מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment במבחנה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את הייצור והתפעול של מכשיר מיקרופלואידי, המשחזר מיקרו-סביבות גידול במבחנה, ויכול לשמש לבדיקת תרופות כימותרפיות. זהו המכשיר המיקרופלואידי. מכשיר זה יכול להיות שימושי בתחומים הבאים, בדיקה קלה לתרופות כימותרפיות במבחנה.

הוא מספק תוצאות עקביות ומדויקות לבדיקת רקמת גידול תלת מימדית, ומכשיר זה מספק ייצוג מדויק מאוד של גידול in vivo. מיקרו-סביבות גידולים קיימים במיקרו-סביבות תלת מימדיות והיכולת לבדוק באחת היא משמעותית. השלב הראשון בהליך הוא הרכבת המכשיר, הכולל ייצור של שבב מיקרופלואידית באמצעות ליתוגרפיה רכה, ניקוב חורים בכניסות וביציאות, הדבקה למגלשת זכוכית וחיבור צינורות לכניסה ויציאת זרימה.

לאחר מכן, סטרואידים גידול רב-תאיים אחידים נוצרים לשימוש במכשיר בשיטת הטיפה התלויה. לאחר מכן מוכנסים הספרואידים למכשיר, ואחריהם אפופטוזיס, חומרי זיהוי ותרופות כימותרפיות. לבסוף, מבוצעת מיקרוסקופ זמן, ואחריו הערכה מתמטית של מקדמי דיפוזיביות של תרופות כדי לכמת את יכולת החדירה של החומר הכימותרפי.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות צמיחת רקמות במכשיר היווצרות מיקרו-סביבות הטרוגניות בתוך הרקמה ודיפוזיה של תרופות לרקמה באמצעות שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי של זמן. חדירה מוגבלת של תרופות לסרטן לגידולים מוצקים היא גורם חשוב לכישלונם. רוב המודלים הנוכחיים לבדיקת תרופות לסרטן אינם מחקים את האופי התלת מימדי של גידולים מוצקים.

פיתחנו מכשיר מיקרופלואידי המורכב מרקמות גידול תלת מימדיות המוחדרות ברציפות. מודל זה מייצג בצורה מדויקת יותר את העברת התרופות לגידולים מוצקים ואת הפינוי המערכתי שלהם. סטרואידים רב-תאיים לגידול הם מודל מבוסס היטב של רקמות גידול תלת מימדיות.

בהליך זה, שיטת הטיפה התלויה משמשת ליצירת סטרואידים לשימוש במכשיר המיקרופלואידי. שיטה זו מאפשרת היווצרות סטרואידים עקביים בפרק זמן קצר. בדיקת תרופות כימותרפיות במבחנה ברקמה תלת מימדית יכולה לסייע בבדיקת תרופות בצורה יעילה יותר בהשוואה לחד-שכבות של תאים.

מערבבים את ה-PDMS וחומר הריפוי מאלסטומר הסיליקון ביחס משקל של תשע לאחד. לאחר מכן יוצקים את התערובת הזו על המאסטר ליצירת דגה בוהק בעובי ארבעה מילימטרים. להסרת בועות אוויר יש לרפא ב-60 מעלות צלזיוס למשך חמש שעות.

קלף את ה-PDMS הנרפא מהתבנית כדי לקבל חותמת של תכונות זרימה על האלסטומר. לאחר מכן בעזרת אגרוף ביופסיה של מילימטר וחצי המותקן על מקדחה, לחץ על חורי אגרוף לכניסות ויציאות. משוך את כל הפסולת.

הכניסו את הצד המאפיין של החותמת ומגלשת זכוכית נקייה לפלזמת חמצן למשך שמונה דקות. בתחריט פלזמת חמצן, הביאו את המשטחים המטופלים במגע מיידי כדי ליצור קשר ביניהם. שמור על המכלול בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס על מחמם מגלשות למשך חמש שעות לפחות.

כדי לחזק את הקשר, חבר צינורות PTFE בגודל 0.032 אינץ' ID לכניסות והיציאות של המכשיר המיקרופלואידי. באמצעות ממשק של מחברי מנעול פיתוי זכריים המחוברים למחברי נעילת פיתוי נקבה דוקרניים, מחברים ספציפיים אלה משמשים כדי לאפשר לעבור דרכם בקלות מבלי להישבר. לבסוף, הגדר את מכלול הזרימה באמצעות שסתומי כיבוי ומחבר Y, התקן את המכשיר על המיקרוסקופ לאחר הרכבת המכשיר, חבר צינורות לכניסות ויציאות מתאימות כדי להשלים את הגדרת הזרימה.

כפי שמוצג באיור זה, תצורה זו מאפשרת את הקלות והרבגוניות של אריזת ספרואיד לתוך המכשיר או יצירת זרימה של מדיום דרך המכשיר לאריזה. פתח את שסתום כניסת האריזה VPN ואת שסתום יציאת האריזה VP החוצה גידול. לאחר מכן OID יכול לעבור דרך הכניסה ולזרום לתוך תא התרבית שבו העמוד בתא זה יחזיק את הגידול במקומו כדי לזרום מדיום.

סגור את שסתומי האריזה ופתח את שסתום כניסת הזרימה VF פנימה ואת שסתום יציאת הזרימה VF החוצה כדי ליזום היווצרות PHE אחיד. בשיטת הטיפה התלויה תאי קרח טריפסין מתחת למכסה המנוע. קח את תאי הטריפסין המתקבלים מהצנטריפוגה.

לדלל את תמיסת המלאי לריכוז הרצוי על ידי התייחסות לטבלה הראשונה. לאחר מכן, הסר את המכסה של צלחת 48 בארות והניח אותה הפוכה. במכסה המנוע המעוקר, מלאו כל באר של הצלחת במיליליטר מים מעוקרים.

כדי לשמור על לחות, הניחו טיפה של 20 מיקרוליטר של תמיסת תאים מדוללת בכל אזור עגול על הכיסוי. בעזרת מיקרו פיפטה, הפוך בזהירות את המכסה והניח אותו מעל הצלחת, וודא כי טיפות לא נוגעות בשולי הבארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

עיין בטבלה הראשונה למשך הדגירה בהתבסס על התא הספציפי בו נעשה שימוש, ייווצר סטרואיד בכל טיפה תלויה. התחל על ידי עיקור המכשיר על ידי שטיפתו עם 70% אתנול דרך כניסת הזרימה. המשיכו עם שטיפה של כל אחד מ-PBS, ולאחר מכן מדיום תרבית תאים חוצץ H-E-P-E-S.

השאירו את המזרק הבינוני, הצמידו לצינור. לאחר מכן, משוך שניים עד שלושה סטרואידים למזרק ברז המזרק. להסרת בועות אוויר, חבר את המזרק לכניסת האריזה של המכשיר.

פתח את שסתום הכניסה VPN וסגור את שסתום היציאה הפתוח VFN VP החוצה וסגור את VF החוצה. החזק את מזרק האריזה אנכי כשהמחט פונה כלפי מטה. צפו בסטרואידים מתיישבים בתחתית המזרק לתוך מחבר נעילת הפיתוי של המחט.

דחוף את הבוכנה על מזרק האריזה וצפה ב-PHE נכנס לצינור וזורם לתוך המכשיר מכיוון שרק שסתום יציאת האריזה פתוח. סטרואיד ייכנס לתא המכשיר ויישמר על ידי עמודים מאחור. ברגע שנכנס לתא, הכדור S תואם את צורת החדר ומקבל גיאומטריה מלבנית.

סגור את שסתום הכניסה VPN ושסתום היציאה VP החוצה התקן את מזרק הזרימה SF על משאבת המזרק. משאבה זו מופעלת על ידי מחשב באמצעות משאבת מזרק פרו, שסתום כניסה פתוח VFN ושסתום יציאה VF החוצה. התחל את זרימת המדיום למכשיר בשלושה מיקרוליטר לדקה.

דגירה של ספרואיד למשך 24 שעות מלווה בהכנסת חומרים לזיהוי אפופטוזיס. לפני הכנסת אפופטוזיס, זיהוי או חומרים טיפוליים, אפשר שיווי משקל של ספרואיד עד 24 שעות כדי ליצור שיפועי תזונה ומיקרו-סביבות. ואז כבה את השסתום VFN.

עצור את משאבת המזרק. הסר את המזרק מהמשאבה והחלף אותו במזרק המכיל מדיום עם 0.25 מיקרוליטר למיל CASP זוהר אדום פעיל Caspase שלושה טוש. שטפו את המכשיר בתמיסה על ידי שטיפה ידנית של 0.7 מיליליטר ממנו דרך המכשיר.

ואז הרכיב את המזרק על המשאבה. הפעל מחדש את הזרימה ופתח את השסתום VFN. במשך תקופה של חמש עד שמונה שעות, שלב שלישי פעיל של cph אדום כפפת חבית יתפזר לתוך הרקמה ויזרח בהיר יותר באזורים אפופטוטיים חומר זיהוי אפופטוזיס בריכוז זה נשמר בכל פתרונות הזרימה הבאים.

דוקסורוביצין מוצג חמש עד שמונה שעות לאחר הכנסת חומרים לזיהוי אפופטוזיס. טיפול זה מנוקה מהמערכת על ידי שטיפה. כדי להוסיף תרופות כימותרפיות, עקוב אחר הנוהל לזיהוי אפופטוזיס כדי להכניס 10 דוקסורוביצין הידרוכלוריד מיקרומולרי.

לאחר מכן החלף את מזרק הטיפול במזרק ב-0.7 מיליליטר מדיום. המשך בזרימת החומר הטיפולי לפרק זמן קבוע. לאחר מכן כבה את השסתום VFN וכבה את משאבת המזרק.

הסר את מזרק הטיפול ממשאבת המזרק והחלף במזרק ב-0.7 מיליליטר מדיום. אפשר זרימת מדיום טרי למשך 24 עד 36 שעות תוך ניטור רציף של הרקמה תחת מיקרוסקופ. כל תהליך הרכישה למיקרוסקופ זמן-lapse היה אוטומטי באמצעות סקריפט מותאם אישית במעבדת IP, רכש אור משודר ותמונות פלואורסצנטיות של ה-PAX Foid בהגדלה של פי 10 כל 30 דקות להערכה מתמטית של מקדמי דיפוזיביות תרופות, הצעד הראשון הוא ליצור פרופילי עוצמה ליניאריים ממוצעים של פלואורסצנטיות מסמכים באמצעות תמונה J.בחר אזור מלבני של תחומי עניין, או החזר ROI המקיף את הרקמה בתא.

השתמש בפקודה פרופיל עלילה כדי ליצור פרופיל של עוצמות ממוצעות כפונקציה של המרחק מערוץ הזרימה. חזור על הפעולה עד שלוש נקודות זמן שונות. לאחר מכן, הפחיתו את עוצמת הקרינה הממוצעת ברקע מפרופילי העוצמה המתקבלים ונרמלו כל פרופיל באמצעות העוצמה המקסימלית המתאימה כדי לקבל C כפונקציה של X ו-T.כאשר C הוא הריכוז המנורמל של דוקסורוביצין, הערך של C משתנה בין אפס לאחד.

השלב הבא הוא להעריך את מקדם הדיפוזיה האפקטיבי של רופאים בתוך רופאי רקמת הגידול. ניתן לייצג דיפוזיה על ידי המשוואה הבאה כאשר ERFC היא פונקציית השגיאה המשלימה. X הוא המרחק לרקמה מהתעלה, ו-T הוא הזמן לאחר הכנסת דוקסורוביצין.

השתמש בסכימה האיטרטיבית הבאה בכל נקודת זמן שנחשבת. נחש ערך עבור D.חשב את הצד הימני של המשוואה בכל מיקום. X.חשב את סכום השגיאות בריבוע בין שני הצדדים, שנה את D כדי למזער את הממוצע השיורי.

הערכים האופטימליים של D המתקבלים בכל זמן מצביעים על הערכת מקדם הדיפוזיה האפקטיבי הממוצע של דוקסורוביצין ברקמה. המכשירים המיקרופלואידיים סיפקו תאי תרבית נגישים אופטית של מילימטר על 0.3 מילימטר על 0.15 מילימטר לגידול רקמת גידול תלת מימדית. שיטת הטיפה התלויה אפשרה היווצרות מהירה של PHE גידול בגודל וצורה עקביים ממספר קווי תאים.

PHE גדלו בהצלחה על המכשיר עד שלושה ימים. צמיחה בתאים הייתה קשורה לשינוי הניתן לשחזור של מיקרו-סביבות. בתוך phe, אפופטוזיס התרחש פחות בתאים הנמצאים בסמיכות לתעלת הזרימה וגבוה יותר ועמוק יותר לתוך הרקמה.

המכשיר שימש להערכת מקדם הדיפוזיה של דוקסורוביצין ורקמת הגידול. הערך השמור בניסוי תואם את הערך שדווח בעבר בסרטן שד אנושי בזמן ניסיון הליך זה. חשוב להיות זהירים במיוחד בשמירה על סטריליות בעת הזרמת PHE למכשיר מכיוון שיש לבצע זאת מחוץ לתרבית התאים.

ריסוס מכסה המנוע מזרקים וקצוות צינורות באתנול בנדיבות כדי להבטיח סטריליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין את תפקיד החדירה המוגבלת של תרופות לגידולים. הדגמנו טכניקה לחיקוי המסירה והפינוי המערכתי של תרופות על רקמות גידול תלת מימדיות ולכמת את חדירתן.

ביטול תרופות חודרות בצורה גרועה ייעל משמעותית את תהליך פיתוח התרופות לסרטן.