משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

פלישת סרטן והתקדמותו כרוכות בפנוטיפ תאי מודאלי, הנמצא תחת רגולציה מורכבת של גורמי גדילה, ציטוקינים ומרכיבי מטריקס חוץ-תאי בתוך הסביבה המיקרוסקופית של הגידול. חומצה היאלורונית או HA היא מרכיב אחד של המטריקס החוץ-תאי הסטרומלי שידוע כמעודד התקדמות הגידול על ידי הגברת פלישה, גדילה ואנגיוגנזה. אינטראקציה של HA עם הקולטן CD 44 על פני השטח של התא משרה אירועי איתות המקדמים גדילה, הישרדות ונדידה של תאי גידול, ובכך מגבירה את ההפצה המטסטטית. זאת כדי לבחון הידבקות, נדידה וגדילה של תאי סרטן על HA חיצוני.

פוטוליתוגרפיה סטנדרטית משמשת לייצור חותמת אלסטומרית בעלת תבנית מיקרוסקופית, אשר משמשת לאחר מכן ליצירת מערך תבניתי של מולקולאות אמינו-סילאן על מצעי זכוכית. לאחר מכן, מבוצע תהליך כימיה של קרבודיאימיד כדי לחבר באופן קוולנטי HA לאמינו-סילאן בעל תבנית המיקרו. כך נוצרים תבניות מיקרוסקופיות של HA. ניתן להוסיף תרביות של תאי סרטן על תבניות המיקרו של HA, וניתן להדגים את האינטראקציות של תאי הסרטן עם חומצה היאלורונית חיצונית באמצעות מיקרוסקופיה של אור, טכניקות דימוי ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת או מיקרוסקופיה אימונופלוורסצנטית.

השיטה ליצירת משטחי HA בעלי תבניות מיקרו המוצגת במאמר וידאו זה עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון הבהרה נוספת של תפקידה של חומצה היאלורונית אקסוגנית בהתקדמות הסרטן. כדי לייצר חותמת Polymethyl Zane או PDMS בעלת תבנית מיקרו, שתשמש להטבעת משטחי זכוכית עם ha, התחל בהרמת פרוסת סיליקון חדשה באמצעות פינצטה.

לאחר מכן, מעל כיור מעבדה. השתמשו בבקבוק שטיפה כדי לשטוף את הפרוסה ב-ethanol וייבשו אותה באמצעות זרם אוויר. כבו את אורות החדר.

לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את הפרוסה למנפנף (spin coater) באמצעות פיפטת העברה. כסו לפחות 80% משטח הפרוסה ב-SU 2025 negative photo resist. בצעו ציפוי סיבוב (spin coat) למשך 10 שניות במהירות של 600 RPM, ולאחר מכן למשך 30 שניות במהירות של 3000 RPM. העבירו את הפרוסה המצופה ב-photo resist לפלטה חמה ובצעו אפייה רכה (soft bake) בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הסירו אותה מהפלטה החמה והמתינו דקה אחת לקירור.

הניחו מסכה מוכנה מראש עם התבנית הרצויה מעל הוופר המכוסה בפוטורזיסט והקרינו אותו ב-UV למשך 20 שניות. לאחר מכן, העבירו את הוופר לפלטה חמה ובצעו אפייה קשה (hard bake) בטמפרטורה של 110 °C למשך שש דקות.

הדליקו את האורות והוציאו את הפרוסה מהלוח החם. בשלב זה תבניות ברורות צריכות להיות נראות באמצעות פיפטה להעברה. שטפו בזהירות את הפרוסה עם מפתח פוטורזיסט SU eight לאחר שלושה שטיפות עם תמיסת מפתח, ואז שטפו עם אתנול.

אם נותר שארית לבנה כלשהי, חזרו על השטיפה עם תמיסת פיתוח הפוטורזיסט (photoresist developer solution) או פשוט טבלו את הפרוסה (wafer) בתמיסת פיתוח למשך שתי דקות ושטפו שוב באתנול, שטפו במים ויבשו בזרם אוויר בתוך סירה גדולה. ערבבו תמיסת אלסטומר PDMS וחומר מעבד ביחס משקלי של 10 ל-1; עבור הפרוסה המוצגת כאן, 22 גרמים יספיקו. שפכו למבחנה לצנטריפוגה וסובבו במהירות של 900 RPM למשך חמש דקות.

כדי להסיר בועות אוויר, הניחו את פרוסת הסיליקון (wafer) התבניתית בתוך צלחת פטרי בגודל מתאים. שפכו עליה מספיק תמיסת PDMS כדי לכסות את הפרוסה לחלוטין בעובי של כרבע אינץ'. אם קיימות בועות על פני השטח של הפרוסה, הניחו אותה במייבש ואקום עד להסירן.

המתינו לייבוש למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי ליצור חותמת אלסטומרית משלימה. אם ה-PDMS לא התייבש לחלוטין לאחר 12 שעות, הניחו את הפרוסה בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 דקות. הסִירו בזהירות את ה-PDMS מהפרוסה.

לאחר מכן, חתכו את החותמת לגודל הרצוי באמצעות תער. הניחו את החותמת בתוך כלי זכוכית עם ethanol, רצוי בתוך מחזיק פלסטיק, ובצעו סוניקציה למשך 15 דקות. ניתן להשתמש ב-Wafers מספר פעמים כדי ליצור חותמות אלסטומריות חדשות לצורך קיבוע קוולנטי של ha על משטחי זכוכית בכתמים מוגדרים.

התחילו בניקוי של כל הזכוכיות שבהן תעשה שימוש במנקה פלסמה בהתאם להוראות המופיעות בטקסט הנלווה. לאחר ניקוי הזכוכיות, השתמשו בפינצטה כדי להוציא אותן ממנקה הפלסמה. הניחו את הזכוכיות בצלחת פטרי מפלסטיק והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר.

בשלב הבא, הכינו בתוך מבחנה צנטריפוגית מפוליסטירן בנפח 15 מיליליטר את תמיסת האמינו-סילן להחתמה על השקופית, לצורך קישור של HA. הכינו תמיסה טרייה בריכוז 3% volume per volume של amino propyl trimeth oxy cline או A-P-T-M-S בתוך Ethanol בריכוז 95% Volume per volume, לנפח כולל של חמישה מיליליטרים; המתינו חמש דקות לתגובת התמיסה בטמפרטורת החדר.

במהלך תקופה זו, A-P-T-M-S הופך באמצעות הידרוליזה לסיול. לאחר מכן, תוך נגיעה בדפנות בלבד, הניחו את חותמת ה-PDMS כשהתבנית פונה כלפי מעלה על גבי ציר של ספינ-קוטר (spin coater). השתמשו בפיפט העברה כדי לכסות את שטח התבנית ב-A-P-T-M-S.

לאחר מכן, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של שטח הפנים של הבולת באמצעות A-P-T-M-S במהירות של 3,500 RPM למשך 30 שניות. לאחר הסרת בולת ה-PDMS מהספין קוטר, הפכו אותה כך שצד התבנית פונה כלפי מטה, הניחו קצה אחד של בולת ה-PDMS במרכז שליתית הזכוכית ולחצו בעדינות כך שכל הבולת תהיה במגע עם שליתית הזכוכית למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסירו בעדינות את בולת ה-PDMS והניחו לשליתית הזכוכית בעלת תבנית ה-A-P-T-M-S להישאר בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות, שטפו את משטח התבנית באתנול וייבשו באמצעות זרימת אוויר. השתמשו בסוניקציה עבור חותמת ה-PDMS למשך 15 דקות כדי להסיר שאריות A-P-T-M-S. לאחר מכן, הניחו את השקופיות על פלטה חמה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 115 °C כדי לחמם את המשטחים ולהסיר עודפי מים.

שטפו באתנול ויבשו באוויר באמצעות פינצטה. העבירו את השקופית עם התבניות לצלוחית פטרי מזכוכית. השתמשו בפיפטת העברה כדי לכסות לחלוטין את השקופית במסיס polyethylene glycol או תמיסת peg cline שהוכנה טרי, אשר תשמש כאזור לא-דביק המקיף את התבניות.

לאחר דגירה של 45 דקות ב-75 מעלות צלזיוס, שפכו את תמיסת ה-peg saline העודפת. לאחר מכן, בעודכם מחזיקים את השקופית עם פינצטה, שטפו את פני השקיפות המתוחמות בטולואן ולאחר מכן שוב במים, וייבשו באמצעות זרם אוויר. הניחו את השקופיות בקופסת שקופיות מלחיתה.

לאחר מכן, הניחו את הקופסה בתוך קבמינה לבטיחות ביולוגית והפעילו את נורת ה-UV למשך שעה אחת לצורך הקרנה לחיטוי. החל משלב זה, המשיכו בעבודה בתוך הקבמינה לבטיחות ביולוגית. כדי לשמור על סטריליות מחוץ למנדף, הכינו תמיסה מימית סטרילית של HA בריכוז 10 millimolar בנפח של מיליליטר אחד.

One ethyl three three dimethyl amino propyl carbimide או EDC בריכוז 5 millimolar ו-hydroxy CIN aide בריכוז 50 micrograms per milliliter. HA המסומן בفلואורסצאין סטרילי עם EDC הוא סוכן קישור צולב באורך אפס המגיב עם קבוצות הקרבוקסיל של ה-HA כדי ליצור תוואים ביניים תגובתיים לאמינים. כיוון שתווך ביניים זה רגיש להידרוליזה, מוסיפים NHS כדי להגביר את יעילות התגובה של הקרבודימיד.

בשלב הבא, מרח מנות של 200 µL של תמיסת HA סטרילית על הזכוכית עם התבנית עד שהאזור המתובנית יכוסה. סגור את קופסת השקופיות כדי להגן על השקופיות מאור. יש להשאיר את תשתי התבנית תחת המנדף ללא הפרעה למשך 16 עד 24 שעות, בזמן שתמיסת ה-HA מגיבה עם ה-A-P-T-M-S המתובנית במיקרוסקופ ונוצר קשר MI יציב בין תוצר הביניים של ה-HA לאמין הראשוני של ה-A-P-T-M-S.

ביום למחרת, השתמשו בפיפטת טפטוף (APA tear pipette) כדי לשאוב את תמיסת ה-HA. שטפו את השקופיות ב-PBS, ולאחר מכן כסו את הפני השטח ב-1%BSA ב-PBS למשך שעה אחת. כעת פני השטח מוכנים לתרבית תאים.

הניחו את משטחי המיקרו-דפוס (micropattern) בתוך צלחת פטרי סטרילית לצורך גידול על גבי משטחי המיקרו-דפוס של HA. זרעו תרחיפי תאים בודדים של תאי סרטן בריכוזים שבין 0.4 ל-1 כפול 10⁶ תאי סרטן ל-18.75 cm² של שטח זכוכית, ב-1 mL של מצע גידול תאים כדי לכסות את פני השטח של נגליית הזכוכית. הניחו בזהירות את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2. תוך הקפדה שהמצע לא יישפך, היצמדות התאים צפויה להתרחש תוך 24 שעות וניתן להשקיפה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.

ניתן לתחזק משטחי תרביות תאים למשך עד חמישה ימים. בתנאי דגירה סטנדרטיים, יש להחליף את המצע בכל יום שני. ניתן להשקיף על מורפולוגיית התאים ועל צמיחתם באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.

ניתן להחיל לאחר מכן בדיקות תאיות נוספות כדי לנתח תגובות למשטח ה-HA בדוגמה המוצגת כאן. משטח בעל תבנית HA כפי שנראה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ובתמונה. ניתוח עוצמת פלואורסצנציה J מדגים את דה-מובליזציית ה-ha מהתבנית.

משטחי מיקרו-דפוס של HA מאפשרים לחקור אינטראקציות של תאי סרטן עם HA חיצוני. כאן מוצגת היצמדות של תאי סרטן למשטחי מיקרו-דפוס של HA. תאי קרצינומה של המעי הגס והשד נצמדו באופן מועדף לטלאי HA לאחר 24 שעות של תרבית. ניתן להשתמש בדימות ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת כדי לנתח אינטראקציות של תאים מתורבית עם משטחים שבהם מקובע HA.

במיקרוגרף זה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ניתן לראות את האינטראקציה של תאי סרטן המעי הגס עם HA; בצד ימין מוצגת הגדלה גבוהה יותר. כאן מוצגים שוב תאי סרטן השד שגודלו על משטחי HA; שוב, בצד ימין מוצגת הגדלה גבוהה יותר. ניתוח זה מדגים בבירור את נוכחותן של בליטות היצמדות (adhesive protrusions) המגבירות את התפשטותם של תאי הסרטן על דפוסי מיקרו של HA.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי האופן שבו מכינים שירותי דפוסי מיקרו של HA ומיישמים אותם כדי לחקור את תגובת תאי סרטן.