מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את הייצור והתפעול של התקן מיקרופלואידי המשחזר סביבות מיקרו של גידולים in vitro ויכול לשמש לבדיקת תרופות כימותרפיות. זהו ההתקן המיקרופלואידי. התקן זה יכול להועיל בתחומים הבאים: בדיקה פשוטה של תרופות כימותרפיות in vitro.

הוא מספק תוצאות עקביות ומדויקות לבדיקת רקמת גידול תלת-ממדית, ומכשיר זה מהווה ייצוג מדויק מאוד של גידול in vivo. סביבות מיקרו של גידולים קיימות בסביבות מיקרו תלת-ממדיות, והיכולת לבצע בדיקות בתוך סביבה כזו היא משמעותית. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא הרכבת המכשיר, הכוללת ייצור של שבב מיקרופלואידי באמצעות ליתוגרפיה רכה, ניקוב חורים בכניסות ובמוצאים, הדבקה למסליית זכוכית וחיבור צינורות לכניסה וליציאה של הזרימה.

בשלב הבא, נוצרים ספרואידים גידוליים רב-תאיים אחידים לשימוש במכשיר באמצעות שיטת הטיפה התלויה (hanging drop). לאחר מכן, הספרואידים מוחדרים למכשיר, ולאחריהם חומרי השראת אפופטוזיס, סוכני זיהוי ותרופות כימותרפיות. לבסוף, מבוצעת מיקרוסקופיית time-lapse, ולאחריה הערכה מתמטית של מקדמי הדיפוזיה של התרופה כדי לכמת את יכולת החדירה של הסוכן הכימותרפי.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות צמיחת רקמה בתוך ההתקן, היווצרות של מיקרו-סביבות הטרוגניות בתוך הרקמה ודיפוזיה של תרופות אל תוך הרקמה, וזאת באמצעות שימוש במיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשיטת time lapse. חדירה מוגבלת של תרופות לסרטן אל תוך גידוליים מוצקים היא סיבה משמעותית לכישלונהם. מרבית המודלים הנוכחיים לבדיקת תרופות לסרטן אינם מחקים את טבעם התלת-ממדי של גידוליים מוצקים.

פיתחנו התקן מיקרופלואידי המורכב מרקמות גידול תלת-ממדיות בפרפוזיה רציפה. מודל זה מייצג באופן מדויק יותר את אספקת התרופות לגידולים מוצקים ואת הסלקה הסיסטמית שלהן. ספרואידים של גידולים רב-תאיים הם מודל מבוסס של רקמות גידול תלת-ממדיות.

בנוהל זה, נעשה שימוש בשיטת הטיפה התלויה (hanging drop method) ליצירת ספרואידים לשימוש במכשיר המיקרופלואידי. שיטה זו מאפשרת יצירה של ספרואידים עקביים בפרק זמן קצר. בדיקה של תרופות כימותרפיות in vitro ברקמות תלת-ממדיות יכולה לסייע בסינון תרופות באופן יעיל יותר בהשוואה לשכבות חד-שכבתיות (monolayers) של תאים.

ערבבו את ה-PDMS ואת חומר ההקשיה מהאלסטומר הסיליקוני ביחס משקלי של תשעה לאחד. לאחר מכן, שפכו תערובת זו על התבנית המקורית (master) כדי ליצור שכבה בעובי של 4 mm. כדי להסיר בועות אוויר, בצעו דגזינג (Degas) והקשיחו בטמפרטורה של 60 °C למשך חמש שעות.

קלפו את ה-PDMS שהתגבש מהתבנית כדי לקבל חותמת של מאפייני זרימה על האלסטומר. לאחר מכן, באמצעות מחסן ביופסיה של 1.5 מילימטר המורכב על מקדח, punching חוררו חורים עבור הכניסות והיציאות. הוציאו כל שארית חומר.

החשוף את הצד הפעיל של החותמת ואת תגית זכוכית נקייה לפלסמה של חמצן למשך שמונה דקות. במכשיר להסרת חומרים באמצעות פלסמה של חמצן, הבא את המשטחים המטופלים למגע מיידי כדי ליצור ביניהם קשר. שמור על המכלול בטמפרטורה של 60 °C על מחמם תגליות למשך חמש שעות לפחות.

כדי לחזק את החיבור, חברו צינור PTFE בעל קוטר פנימי (ID) של 0.032 inches לכניסות וליציאות של ההתקן המיקרופלואידי. השתמשו בממשק של מחברי lure lock זכרים המחוברים למחברי lure lock נקביים עם חריצים (barbed); מחברים ספציפיים אלה משמשים כדי לאפשר מעבר קל דרכם ללא שבירה. לבסוף, הגדירו את מערך הזרימה באמצעות שסתומי סגירה ומחבר Y, והניחו את ההתקן על המיקרוסקופ. לאחר הצבת ההתקן, חברו את הצינורות לכניסות וליציאות המתאימות כדי להשלים את הגדרת הזרימה.

כפי שמוצג באיור זה, תצורה זו מאפשרת קלות וגמישות באריזת ספרואיד בתוך המכשיר או יצירת זרימה של מצע דרך המכשיר לצורך אריזה. פתח את שסתומי כניסת האריזה VPN ושסתום יציאת האריזה VP out. לאחר מכן, ה-tumor OID יכול לעבור דרך הכניסה לזרום אל תוך תא התרבית, שבו יעגין התוכן בתא ויחזיק את הגידול במקומו לזרימת המצע.

סגרו את שסתומי האריזה ופתחו את שסתום כניסת הזרימה VF in ואת שסתום יציאת הזרימה VF out כדי להתחיל ביצירת PHE אחיד. השתמשו בשיטת הטיפה התלויה כדי לבצע trypsin לתאי קרח תחת מנדף תרביות. הוציאו את תאי ה-trypsin שהתקבלו מהצנטריפוגה.

דללו את תמיסת המלאי לריכוז הרצוי בהתאם לטבלה one. לאחר מכן, הסירו את המכסה של פלטת 48 בארות והניחו אותה הפוכה. בתוך מנדף סטרילי, מלאו כל באר בפלטה ב-1 mL של מים סטריליים.

כדי לשמור על הלחות, יש להניח טיפה של 20 µL של תמיסת תאים מדוללת בכל אזור מעגלי על המכסה. באמצעות מיקרו-פיפט, הפוך בזהירות את המכסה והנח אותו על הפלטה, תוך הבטחה שהטיפות לא יגעו בקצות הבארות. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C.

עיינו בטבלה 1 כדי לקבוע את משך האינקובציה בהתאם לסוג התא שנעשה בו שימוש; סטרואיד ייווצר בכל טיפה תלויה. התחילו בסטריליזציה של המכשיר על ידי שטיפה ב-70% ethanol דרך כניסת הזרימה. לאחר מכן, בצעו שטיפה של PBS, ולאחר מכן שטיפה של תווך תרבית תאים עם HEPES buffer.

השאירו את מזרק המצע, וחברו אותו לצינורית. לאחר מכן, שאבו שני עד שלושה Steroids לתוך המזרק. כדי להסיר בועות אוויר, חברו את המזרק לכניסת האריזה של המכשיר.

פתחו את שסתומי הכניסה VPN וסגרו את VFN, פתחו את שסתומי היציאה VP out וסגרו את VF out. החזיקו את מזרק האריזה במצב אנכי כאשר המחט פונה כלפי מטה. המתינו עד שהסטרואיד ישקע לתחתית המזרק אל תוך מחבר ה-lure lock של המחט.

דחפו את הבוכנה של מזרק הדחיסה ועקבו אחר כניסת ה-PHE אל הצינור וזרימתו אל תוך המכשיר, שכן רק שסתום יציאת הדחיסה פתוח. סטרואיד ייכנס לתא של המכשיר וייעצר על ידי עמודים בחלקו האחורי. לאחר הכניסה לתא, הספרואיד של ה-S יתאים את עצמו לצורת התא ויקבל גיאומטריה מלבנית.

סגרו את שסתום הכניסה VPN ואת שסתום היציאה VP out והרכיבו את מזרק הזרימה SF על משאבת המזרקים. משאבה זו מופעלת על ידי מחשב באמצעות תוכנת syringe pump pro. פתחו את שסתום הכניסה VFN ואת שסתום היציאה VF out. התחילו את זרימת המצע אל תוך המכשיר בקצב של 3 µL לדקה.

לאחר דגירה של הספרואיד למשך 24 שעות, מוסיפים חומרי זיהוי לאפופטוזיס. לפני הוספת חומרי זיהוי לאפופטוזיס או חומרים טיפוליים, יש להמתין עד 24 שעות להגעה לשיווי משקל של הספרואיד, על מנת שיקומו מדרגי רכיבי תזונה ומיקרו-סביבות. לאחר מכן, יש לסגור את השסתום VFN.

עצור את משאבת המזרק. הסר את המזרק מהמשאבה והחלף אותו במזרק המכיל מדיום עם 0.25 µL למיל' של סמן Caspase three פעיל מסוג CASP glow red. שטוף את המכשיר באמצעות התמיסה על ידי הזרמה ידנית של 0.7 mL ממנה דרך המכשיר.

לאחר מכן, חברו את המזרק למשאבה. הפעילו מחדש את הזרימה ופתחו את שסתומי VFN. לאורך תקופה של חמש עד שמונה שעות, cask glove red active cph phase three יחלחל אל הרקמה ויפלוֹרסצנציה בעוצמה גבוהה יותר באזורים אפופטוטיים. סוכן זיהוי האפופטוזיס בריכוז זה יישמר בכל תמיסורי הזרימה הבאים.

דוקסורוביצין (Doxorubicin) מוכנס חמש עד שמונה שעות לאחר הוספת סוכנים לזיהוי אפופטוזיס. טיפול זה מנוקה מהמערכת באמצעות שטיפה. כדי להוסיף סוכנים כימותרפיים, יש לעקוב אחר הפרוטוקול לזיהוי אפופטוזיס כדי להכניס 10 micromolar של doxorubicin hydrochloride.

לאחר מכן, החליפו את מזרק הטיפול במזרק המכיל 0.7 milliliters של מצע. המשיכו את הזרימה של הסוכן הטיפולי למשך פרק זמן קבוע. לאחר מכן, סגרו את השסתום VFN וכבו את משאבת המזרקים.

הסר את מזרק הטיפול ממשאבת המזרקים והחלף אותו במזרק המכיל 0.7 milliliters של מצע. אפשר זרימה של מצע טרי למשך 24 עד 36 שעות תוך ניטור רציף של הרקמה תחת מיקרוסקופ. כל תהליך הרכישה עבור מיקרוסקופיית time lapse בוצע באופן אוטומטי באמצעות סקריפט מותאם אישית ב-IP lab, אשר רכש תמונות באור תבניתי ובפלואורסצנציה של ה-PAX Foid בהגדלה של 10 x בכל 30 דקות. לצורך הערכה מתמטית של מקדמי הדיפוזיה של התרופה, השלב הראשון הוא יצירת פרופילי עוצמה ליניאריים ממוצעים של פלואורסצנציית התרופה באמצעות Image J. בחר אזור עניין מלבני, או ROI, המקיף את הרקמה בתא.

השתמש בפקודת plot profile כדי להפיק פרופיל של עוצמות ממוצעות כפונקציה של המרחק מתעל התזרים. חזור על הפעולה עבור עד שלושה נקודות זמן שונות. לאחר מכן, החסר את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של הרקע מפרופילי העוצמה שהתקבלו ונרמל כל פרופיל באמצעות העוצמה המקסימלית המתאימה כדי לקבל את C כפונקציה של X ו-T. כאשר C הוא הריכוז המנורמל של doxorubicin, ערכו של C נע בין אפס לאחד.

השלב הבא הוא להעריך את מקדם הדיפוזיה האפקטיבי של doxorubicin בתוך רקמת הגידול. ניתן לייצג את הדיפוזיה באמצעות המשוואה הבאה, כאשר ERFC היא פונקציית השגיאה המשלימה. X הוא המרחק לתוך הרקמה מהתעלה, ו-T הוא הזמן לאחר הכנסת ה-doxorubicin.

השתמשו בסכימה האיטרטיבית הבאה בכל נקודת זמן הנבדקת. נחשו ערך עבור D. חשבו את הצד הימני של המשוואה בכל מיקום X. חשבו את סכום ריבועי השגיאות בין שני הצדדים, ועדכנו את D כדי למזער את ממוצע השאריות.

ערכי ה-D האופטימליים שהתקבלו בכל נקודת זמן להערכת מקדם הדיפוזיה האפקטיבי הממוצע של doxorubicin ברקמה. ההתקנים המיקרופלואידיים סיפקו תאי תרבית נגישים מבחינה אופטית במידות של מילימטר אחד על 0.3 מילימטר על 0.15 מילימטר לצמיחה של רקמת גידול תלת-ממדית. שיטת הטיפה התלויה אפשרה יצירה מהירה של PHE של גידול בגודל ובצורה עקביים ממספר שורות תאים.

תאי PHE גודלו בהצלחה על ההתקן למשך עד שלושה ימים. הצמיחה בתאים הייתה קשורה לשינוי הדידקטיבי של המיקרו-סביבות. בתוך ה-phe, אפופטוזיס התרחש פחות בתאים שנמצאו בקרבה לערוץ הזרימה, ובשיעור גבוה יותר בעומק הרקמה.

המכשיר שימש להערכת מקדם הדיפוזיה של doxorubicin ושל רקמת גידול. הערך שהתקבל בניסוי תאם לערך שדווח בעבר עבור סרטן שד אנושי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנקוט משנה זהירות בשמירה על סטריליות בזמן הזרימה של PHE אל תוך המכשיר, כיוון שיש לבצע זאת מחוץ לסביבת תרבית התאים.

רססו את המזרקים ואת קצות הצינוריות בתוך המבתר עם אתנול באופן נדיב כדי להבטיח סטריליות. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה של תפקידה של חדירה מוגבלת של תרופות לתוך גידולים. הדגמנו טכניקה לחיקוי של הובלה ופינוי מערכתי של תרופות ברקמות גידול תלת-ממדיות וכמותיות של החדירה שלהן.

סילוקם של תרופות בעלות חדירות נמוכה יייעל באופן משמעותי את תהליך הפיתוח של תרופות לסרטן.