף. בסיום לשטוף את השלישי, שלא ישאפו הפתרון לשטוף החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו נוגדנים soluti משניעל בתקשורת מכתים ולהעביר את תלושי לכסות מפתרון לשטוף לשכבה parafilm מודבקת החדש במגש אותו. שוב בעדינות extrude 100 μL של פתרון נוגדנים כדי להחליק כל שכבת כיסוי, מפינת כמו הדגירה הראשי. ביצוע הדגירה המשני למשך 30 - 45 דקות ולהעביר חזרה הפתרון לשטוף את 35 מנות מקוריות מ"מ. שוב לשטוף לכסות את תלושי שלוש פעמים כמתואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לשטוף פתרון מן לשטוף האחרון ולהוסיף 2 paraformaldehyde מ"ל מקורר 1%. תקן תאים פתרון מקורר paraformaldehyde 1%, על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תלושי לכסות על זכוכית מיקרוסקופ נקי שקופיות באמצעות Mowiol מגיב גובר, עם הצד תא למטה בזהירות להוציא את כל בועות האוויר (איור 3). מתייבש באוויר Mowiol פעם, לשטוף תלושי לכסות בעדינות על ידי הוספת מים מזוקקים על פני השטח aspirating מיד. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. Layer כל coverslip עם פתרון 100 מכתים קר μL העיקרי. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. הר coverslips עם הצד התא על מיקרוסקופ זכוכית נקי שקופיות באמצעות ריאגנט הרכבה Mowiol. </li></ol> 2. נציג תוצאות: מכתים תא חי מאפשרת לחזות חלבונים על פני השטח של תאים, על transfection של קולטנים עם המלוות (ב קולטן זה מקרה odorant Olfr62, עם RTP1S הובלת חלבון קולטן) (איור 4). משטח נייד מכתים של קולטנים מאופיין דפוס punctate של הכתמה (איור 4B, הבלעה). מכתים בוצעו בצורה בלתי הולמת עלולה לגרום לרעש גבוה יותר, מה שהקשה על הצופה להבחין מכתים משטח אמיתי מרעש. <img src="/files/ftp_upload/2405/2405fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. Transfection של קולטנים עם המלוות מאפשר הדמיה של חלבונים על פני השטח של תאים באמצעות מכתים תא חי. Transfection של הקולטן odorant Olfr62 לבד (א) ו transfection של Olfr62 עם המלווה RTP1S (B). רמות ה-GFP ביטוי לשמש שליטה transfection (א 'ו - ב').

<ol><li>Buck, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors%3A+a+molecular+basis+for+odor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65, 175-187 (1991).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96, 713-723 (1999).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119, 679-691 (2004).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כל צעד חייב להתבצע בקפידה כדי להבטיח מכתים משטח בולט וייחודי. התהליך מכתים כולו צריך להתבצע קר (על הקרח), וכן את המגש על אשר מחליק לכסות מוטלות חייב להיות מקורר לפני השימוש כדי להבטיח תאים להישאר בחיים. יתר על כן קיבוע נעשה בסוף התהליך מכתים פני השטח. זהו ניגוד חריף עם צביעה פנימית, בו קיבעון מקדים מכתים את permeabilize קרום התא נוגדנים ראשוניים ומשניים. זמן החשיפה של תלושי לכסות האוויר חייב להיות ממוזער כדי למנוע את התאים מפני התייבשות, ולכן שכבות של תלושי לכסות עם פתרונות נוגדני...

<table><tbody><tr><td>זכוכית כיסוי 22 X 22 מ"מ (#1)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>72200-11</td><td></td></tr><tr><td>סרום עוברי של בקר</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>מצע גידול חיוני מינימלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4655</td><td>עם L-glutamate, Earle&amp;rsquo;מלח וביקרבונט</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>פראפורמאלדהיד</td><td>EMS</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) בריכוז 1X </td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>14025</td><td>עם סידום כלוריד ומגנזיום כלוריד</td></tr><tr><td>תמיסת בופר HEPES</td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>מלח תמיסת בופר פוספט (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>ללא סידן ומגנזיום</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>סודיום אזיד</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>SX0299-1</td><td></td></tr><tr><td>צלחת לתרבית רקמה 35 X 10 מ"מ</td><td>Falcon BD</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA </td><td>GIBCO, מבית Life Technologies</td><td>25300</td><td>0.05%</td></tr></tbody></table>

assaying הביטוי surface של קולטנים chemosensory בתוך תאים heterologous

Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

עולם החי של ריחות מוכר על ידי תחושת olfaction. Olfaction בעכברים מתווך על ידי רפרטואר של כ 1200 רצפטורים G חלבון יחד (GPCRs) 1, כי הם הניחו לקשור מולקולות odorant נדיפים המרת אותות תאיים לתוך האות תאיים על ידי צימוד עם חלבון G Gαolf. עקידת odorants אל קולטנים הוא חשב ללכת כלל קומבינטורית, כלומר, אחד odorant עלולים להיקשר לקולטנים מספר אחד יכול להיקשר לקולטן odorants מספר בדרגות 2. אותות ביוכימיים, ומחקרים מחייב ליגנד בוצעו בנוחות החוצה GPCRs ביותר באמצעות תאים Heterologous. אולם השימוש בתאי Heterologous למחקר של קולטנים odorant, היתה מנועה במשך זמן רב מאז על transfection הצליחו לייצא אל פני השטח. סאיטו et al הראו קרום יחיד לעבור הובלת חלבון קולטן (RTP) מלווים המשפחה להראות ביטוי משופרת הנוירונים חושי הריח ולפעול מלווים כדי odorant קולטני תנועה על פני השטח בתאים Heterologous, כאשר שיתוף transfected יחד 3. כדי לבצע את מבחני ביוכימיים עבור הקולטנים באמצעות תאים Heterologous, יש לקבוע תחילה אם הקולטן מראה ביטוי משטח יציב בקו התא. זה יכול להיות assayed ידי overexpressing את הקולטנים עם RTP1S המלווה ואחריו תא חי מכתים את fluorescently התווית תחום תאי או תג בתחום תאיים בלבד. כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.

כאן אנו להדגים פרוטוקול לבצע מכתים תא חי, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות קולטנים odorant על פני השטח של תאים HEK293T בנוחות. בנוסף, הוא עשוי לשמש גם כדי assay לביטוי פני השטח של קולטנים chemosensory אחרים או GPCRs.

Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous

העולם הצבעוני של הריחות מזוהה על ידי חוש הריח. חוש הריח בעכברים מתווך על ידי רפרטואר של כ-1,200 קולטנים המצומדים לחלבון G...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים כיצד ניתן לזהות ביטוי שטח של קולטנים כימוסנסוריים באמצעות צביעת תאים חיים בתאי HEK 2 93 T; זאת על ידי הצמדת תאים תחילה לכיסויים של תאי זכוכית מצופים ב-poly D lycine בתוך צלחות תרבית. השלב השני של הפרוצדורה הוא טרנספקציית DNA לתאי HEK 2 93 T. השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע צביעת תאים חיים באמצעות נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים המצומדים ל-fluoro four.השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קיבוע התאים הצבועים והנחת זכוכית כיסוי. לבסוף, ניתן להפיק תוצאות המראות לוקליזציה של רצפטורים על פני השטח של תאים באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה. שיטה זו מאפשרת לנו לזהות רצפטורים כימיים-חושיים שיוצאו לפני השטח של תאים הטרולוגיים כגון HK 2 93 T. הדגמה חזותית של שיטה זו תציג את שלבי המפתח שיש להקפיד עליהם כדי לשמור על חיות התאים לצורך צביעה עצמית של התאים.אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים למצוא שלבים כגון העברה, טיפול והנחה של זכוכית כיסוי כבעייתיים. עם זאת, לאחר מספר תרגולים, הטכניקה הופכת לקלה. באמצעות פרוטוקול משונה המשתמש בעמודת cgen, טהרו plasma DNA של הרצפטור והרצפטור. הובלת protein RT TP one s ששובט בתוך expression vector PCI תבטיח שעבור immunos staining, הרצפטור המצופה יהיה מסומן בסימון קצבי עם epitope באורך 20 חומצות אמינו כדי להקל על היצמדות התאים.סטרו לזכוכית של כיסויי למינציה (cover slips) עם 1 mg/mL של poli-L-lysine. הניחו את כיסויי הלמינציה בתוך צלחות תרבית תאים של 35 mm, כאשר הצד המצופה פונה כלפי מעלה, לייבוש באוויר בתוך תא זרימה למינרית סטרילי. זרעו תאי HTK-2 93T לצפיפות של כ-30% ב-1 mL של מצע M 10, תוך וידוא ששום בועת אוויר אינה כלואה בין כיסוי הלמינציה לבין צלחת תרבית התאים. דגרו ב-37 °C וב-5% CO2 למשך 18 עד 24 שעות. עבור כל טרנספקציה, הכינו תערובת DNA של 1000 ng של קונסטרקט רצפטור, 250 ng של קונסטרקט RTP1s ו-50 ng של קונסטרקט GFP.בהתאם להוראות היצרן, בצע טרנספקציה לתאים באמצעות lipectomy 2000. הכן תמיסת צביעה על ידי הוספת sodium azide ו-hippies ל-M 10. ניתן לאחסן תמיסה זו בטמפרטורה של 4°C למשך מספר חודשים.בשלב הבא, הכין תמיסת שטיפה המכילה 15 millimolar sodium azide ו-10 millimolar heis. ניתן לשמור את תמיסת השטיפה ב-HBSS קר בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך מספר חודשים. כדי לבצע את הצביעה בקו קר, הכן מגש עם parfum והנח על קרח למשך חמש דקות.העבירו את לוחות כיסוי הזכוכית המכילים תאים שעברו טרנספקציה אל הפרפורמ, כאשר צד התאים פונה כלפי מעלה. הוסיפו בזהירות 100 µL של נוגדן ראשוני קר המדולל בתמיסת צביעה, החל מהפינה של לוח הכיסוי. הדגירו למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. כעת שטפו את התאים בתוך צלחות התרבית המקוריות בקוטר 35 מילימטר על ידי הוספה ושאיבה לסירוגין של תמיסת שטיפה קרה.חזור על הפעולה פעמיים. באופן דומה, דגרי את הנוגדן המשני המשולב SI three למשך 30 דקות. בצע שטיפות שלוש פעמים בצלחות בקוטר 35 מילימטר.לבסוף, קבעו את התאים באמצעות תמיסת 1% Paraform aldehyde מקוררת, תוך הקפדה על מניעת בועות אוויר. הצמידו את לבישובות הכיסוי עם צד התאים כלפי מטה על גשמיות מיקרוסקופ באמצעות mole, ושטפו את פני השטח של לבישובות הכיסוי במים מזוקקים כדי להסיר משקעי מלח.בדרך כלל, בדומה ל-OL FFR 62 ו-RTPs, צביעת קולטנים על פני השטח של התא מאופיינת במראה נקודתי (punctate) של אות פלואורסצנטי מהנוגדן הצמוד. לאחר רכישת מיומנות בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה לצביעת 32 עד 40 זכוכיות כיסוי תוך שעתיים וחצי עד שלוש שעות בלבד. בעת ביצוע פרוצדורה זו עם מספר רב של זכוכיות כיסוי, חשוב להעביר ולהתחיל את דגירת הנוגדנים עבור כל זכוכית כיסוי בנפרד כדי למנוע מהתאים להתייבש.

assaying-surface-expression-chemosensory-receptors-heterologous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: de March, C. A. et. al., ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטני ריח על ידי ריח בשלב האדים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את השיטה לניטור הפעלה בזמן אמת של קולטני ריח בתאי יונקים רקומביננטיים באמצעות מדידת לומינסנציה. קשירת ריח מפעילה הפעלת חלבון G וייצור cAMP, ומפעילה חלבוני גלו-סנסור הפולטים זוהר בעת קשירת המצע, ומספקים מדד כמותי לתגובת הקולטן.

ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטני ריח בתאים רקומביננטיים

הפעלה מתמדת של תוצאות מעכבות G-חלבון בשילוב קולטנים ברגישות של איתות cyclase adenylyl. כדי לזהות את המסלולים מולקולריים החיוניים, גישות nonbiased נחוצות, עם זאת, אסטרטגיה זו מחייבת הפיתוח של assay רגישות cAMP מבוסס תאים ניתן להרחבה. בזאת, אנו מתארים assay רגישות למולקולה קטנה והקרנת siRNA.

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.

ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות

אפיון הפונקציה של קולטני odorant מגישה חלק חיוני בתהליך deorphanization. אנו מתארים שיטה למדוד את ההפעלה של רצפטורים odorant בזמן אמת באמצעות וזמינותו של המחנה.

לחיות תאים מדידה של Odorant קולטן הפעלה באמצעות Assay המחנה בזמן אמת

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

מבחינה פיזיולוגית, odorant רצפטורים מופעלים על ידי מולקולות odorant בשאיפה בשלב אדי. עם זאת, ביותר מערכות in vitro לנצל שלב נוזלי odorant גירוי. כאן, אנו מציגים שיטה המאפשרת ניטור בזמן אמת במבחנה של הפעלת קולטן odorant על odorant גירוי בשלב אדי.

בזמן אמת בחוץ גופית ניטור של הפעלת קולטן Odorant מאת Odorant בהשלב אדי

מאמר זה מציג שיטה לימוד קולטן גלוטמט (GluR) סחר בתרבויות היפוקמאל העיקרי הנתק. באמצעות גישה האכלה נוגדן התווית אנדודוגני או קולטנים מוגזם בשילוב עם גישות פרמקולוגית, שיטה זו מאפשרת זיהוי של מנגנונים מולקולריים הוויסות ביטוי המשטח של GluR על ידי מודולים תהליכי הפנמה או מיחזור.

גישה האכלה נוגדן כדי לחקור את הסחר בקולטן גלוטמט בתרבויות היפוקמא העיקרי ההיפוקיים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה כדי למדוד במהירות ובאופן חצי שוויוני אינטראקציות קולטן ליגנד בטרנס במערכת תאים הטרולוגית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

מדידת אינטראקציות טרנס-תאיות באמצעות צבירת חלבונים במערכת תאים הטרולוגית

המאמר מתאר את השיטות והריאגנטים הדרושים לביצוע הכלאה של תגובת שרשרת RNA, הכלאה פלואורסצנטית באתרה (HCR RNA, WM-FISH) כדי לחשוף תובנות לגבי הרזולוציה המרחבית והתאית של גנים קולטנים כימו-סנסוריים באנטנת היתושים ובמישוש המקסילרי.

תגובת שרשרת הכלאה RNA פלואורסצנטיות מלאה באתרה הכלאה של גנים כימו-סנסוריים בתוספות ריח יתושים

פרוטוקול זה מתאר ביטוי וכימות של תת-יחידות קולטני אצטילכולין נוירונליים באמצעות קו התאים Neuro-2a ביונקים. תגיות פלואורסצנטיות רגישות ל-pH ומיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרים הערכה מדויקת של מיקום הקולטנים בממברנת הפלזמה לעומת אלו המובעים במחלקות תוך-תאי ניטרליות pH, ומסייעים לחקר תנועת nAChR ומודולציה פרמקולוגית.

מיקום של ממברנת הפלזמה וקולטני אצטילכולין ניקוטיניים תוך-תאיים באמצעות הדמיה כמותית בתאי יונקים

למדו לזהות ביטוי שטחי של קולטנים כימוסנסוריים בתאי HEK293T באמצעות צביעת תאים חיים. פרוטוקול זה מדגים שימוש בנוגדנים ראשוניים ומשניים לזיהוי מיקום הקולטנים במיקרוסקופיית פלואורסצנציה.

Assaying הביטוי Surface של קולטנים Chemosensory בתוך תאים Heterologous

גלה סרטונים נוספים