Name: משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: חקור אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית באמצעות משטחים micropatterned. השיטה משלבת פוטוליתוגרפיה וכימיה קרבודיאימיד ליצירת תבניות ברזולוציה גבוהה לניתוח התנהגות תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים השימוש במעבדה ניתוח השטח באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס, במימון כחלק חומרים מדע והנדסה מרכז מחקר באמצעות הקרן הלאומית למדע. LED הוא המתאמן IGERT ו עמית קרן המדע הלאומית בוגר. מחקר זה מומן חלקית על ידי מענק NIH U54CA143868.

1. Photolithography תקן ייצור הבולים micropatterned <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את פרוסות סיליקון חדש עם אתנול יבש עם זרם של אוויר. השתמש מלקחיים לטפל רקיק למנוע מומים פני השטח במהלך התהליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקיק ספין coater ומכסים פני רקיק עם photoresist SU 2025 שלילי. כיסוי לפחות 80% של פרוסות סיליקון עם photoresist. ספין מעיל למשך 10 שניות בכל 600rpm, ואחריו 30 שניות על 3000rpm. בשל רגישות של photoresist, לכבות את האורות בחדר מרגע זה והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת photoresist פרוסות סיליקון מצופה לצלחת חמה "רך לאפות" ב 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר מהצלחת חם ולאפשר 1 דקות להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מסכה מראש מפוברק עם דפוס הרצוי על גבי פרוסות סיליקון photoresist המכוסה סיליקון לחשוף אולטרה סגול (UV), קרינה (350-450 ננומטר) למשך 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פרוסות סיליקון לצלחת חמה "קשה לאפות" ב 110 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות ולהסיר רקיק מהצלחת חם. דפוסים ברורים צריכים להיות גלויים בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות פרוסות סיליקון עם מפתח 8-SU photoresist. לאחר 3 שטיפות עם פתרון מפתח, לשטוף עם אתנול. אם שאריות לבן קיים, לחזור לשטוף עם פתרון מפתח photoresist, או פשוט להטביע את פרוסות בפתרון הפיתוח במשך 2 דקות ולהמשיך שוב עם אתנול לשטוף. לשטוף עם מים ואוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים polydimethylsiloxane (PDMS) פתרון אלסטומר סוכן ריפוי ביחס 10:01 משקל. צנטריפוגה ב 900rpm במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בדוגמת רקיק בצלחת פטרי ויוצקים PDMS על פרוסות סיליקון. אם יש בועות בהווה, מקום desicator ואקום של כמה דקות עד בועות להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure הלילה בטמפרטורת החדר (RT) כדי ליצור חותמת אלסטומרי משלימים. אם PDMS לא נרפא לגמרי בתנור לאחר 12 שעות, במקום ב 60 ° C במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות מן PDMS פרוסות סיליקון. השתמש קצה סכין גילוח לחתוך בול לגודל הרצוי. Sonicate באתנול במשך 15 דקות. ופלים יכול להיות מנוצל מספר פעמים כדי ליצור אלסטומרי בולים חדשים. </li></ol> 2. HA Micropatterning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית פלזמה נקי שקופיות במשך 5 דקות. מקם את כל השקופיות לתוך תא ואקום במשך 5 דקות. ואז לאפשר זרימה נמוכה של חמצן להיכנס לתא. הפעל מנקה פלזמה על במשך 5 דקות. הסר מנקה פלזמה מקום בצלחת פטרי באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ניקוי פלזמה, sonicate בולים PDMS באתנול במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טרי 3% v / v פתרון של 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) באתנול 95% v / v בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. אפשר להגיב במשך 5 דקות על RT כדי ליצור silanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דפוס חותמת PDMS-up על ספין coater צ'אק כיסוי בדוגמת משטח עם פתרון APTMS. Spincoat ב 3500rpm למשך 30 שניות. אל תיגע במשטח בול, רק את הצדדים של החותמת PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת APTMS פתרון הפלזמה לנקות משטחי זכוכית: חותמת להגדיר פונה כלפי מטה בקצה אחד של הצד בדוגמת בעדינות להחליק לחיצה PDMS אז זה לגמרי במגע עם משטח זכוכית דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PDMS חותמת בעדינות, ולאפשר שקופיות זכוכית בדוגמת כדי לדגור ב RT במשך 30 דקות. יש לשטוף את המשטחים עם הדפס של אתנול באוויר יבש. Sonicate PDMS חותמת במשך 15 דקות כדי להסיר APTMS עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים משטחים בתנור או על פלטה חמה למשך שעה 1 ב 115 ° C. לשטוף עם אתנול יבש עם האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פוליאתילן גליקול טרי (PEG), silane פתרון של 20% v / v 2 - [methoxy (polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane ב טולואן. זה ישמש כאזור ללא דבק סביב דפוסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת שקופיות בדוגמת זכוכית לצלחת זכוכית פטרי דגירה בפתרון PEG-silane במשך 45 דקות ב 75 מעלות צלזיוס על פלטה חשמלית. לשטוף עם טולואן, מים, אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר שעה 1 באמצעות קרינה UV קוטל חידקים בארון בטיחות ביולוגית. המשך בארון בטיחות ביולוגית מנקודה זו קדימה כדי לשמור על סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן HA מימית פתרון סטרילי. 10mm של 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 5mm של N-hydroxysuccinimide 50μg / mL והעמסת שכותרתו HA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל פתרון HA על מצעים בדוגמת זכוכית בתנאים סטריליים ומוגן מפני אור. Patterned מצעים צריך להיות באין מפריע במשך 16-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון HA, לשטוף עם פוספט בופר סליין (PBS), וכן לכסות את פני השטח עם 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS שעה 1. פני השטח מוכן כעת תרבית תאים. </li></ol> 3. Cell התרבות על HA micropatterned משטחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרחב מד"א-MB-231 סרטן שד אנושיים לתאים תאים סרטן המעי הגס LS174T, על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא זרע בודד השעיות של תאים סרטניים עם צפיפות בין 0.4 ו 1x10 2 ס"מ על משטח זכוכית HA משותקת משטחים. דגירה באינקובטור humidified (37 ° C) באטמוספירה נשמר עם 5% CO 2. הידבקות התא אמור להתרחש בתוך 24 שעות ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות משטחים Cell יכול להישמר עד 5 ימים בתנאים סטנדרטיים חממה. שינוי התקשורת בכל יום אחר. מורפולוגיה של תאים והתפתחות ניתן לצפות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה. מבחני הסלולר נוסף ניתן ליישם לנתח תגובות על פני השטח HA. </li></ol> 4. נציג תוצאות: הכימיה carbodiimide משמש קוולנטית לשתק HA לשקופיות APTMS בדוגמת זכוכית מוצג באיור 1 א. EDC הוא סוכן באורך אפס crosslinking כי מגיב עם קבוצות carboxyl HA כדי ליצור אמין-reactive ביניים. כפי ביניים זה רגישים הידרוליזה, NHS נוסף כדי להגביר את יעילות התגובה carbodiimide. כפתרון HA אינטראקציה עם APTMS micropatterns, קשר יציב בין HA אמיד צורות ביניים אמין העיקרי של ATPMS. דוגמה השטח בדוגמת HA דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתוח הקרינה ImageJ להדגים את עוצמת immobilization בדוגמת של HA מוצגים (איור 1 ב-C). Micropatterned משטחים HA לאפשר את לימוד אינטראקציות תאים סרטניים עם HA expgenous. שניהם מד"א-MB-231 שד אנושי LS174t האדם סרטן המעי הגס שורות תאים מעדיפים לדבוק האזורים HA micropatterned (איור 2). הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ניתן להשתמש כדי לנתח את האינטראקציות של תאים בתרבית עם משטחים HA משותקת (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1 HA micropatterned משטחים (א) סכמטי המתאר את התפתחות משטחים HA פונקציונלי, (ב) תמונה של הקרינה והעמסת (ירוק), שכותרתו משטח HA micropatterned. (ג) הפצה 3D המפה פיקסל באמצעות תוכנת ImageJ הוכחת דפוסי HA בדידים. בר סולם = 100μm. השתנה מ - 9 באישור Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> 2. איור סרטן תא הדבקה על משטחים HA micropatterned. שניהם המעי הגס (א) ו השד (ב) דבק קרצינומה מועדף על תיקוני HA עם 24 שעות של תרבות. השתנה מ - 9 באישור Elsevier. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> 3. איור סרטן תאים אינטראקציה עם HA. (א) סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של תאים סרטניים במעי הגס (א) בתרבית על משטחים HA שמוצג בהגדלה נמוכה (משמאל) הגדלה גבוהה (מימין; של ריבועים על שמאל) של תאים סרטניים בשד (ב) בתרבית על משטחים HA הראו ב בהגדלה נמוכה (משמאל) הגדלה גבוהה (מימין; הריבועים בצד שמאל).

<ol><li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li>
<li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+%28CD168%29+Form+Complexes+with+ERK1%2C2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li>
<li>Götte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparanase%2C+Hyaluronan%2C+and+CD44+in+Cancers%3A+A+Breast+Carcinoma+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li>
<li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li>
<li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Gazz.+Chim.+Ital%22%5BJournal%5D)">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li>
<li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomaterials+Science%2C+Polymer+Edition%22%5BJournal%5D)">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li>
<li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li>
<li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+%28HA%29+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li>
<li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li>
<li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li>
<li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease%3A+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li>
</ol>

דמות סכמטית וידאו לשכפל באישור; זכויות יוצרים Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co KGaA. דיקינסון LE, Kusuma S, Gerecht ס שחזור נישה התמיינות של תאים עובריים באמצעות biomaterials. Macromol. Biosci. 2010: אוקטובר 21. [Epub לפני ההדפסה].

השיטה מאפשרת micropatterning HA הציג את המחקר של אינטראקציות עם התא HA אקסוגניים. HA ידוע לשחק תפקיד מפתח בהתפתחות סרטן 1 אך היו מחקרים מוגבל לחקור את האינטראקציה של תאים סרטניים על שני משטחים HA ממדי בדוגמת. מחקר לשליטה על micropatterns אקסוגניים HA מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של הידבקות בסרטן התא, צמיחה, הגירה עשויה להבהיר יסודות נוספים של סרטן. על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact,...

<table><tbody><tr><td>פוטורזיסט SU-2025</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>מפתח SU-8</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-אמינופרופילטרימתוקסיסילאן (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-אתיל-3-(3-דימתילאמינופרופיל) קרבודיאימיד</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-הידרוקסיסוקסינימיד (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>חומצה היאלורונית מסומנת בפלואורסצאין (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>יש לשחזר עם 10 מ"ל של מים מזוקקים (DI water) </td></tr><tr><td>תאי קרצינומה של השדי MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>תאי קרצינומה של המעי הגס LS174t</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

הפלישה סרטן התקדמות כרוכה פנוטיפ התא ניעתי, אשר לפי תקנה מורכבים על ידי גורמי גדילה / ציטוקינים תאי המטריצה ​​(ECM) רכיבים בתוך microenvironment את הגידול. חומצה היאלורונית (HA) הוא אחד סטרומה מרכיב ECM כי ידוע כדי להקל על התקדמות הגידול בעקבות הפלישה צמיחה ושיפור, ו אנגיוגנזה 1. אינטראקציה של HA עם שטח פני התא שלה CD44 לקולטן גורם איתות אירועים לקדם גדילת תאים והישרדות הגידול, והגירה, ובכך להגדיל את התפשטות גרורתית 2-3. HA הוא glycosaminoglycan anionic, nonsulfated מורכב יחידות חוזרות של חומצת D-glucuronic ו DN-acetylglucosamine. בשל נוכחותם של קבוצות הידרוקסיל על carboxyl ו disaccharide יחידות חוזרות, יליד HA הוא הידרופילי, במידה רבה, מקובל כי שינויים כימיים להציג קבוצות סולפט עבור immobilization photoreative 4-5. מחקרים קודמים הנוגעים immobilizations של HA על גבי משטחים לנצל את התנהגות bioresistant של HA ו - נגזרת sulfated שלה לשלוט הידבקות התא על גבי משטחים 6-7. בשנת הידבקות מחקרים אלה תא מעדיפים מתרחשת על אי - HA אזורים בדוגמת. כדי לנתח אינטראקציות הסלולר עם HA אקסוגניים, פיתחנו משטחים פונקציונליות בדוגמת המאפשרים מחקר לשליטה ברזולוציה גבוהה ויזואליזציה של תאים סרטניים אינטראקציות עם HA. ניצלנו הדפסה microcontact (UCP) כדי להגדיר אזורים בדוגמת דיסקרטית של HA על משטחי זכוכית. &quot;קשירה&quot; הגישה כי חל כימיה carbodiimide קישור לשתק HA היה בשימוש 8. משטחי זכוכית היו microcontact מודפס עם aminosilane והגיב עם פתרון HA של יחסי אופטימיזציה של EDC ו NHS לאפשר immobilization HA במערכים בדוגמת. שילוב כימיה carbodiimide עם MCP אפשרה immobilization של HA לאזורים מוגדרים, יצירת משטחים מתאים ביישומים במבחנה. גם סרטן המעי הגס תאים תאים סרטן השד תיקשר במשתמע עם משטחים micropatterned HA. תא הידבקות בסרטן התרחש בתוך 24 שעות עם ריבוי על ידי 48 שעות. שימוש HA משטחים micropatterned, הראינו כי התא הידבקות בסרטן מתרחשת דרך הקולטן CD44 HA. יתר על כן, HA משטחים בדוגמת היו תואם מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) ואיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים סרטניים בליטות דבק והפצת על דפוסי HA לנתח תאים סרטניים על תנועתיות HA אקסוגניים.

שיטה חדשנית המאפשרת ברזולוציה גבוהה ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית אקסוגניים (HA) מתואר. משטחים בדוגמת מיוצרים על ידי שילוב של כימיה carbodiimide והדפסה microcontact.

פלישת סרטן והתקדמותו כרוכות בפנוטיפ של תא נייד, הנמצא תחת בקרה מורכבת של גורמי גדילה/ציטוקינים ומטריצה חוץ-תאית...

פלישת סרטן והתקדמותו כרוכות בפנוטיפ תאי מודאלי, הנמצא תחת רגולציה מורכבת של גורמי גדילה, ציטוקינים ומרכיבי מטריקס חוץ-תאי בתוך הסביבה המיקרוסקופית של הגידול. חומצה היאלורונית או HA היא מרכיב אחד של המטריקס החוץ-תאי הסטרומלי שידוע כמעודד התקדמות הגידול על ידי הגברת פלישה, גדילה ואנגיוגנזה. אינטראקציה של HA עם הקולטן CD 44 על פני השטח של התא משרה אירועי איתות המקדמים גדילה, הישרדות ונדידה של תאי גידול, ובכך מגבירה את ההפצה המטסטטית. זאת כדי לבחון הידבקות, נדידה וגדילה של תאי סרטן על HA חיצוני.פוטוליתוגרפיה סטנדרטית משמשת לייצור חותמת אלסטומרית בעלת תבנית מיקרוסקופית, אשר משמשת לאחר מכן ליצירת מערך תבניתי של מולקולאות אמינו-סילאן על מצעי זכוכית. לאחר מכן, מבוצע תהליך כימיה של קרבודיאימיד כדי לחבר באופן קוולנטי HA לאמינו-סילאן בעל תבנית המיקרו. כך נוצרים תבניות מיקרוסקופיות של HA. ניתן להוסיף תרביות של תאי סרטן על תבניות המיקרו של HA, וניתן להדגים את האינטראקציות של תאי הסרטן עם חומצה היאלורונית חיצונית באמצעות מיקרוסקופיה של אור, טכניקות דימוי ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת או מיקרוסקופיה אימונופלוורסצנטית.השיטה ליצירת משטחי HA בעלי תבניות מיקרו המוצגת במאמר וידאו זה עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום חקר הסרטן, כגון הבהרה נוספת של תפקידה של חומצה היאלורונית אקסוגנית בהתקדמות הסרטן. כדי לייצר חותמת Polymethyl Zane או PDMS בעלת תבנית מיקרו, שתשמש להטבעת משטחי זכוכית עם ha, התחל בהרמת פרוסת סיליקון חדשה באמצעות פינצטה.לאחר מכן, מעל כיור מעבדה. השתמשו בבקבוק שטיפה כדי לשטוף את הפרוסה ב-ethanol וייבשו אותה באמצעות זרם אוויר. כבו את אורות החדר.לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את הפרוסה למנפנף (spin coater) באמצעות פיפטת העברה. כסו לפחות 80% משטח הפרוסה ב-SU 2025 negative photo resist. בצעו ציפוי סיבוב (spin coat) למשך 10 שניות במהירות של 600 RPM, ולאחר מכן למשך 30 שניות במהירות של 3000 RPM. העבירו את הפרוסה המצופה ב-photo resist לפלטה חמה ובצעו אפייה רכה (soft bake) בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הסירו אותה מהפלטה החמה והמתינו דקה אחת לקירור.הניחו מסכה מוכנה מראש עם התבנית הרצויה מעל הוופר המכוסה בפוטורזיסט והקרינו אותו ב-UV למשך 20 שניות. לאחר מכן, העבירו את הוופר לפלטה חמה ובצעו אפייה קשה (hard bake) בטמפרטורה של 110 °C למשך שש דקות.הדליקו את האורות והוציאו את הפרוסה מהלוח החם. בשלב זה תבניות ברורות צריכות להיות נראות באמצעות פיפטה להעברה. שטפו בזהירות את הפרוסה עם מפתח פוטורזיסט SU eight לאחר שלושה שטיפות עם תמיסת מפתח, ואז שטפו עם אתנול.אם נותר שארית לבנה כלשהי, חזרו על השטיפה עם תמיסת פיתוח הפוטורזיסט (photoresist developer solution) או פשוט טבלו את הפרוסה (wafer) בתמיסת פיתוח למשך שתי דקות ושטפו שוב באתנול, שטפו במים ויבשו בזרם אוויר בתוך סירה גדולה. ערבבו תמיסת אלסטומר PDMS וחומר מעבד ביחס משקלי של 10 ל-1; עבור הפרוסה המוצגת כאן, 22 גרמים יספיקו. שפכו למבחנה לצנטריפוגה וסובבו במהירות של 900 RPM למשך חמש דקות.כדי להסיר בועות אוויר, הניחו את פרוסת הסיליקון (wafer) התבניתית בתוך צלחת פטרי בגודל מתאים. שפכו עליה מספיק תמיסת PDMS כדי לכסות את הפרוסה לחלוטין בעובי של כרבע אינץ'. אם קיימות בועות על פני השטח של הפרוסה, הניחו אותה במייבש ואקום עד להסירן.המתינו לייבוש למשך לילה בטמפרטורת החדר כדי ליצור חותמת אלסטומרית משלימה. אם ה-PDMS לא התייבש לחלוטין לאחר 12 שעות, הניחו את הפרוסה בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך 30 דקות. הסִירו בזהירות את ה-PDMS מהפרוסה.לאחר מכן, חתכו את החותמת לגודל הרצוי באמצעות תער. הניחו את החותמת בתוך כלי זכוכית עם ethanol, רצוי בתוך מחזיק פלסטיק, ובצעו סוניקציה למשך 15 דקות. ניתן להשתמש ב-Wafers מספר פעמים כדי ליצור חותמות אלסטומריות חדשות לצורך קיבוע קוולנטי של ha על משטחי זכוכית בכתמים מוגדרים.התחילו בניקוי של כל הזכוכיות שבהן תעשה שימוש במנקה פלסמה בהתאם להוראות המופיעות בטקסט הנלווה. לאחר ניקוי הזכוכיות, השתמשו בפינצטה כדי להוציא אותן ממנקה הפלסמה. הניחו את הזכוכיות בצלחת פטרי מפלסטיק והניחו אותן בצד לשימוש מאוחר יותר.בשלב הבא, הכינו בתוך מבחנה צנטריפוגית מפוליסטירן בנפח 15 מיליליטר את תמיסת האמינו-סילן להחתמה על השקופית, לצורך קישור של HA. הכינו תמיסה טרייה בריכוז 3% volume per volume של amino propyl trimeth oxy cline או A-P-T-M-S בתוך Ethanol בריכוז 95% Volume per volume, לנפח כולל של חמישה מיליליטרים; המתינו חמש דקות לתגובת התמיסה בטמפרטורת החדר.במהלך תקופה זו, A-P-T-M-S הופך באמצעות הידרוליזה לסיול. לאחר מכן, תוך נגיעה בדפנות בלבד, הניחו את חותמת ה-PDMS כשהתבנית פונה כלפי מעלה על גבי ציר של ספינ-קוטר (spin coater). השתמשו בפיפט העברה כדי לכסות את שטח התבנית ב-A-P-T-M-S.לאחר מכן, בצעו ציפוי ספין (spin coat) של שטח הפנים של הבולת באמצעות A-P-T-M-S במהירות של 3,500 RPM למשך 30 שניות. לאחר הסרת בולת ה-PDMS מהספין קוטר, הפכו אותה כך שצד התבנית פונה כלפי מטה, הניחו קצה אחד של בולת ה-PDMS במרכז שליתית הזכוכית ולחצו בעדינות כך שכל הבולת תהיה במגע עם שליתית הזכוכית למשך דקה אחת. לאחר מכן, הסירו בעדינות את בולת ה-PDMS והניחו לשליתית הזכוכית בעלת תבנית ה-A-P-T-M-S להישאר בטמפרטורת החדר.לאחר 30 דקות, שטפו את משטח התבנית באתנול וייבשו באמצעות זרימת אוויר. השתמשו בסוניקציה עבור חותמת ה-PDMS למשך 15 דקות כדי להסיר שאריות A-P-T-M-S. לאחר מכן, הניחו את השקופיות על פלטה חמה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 115 °C כדי לחמם את המשטחים ולהסיר עודפי מים.שטפו באתנול ויבשו באוויר באמצעות פינצטה. העבירו את השקופית עם התבניות לצלוחית פטרי מזכוכית. השתמשו בפיפטת העברה כדי לכסות לחלוטין את השקופית במסיס polyethylene glycol או תמיסת peg cline שהוכנה טרי, אשר תשמש כאזור לא-דביק המקיף את התבניות.לאחר דגירה של 45 דקות ב-75 מעלות צלזיוס, שפכו את תמיסת ה-peg saline העודפת. לאחר מכן, בעודכם מחזיקים את השקופית עם פינצטה, שטפו את פני השקיפות המתוחמות בטולואן ולאחר מכן שוב במים, וייבשו באמצעות זרם אוויר. הניחו את השקופיות בקופסת שקופיות מלחיתה.לאחר מכן, הניחו את הקופסה בתוך קבמינה לבטיחות ביולוגית והפעילו את נורת ה-UV למשך שעה אחת לצורך הקרנה לחיטוי. החל משלב זה, המשיכו בעבודה בתוך הקבמינה לבטיחות ביולוגית. כדי לשמור על סטריליות מחוץ למנדף, הכינו תמיסה מימית סטרילית של HA בריכוז 10 millimolar בנפח של מיליליטר אחד.One ethyl three three dimethyl amino propyl carbimide או EDC בריכוז 5 millimolar ו-hydroxy CIN aide בריכוז 50 micrograms per milliliter. HA המסומן בفلואורסצאין סטרילי עם EDC הוא סוכן קישור צולב באורך אפס המגיב עם קבוצות הקרבוקסיל של ה-HA כדי ליצור תוואים ביניים תגובתיים לאמינים. כיוון שתווך ביניים זה רגיש להידרוליזה, מוסיפים NHS כדי להגביר את יעילות התגובה של הקרבודימיד.בשלב הבא, מרח מנות של 200 µL של תמיסת HA סטרילית על הזכוכית עם התבנית עד שהאזור המתובנית יכוסה. סגור את קופסת השקופיות כדי להגן על השקופיות מאור. יש להשאיר את תשתי התבנית תחת המנדף ללא הפרעה למשך 16 עד 24 שעות, בזמן שתמיסת ה-HA מגיבה עם ה-A-P-T-M-S המתובנית במיקרוסקופ ונוצר קשר MI יציב בין תוצר הביניים של ה-HA לאמין הראשוני של ה-A-P-T-M-S.ביום למחרת, השתמשו בפיפטת טפטוף (APA tear pipette) כדי לשאוב את תמיסת ה-HA. שטפו את השקופיות ב-PBS, ולאחר מכן כסו את הפני השטח ב-1%BSA ב-PBS למשך שעה אחת. כעת פני השטח מוכנים לתרבית תאים.הניחו את משטחי המיקרו-דפוס (micropattern) בתוך צלחת פטרי סטרילית לצורך גידול על גבי משטחי המיקרו-דפוס של HA. זרעו תרחיפי תאים בודדים של תאי סרטן בריכוזים שבין 0.4 ל-1 כפול 10⁶ תאי סרטן ל-18.75 cm² של שטח זכוכית, ב-1 mL של מצע גידול תאים כדי לכסות את פני השטח של נגליית הזכוכית. הניחו בזהירות את התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% CO2. תוך הקפדה שהמצע לא יישפך, היצמדות התאים צפויה להתרחש תוך 24 שעות וניתן להשקיפה באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.ניתן לתחזק משטחי תרביות תאים למשך עד חמישה ימים. בתנאי דגירה סטנדרטיים, יש להחליף את המצע בכל יום שני. ניתן להשקיף על מורפולוגיית התאים ועל צמיחתם באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.ניתן להחיל לאחר מכן בדיקות תאיות נוספות כדי לנתח תגובות למשטח ה-HA בדוגמה המוצגת כאן. משטח בעל תבנית HA כפי שנראה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ובתמונה. ניתוח עוצמת פלואורסצנציה J מדגים את דה-מובליזציית ה-ha מהתבנית.משטחי מיקרו-דפוס של HA מאפשרים לחקור אינטראקציות של תאי סרטן עם HA חיצוני. כאן מוצגת היצמדות של תאי סרטן למשטחי מיקרו-דפוס של HA. תאי קרצינומה של המעי הגס והשד נצמדו באופן מועדף לטלאי HA לאחר 24 שעות של תרבית. ניתן להשתמש בדימות ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת כדי לנתח אינטראקציות של תאים מתורבית עם משטחים שבהם מקובע HA.במיקרוגרף זה של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ניתן לראות את האינטראקציה של תאי סרטן המעי הגס עם HA; בצד ימין מוצגת הגדלה גבוהה יותר. כאן מוצגים שוב תאי סרטן השד שגודלו על משטחי HA; שוב, בצד ימין מוצגת הגדלה גבוהה יותר. ניתוח זה מדגים בבירור את נוכחותן של בליטות היצמדות (adhesive protrusions) המגבירות את התפשטותם של תאי הסרטן על דפוסי מיקרו של HA.לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי האופן שבו מכינים שירותי דפוסי מיקרו של HA ומיישמים אותם כדי לחקור את תגובת תאי סרטן.

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Micropatterns דבק כי לנרמל ארכיטקטורה הסלולרי יכול לשמש כדי להגביר את הרגישות של זיהוי של השפעות התרופה, לשפר reproducibility ולפשט רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. טכנולוגיה זו ייהנו סמים / siRNA מבחני המיון, שבוצעה על התרבות תומך קונבנציונלי התא וכתוצאה מכך סובל השתנות התא אל התא מוגזמת.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

אנו מציגים פרוטוקול functionalize זכוכית עם טלאי חלבון ננומטריים המוקפים bilayer שומנים נוזל. מצעים אלו עולים בקנה אחד עם מיקרוסקופיה אופטית מתקדמת וצפויים להוות פלטפורמה ללימודי הדבקה ו נדידת תאים.

מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

שיטה להשיג nanopatterns לא אחידה מבוססי דנדרימר כי היתר שליטה ננו של מקומיים ארגינין-גליצין-אספרטית חומצה (RGD) משטח צפיפות תיאר, הוחל על המחקר של תאית התמיינות אדהזיה ו- chondrogenic.

דנדרימר מבוססי Nanopatterns לא אחיד כדי מקומית משטח שליטה Adhesiveness: שיטה ישירה בידול Chondrogenic

מחקר זה מדגים את השירות ואת קלות מדידה הרחבה כמותית קרום התא שלה מתאם קיבולת דבק של תאים. בתור דוגמא מייצגת, אנחנו מראים כאן את הפרוטאין הקשורות Dickkopf 3 (DKK3) מעודד היווצרות מוגברת lobopodia תא adhesiveness ב adrenocortical קרצינומה של תאים במבחנה.

אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה

כאן אנו מציגים עבור סריקה מרחבית ננוליתוגרפיה בדיקה זמינה על-ידי יישור איטרטיביים של מערכי בדיקה, כמו גם הניצול של דפוסי ליטוגרפית ללימודי אינטראקציה תא-פני פרוטוקול.

ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבות תלת מימדי של החולה-derived גליובלסטומה תאים בתוך orthogonally tunable biomaterials כחיקוי של מטריקס המוח. גישה זו מספקת במבחנה, פלטפורמה ניסיוני זה שומר על מאפיינים רבים של ויוו גליובלסטומה תאים בדרך כלל לאיבוד בתרבות.

חומצה היאלורונית מבוסס Hydrogels לתרבות תלת-ממדי של החולה-Derived גליובלסטומה תאים

צלחת הדמיה המבוססת על HMCA מוצג לביצועים assay הפלישה. הצלחת הזו מקלה על היווצרות הגידול תלת מימדי (3D) spheroids והמידה של סרטן תאים פלישת מטריצות (ECM). כימות assay הפלישה מושגת על ידי ניתוח חצי-אוטומטי.

ניתוח של סרטן תאים הפלישה ושל סמים אנטי גרורתי הקרנת באמצעות מערך הידרוג מיקרו-תא (HMCA)-המבוסס על צלחות

המרכיב המשלים C1q היא מולקולה pro-דלקתיות מתבטאת במידה רבה בסביבה מיקרוסביבתית שיכולה לקיים אינטראקציה עם מטריצה החילוץ. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לבדוק כיצד C1q הקשורים חומצה יאלורונית השפעות התא הדבקה.

הערכה של הגומלין בין החלבון המשלים C1q וחומצה Hyaluronic בקידום הדבקה תא

מיקרוסקופיה של ליטוגרפיה וכוח המתיחה של כמעט UV משולבות כדי למדוד כוחות תאיים על הידרוג'לים מיקרו-מרופדים. שחרור ממוקד המושרה באור של תאים בודדים מאפשר מספר גבוה של מדידות באותה דגימה.

שליטה בהידבקות תאים באמצעות טכניקות דפוס הידרוג'ל ליישומים במיקרוסקופיה של כוח המתיחה

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

אנו מציגים שיטה לשכפול מיקרו-סביבה של גידול גליומה בחזית פולשנית המשלבת זרימת נוזל אינטרסטיציאלית. מודל זה הוא הידרוג'ל היאלורונן-קולגן I בתרבית רקמה שבה ניתן להפעיל ראש לחץ נוזל. פלישה ניתן לכמת, תאים ניתן לבודד או lysed.

מודל חומצה היאלורונית קולגן פוטופולימרי של מיקרו-סביבה פולשנית מסוג גליומה עם זרימה אינטרסטיציאלית

חקור אינטראקציות תאים סרטניים עם חומצה היאלורונית באמצעות משטחים micropatterned. השיטה משלבת פוטוליתוגרפיה וכימיה קרבודיאימיד ליצירת תבניות ברזולוציה גבוהה לניתוח התנהגות תאים.

משטחים micropatterned לחקר אינטראקציות חומצה היאלורונית עם תאים סרטניים

גלה סרטונים נוספים