Hyperinsulinemic-Euglycemic קלאמפ של עכברוש המודע
7 בפברואר 2011
מהדק hyperinsulinemic-euglycemic הוא "תקן הזהב" להערכת פעילות האינסולין. אינסולין הוא החדיר בקצב קבוע מגרה ספיגת הגלוקוז. כמות הגלוקוז אקסוגניים חדורים לפעול נגד זה טיפה מעיד על הרגישות לאינסולין. כאן ההליך מבוצע על חולדה, מודע מעצורים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך רגישות לאינסולין בחולדה בהרהורי (conscious) ללא הגבלה תנועתית (unrestrained). מטרה זו מושגת תחילה על ידי השחלת קטטר לעורק הקרוטיד השמאלי. לאחר מכן, מושחל קטטר לוריד הג'וגולרי הימני כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
שוטפים את הקטטרים מדי יום כדי לשמור על פתוחותם במהלך תקופת הבראה לאחר ניתוח שנמשכת חמישה ימים. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות מהקלמפ הגליקמי ההיפריאינסולינמי המראות שיעורי עירוי גלוקוז לגוף כולו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לקבל מדידות ישירות של שיעורי פינוי גלוקוז מהגוף כולו ברמות אינסולין פיזיולוגיות גבוהות.
יש להכין את הקטטרים העורקיים והורידיים לפני הפרוצדורה הכירורגית. על הקטטר להיות בעל קצוות קהים, להיות מלא בתמיסת מלח עם הפרין ולעבור עיקור באתנול, כאשר רצועת קשירה מחוברת היטב במרחק של 2.7 או 3.2 סנטימטרים מקצה אחד עבור קטטרים עורקיים וורידיים, בהתאמה. בפרוצדורה זו נעשה שימוש בחולדות Sprague Dawley זכרים בוגרים במשקל של כ-300 גרמים.
רשמו את משקל ההתחלה של בעל החיים והשתמשו במשקל זה למעקב אחר העלייה במשקל לאחר הניתוח. עבדו באזור ניתוח סטרילי. הרדימו את החולדה באמצעות 3% isof fluorine על ידי הנחתה בתוך קופסת הרדמה.
העבירו את בעל החיים הרחק מאזור הניתוח והכינו את אזור החתך על ידי הסרת שיער מסביב לצוואר ולכתפיים. לאחר הסרת השיער, הניחו את בעל החיים בקונוס לאף כדי לשמור על ההרדמה באמצעות כ-2% isof fluorine. קבעו את בעל החיים לשולחן הניתוח.
יש לוודא שהחולדה נמצאת תחת הרדמה מלאה על ידי בדיקת רפלקסים של הכף או העין. נקה את אתר החתך באמצעות 70% ethanol, לאחר מכן בצע קרצוף עם Betadine, ושוב עם 70% ethanol. השלב הראשון של הפרוצדורה הוא ביצוע חתך אנכי קטן בקו האמצע, 10 millimeter מעל העצם הסטרנום (sternum).
השתמשו בפינצטת מיקרו-דיסקציה קמורה כדי לבצע דיסקציה קהה של הרקמה ולהחשיף את שריר ה-sternal mastoid השמאלי. הסיטו שריר זה כדי לחשוף כסנטימטר אחד של העורק הקרוטיד השמאלי. הניחו פינצטת מיקרו-דיסקציה מתחת לעורק הקרוטיד כדי להחזיקו במקומו, תוך כדי הפרדה עדינה של רקמת חיבור.
חשוב לבודד את עצב הוואגוס מהעורק מבלי לגרום נזק לעורק או לעצב. השתמשו בתפר משי סטרילי במידה 4-0 כדי לקשור את הקצה הצפלי (העליון). קבעו את כלי הדם באמצעות פינצטת מיקרו-דיסקציה משוררת.
דקרו את האזור הקשור. השתמשו במתאם דגימה רב-פעמי (multis sample lure adapter) של מחט ונו-ג'קט (ven eject) בכיל 21. הסירו את פקק הפלדה אל-חלודה מהקטטר והשתמשו במנחה קטטר סטרילי כדי להחדירו אל העורק.
השתמשו בפינצטה כדי לוודא שהקטטר מקובע. שחררו חלקית את פינצת המיקרו-דיסקציה, סגרו על העורק והמשיכו להחדיר את הקטטר עד לחרוז. בנקודה זו, קצה הקטטר אמור להימצא בקשת האאורטה.
הדק שני תפריים מתחת לחרוז ואחד מעליו, ושטוף את הצינור עם 10 units per milliliter של סליין עם הפרין. כדי לוודא שהקתטר ידגום, חסום שוב את הקצה החיצוני של הקתטר באמצעות פקק פלדת אל-חלד. לאחר מכן, בצע דיסקציה קהה של הרקמה כדי לחשוף את הווריד jugular החיצוני הימני, בודד את הווריד בזהירות וקשור את הווריד ה-cephalic.
סיימו בתפירה באמצעות תפר משי. נקבו את הווריד בעזרת מחט בכיסוי של 21 gauge. הוציאו את מתאם הדגימה הרב-דגימתי.
הסר את פקק הפלדה שאינה מחלידה מהקטטר והשתמש במוליך קטטר סטרילי כדי להחדירו עד לחרוז. קבע שתי תפרים מתחת לחרוז ואחד מעליו. שטוף את הצינור עם תמיסת סלין קרה המכילה 10 units per milliliter heparin.
כדי לוודא שהקטטר ידגום, יש לחסום שוב את הקצה החיצוני של הקטטר בעזרת פקק פלדת אל-חלד, להחדיר מחט קהה בכיול 14 gauge מתחת לעור, ולבצע חתך בגב בין השכמות. לאחר מכן, יש להשחיל את הקטטרים דרך המחט כך שיבלטו מגב החולדה. כ-4 cm מכל קטטר צריכים להיות גלויים.
גזרו 0.5 סנטימטרים של צינור רפואי מסוג Tigon S 50 HL והניחו אותו סביב שני הקטטרים שהוצאו החוצה. קבעו אותו בעזרת סרט דביק כחול עבור הוורידים ואדום עבור העורקים. בדקו שוב את הקטטרים כדי לוודא שהם פתוחים, ולאחר מכן שטפו ומלאו אותם במי מלח עם הפרין בריכוז 150 units per milliliter למניעת קרישה.
סגור את כל החתכים באמצעות תפר משי 3-0. הנח את החולדה בעמדת שכיבה על הבטן (prone position) בכלוב נקי ומחומם מראש, כאשר המזון נגיש בקלות. ברגע שהחולדה מחזירה לעצמה את יכולת התנועה והערנות המלאות, החזר אותה לכלוב המגורים.
אפשרו לחולדה להתאושש במשך שלושה עד חמישה ימים, תוך ניטור יומי של זיהומים, כאבים ושינויים במשקל. חשוב לשמור על פתוחות הקטטר לאורך כל המחקר. בכל יום לאחר הניתוח, מלאו מזרקים בעלי קצה חלק (slip tip) של 1 ml במי מלח עם הפרין בריכוז של 150 units per milliliter, וסגרו אותם עם מחט קהה במידה 22 gauge.
יש להחדיר את המחט הקהה לתוך 20 סנטימטרים של צינור PE 50 עם מחבר צינור פלדת אל-חלד במידה 23 gauge בקצה השני. ודאו כי כל בועות האוויר הוסרו מהקו. סגרו את קו העורק שהוצא החוצא מהחולדה באמצעות תפסים כירורגיים (hemostats), ממש מתחת לפקק.
הסר את פקק קטטר הפלדה באמצעות זוג נוסף של פינצטות המוסטטיות. הכנס את מחבר הצינור המחובר למזרק אל תוך הקו העורקי ושחרר את הפינצטות ההמוסטטיות שחוסמות את הקטטר העורקי החיצוני. לאחר מכן, שאב את הדם העורקי מהקטטר אל תוך המזרק.
אם הקטטר אינו שואב בקלות, ייתכן שיהיה צורך לדחוף בעדינות רבה כמות קטנה של תמיסה דרך הקטטר כדי לשחרר את הקצה. בנקודה זו הקטטר נחשב לפתוח. כאשר הדם מגיע למזרק, סגרו את צינור ה-P 50 הסמוך למזרק של 1 mL והשליכו את המזרק.
החלף למזרק חדש מלא בתמיסת מלח קרה עם הפרין. שחרר את התפסן מהצינור ובזמן שהמזרק החדש מוחזק במצב אנכי, נקוש במזרק כדי להזיז בועות אוויר כלפי מעלה והרחק מהקו. הזרק תמיסת מלח עם הפרין עד שקו הקטטר יהיה נקי ונקי מדם.
סגרו את קו העורק באמצעות תפס (Clamp) ממש מתחת למחבר הפיתול. הסירו את מחבר המזרק מקו הקתטר העורקי והחליפו אותו בפקק צינור מפלדת אל-חלד. שחררו את התפסים (hemostats) שחוסמים את הקתטר העורקי החיצוני.
חזרו על הליך זה עבור הקו הוורידי. בשל לחץ ורידי נמוך, ייתכן שלא ניתן יהיה לבצע דגימה. באופן כללי, אם ניתן להזרים את התמיסה המלוחית ההפריניזית בהתנגדות מינימלית, סביר להניח שהקטטר ממוקם היטב בוריד.
לפני תחילת הפרוצדורה, יש לשקול את החיות, להכין את התמיסות ולהרכיב את מערכת התפסנים. לאחר שקילת החיה ואישור פתוחות הקטטר, יש להניח אותה במיכל קטן עם מצע המגביל אך אינו חוסם את התנועה. החולדות המשמשות במחקר זה צמות למשך חמש שעות לפחות ועמדו בדרישות העלייה במשקל לאחר הניתוח. משקלה של החולדה קובע את כמות האינסולין הדרושה בשלב זה.
מנה של ארבעה milli units לקילוגרם לדקה ניתנת בקצב של שני microliters לדקה. הכינו תמיסת dextrose בריכוז של 50% וודאו שקיימת כמות מספקת משני התמיסות שתספיק למשך כשעתיים; השתמשו במזרקים של שלושה מיליליטר. כעת ניתן להרכיב את מכשיר התקיפה.
הגדירו את הצינורות ואת משאבות ההזרקה כפי שמוצג כאן. מקמו את מזרקי הגלוקוז והאינסולין על משאבת המזרקים. סגרו את הצינורות בעזרת תסמיכים ואפשרו לחולדה להירגע במשך 30 דקות לפני תחילת הניסוי.
כדי להתחיל בפרוצדורה, קחו דגימת בסיס של אינסולין והמטוקריט; דגימת המטוקריט מבטיחה שנפח הדם נשמר לאורך כל הניסוי. באופן כללי, רמות ההמטוקריט לא צריכות לרדת ביותר מ-10% מהערך הראשוני. קחו דגימת בסיס של גלוקוז וקבעו את רמת הגלוקוז שיש להשמור במצב קבוע (clamp).
כאן אנו מקבעים את רמת הגלוקוז בדם על 5 millimolar. לאחר כל דגימת דם, שטפו את הקו העורקי בנפח קטן של תמיסת סליין עם 10 units per milliliter של הפרין כדי למנוע קרישה. לאחר קביעת רמת הגלוקוז המיועדת לקיבוע, התחילו בעירוי של תמיסת אינסולין.
יש לתעד את רמת הגלוקוז בדם במרווחים של 5 עד 10 דקות ולהתאים את קצב עירוי הגלוקוז לפי הצורך עד להשגת מצב יציב (steady state). זהו בדרך כלל תהליך של ניסוי וטעייה שיכול להימשך בין 30 דקות ליותר משעתיים. רמת הגלוקוז הנדרשת לשמירה על גליקמיה תלויה בפרוטוקול הניסויי.
המינים והתנאים הנוכחיים כדי להיחשב כנמצאים במצב של קיבוע (clamped), שלוש קריאות רצופות חייבות להיות בתוך טווח מוגדר. שלוש קריאות בהפרש של כ-1 millimolar אחת מהשנייה מעידות על כך שרמות הגלוקוז הגיעו למצב יציב (steady state). קצב עירוי הגלוקוז הנדרש לשמירה על גליקמיה למשך תקופה של 30 דקות; במהלך זמן זה ניתן לדגום דגימות דם נוספות, לכל הפחות.
יש לאסוף דגימה שנייה של הפטו-קריט אינסולין בפלסמה ברגע שפרוצדורת ה-clamp מסתיימת. ניתן להשתמש בבעלי החיים לבדיקות נוספות או להקריב אותם לצורך איסוף רקמות לניתוח המשכי. בהתאם לבעל החיים, קטטרים יכולים להישאר פתוחים למשך חמישה עד שבעה ימים כאשר הפעולה בוצעה נכון.
ניתן להשתמש בפרוצדורת הקיבוע (clamp) למדידת רגישות לאינסולין במצב יציב. חיוני לתעד את רמות האינסולין והגלוקוז, כמו גם את קצבי עירוי הגלוקוז וערכי ההמטוקריט. מצב יציב מושג כאשר רמות הגלוקוז נותרות בטווח של מילימולר אחד אחת מהשנייה לאורך פרק זמן של 30 דקות.
קצב עירוי הגלוקוז חושף את רמת הגלוקוז האקסוגנית הדרושה לשמירה על רמת סוכר בדם (U glycemia), כאשר במידת האפשר יש להציג את הקצב כגרף לאורך זמן ולא כנקודת זמן ממוצעת בודדת. יש לדווח על רמות האינסולין הן במצב צום והן במצב של קיבוע (clamped). מדדים אלו מאשרים כי האינסולין הוגש בהצלחה ויגלו כל הבדל בתגובת האינסולין בין קבוצות הטיפול. מדידת רמות ההמטוקריט בנקודת הבסיס, ושוב לאחר הפרוצדורה, מבטיחה שהרמות לא ירדו ביותר מ-5% מרמת הבסיס במהלך הניסוי בעקבות פרוצדורה זו.
ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון מתן סומן איזוטופי, כדי להעריך את ניצול הגלוקוז בכל הגוף וברקמות ספציפיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סגירת היפראינסולינמיה-אuglycemic (hyperinsulinemic-euglycemic clamp) היא פרוצדורה מרכזית להערכת רגישות לאינסולין בחולדות ערות שאינן מוגבלות בתנועתן. שיטה זו מאפשרת מדידה ישירה של קצבי פינוי הגלוקוז ברמות פיזיולוגיות גבוהות של אינסולין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אנדוקרינולוגיה
- מטבוליזם
- פיזיולוגיה
רקע
- שיטת הclamp להיפראינסולינמיה-אuglycemic נחשבת ל"תו התקן" (gold standard) להערכת פעולת האינסולין.
- טכניקה זו כוללת עירוי של אינסולין כדי לעודד ספיגת גלוקוז.
- גלוקוז אקסוגני מוזרק כדי לשמור על רמות גלוקוז תקינות בדם (euglycemia), מה שמעיד על הרגישות לאינסולין.
- התהליך מבוצע בחולדות ערניות שאינן מקובעות, כדי לשקף תנאים פיזיולוגיים.
מטרת המחקר
- להערכת הרגישות לאינסולין במודל של בעל חיים חי.
- לקבלת מדידות ישירות של קצבי סילוק הגלוקוז מהגוף כולו.
- להערכת ההשפעות של רמות אינסולין פיזיולוגיות גבוהות על מטבוליזם של גלוקוז.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנתור של העורק הקרוטידי השמאלי והווריד הג'וגולרי הימני.
- שטיפה יומית של הצנתרים לשמירה על פתוחם במהלך ההחלמה.
- ביצוע פרוצדורת Clamp להיפר-אינסולינמיה ואאוגליקמיה.
- ניטור קצבי עירוי גלוקוז להערכת רגישות לאינסולין.
תוצאות עיקריות
- ניתן למדוד במדויק את קצבי עירוי הגלוקוז לגוף כולו.
- הטכניקה מספקת תובנות לגבי רגישות לאינסולין בחולדות בהערה.
- רמות אינסולין פיזיולוגיות גבוהות מאפשרות ניתוח מטבולי מפורט.
מסקנות
- בדיקת ה-hyperinsulinemic-euglycemic clamp יעילה לחקר פעולת האינסולין.
- שיטה זו יכולה להעמיק את ההבנה של הפרעות מטבוליות.
- היא מציעה גישה מהימנה להערכת רגישות לאינסולין in vivo.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
סגירת ההיפראינסולינמיה-אuglycemic (hyperinsulinemic-euglycemic clamp) מספקת שיטה המהווהe "standard gold" להערכת רגישות לאינסולין של הגוף כולו בחולדות בהכרה, ומאפשרת מדידה ישירה של קצבי סלקת הגלוקוז תחת רמות אינסולין פיזיולוגיות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות במחקר של מחלות מטבוליות על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על פעולת האינסולין, דבר שהוא קריטי להפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות בתוכניות לגילוי תרופות לסוכרת ולהשמנה. השימוש בבעלי חיים שאינם כבולים, בעלי קטטר כרוני, מפחית שונות הנגרמת ממתח (stress), ובכך משפר את מהימנות הנתונים לקבלת החלטות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי איתות של אינסולין ולויסות מטבולית.
- ערך תפעולי: מספק הערכה כמותית וישירה של קצבי עירוי גלוקוז בגוף כולו כמדד תפקודי לרגישות לאינסולין.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון במטרה על ידי קישור התערבויות מולקולריות לתוצאות פיזיולוגיות של הומיאוסטזיס של גלוקוז.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדים פיזיולוגיים מתוקפים שיכולים להוות בסיס לפיתוח סמנים ביולוגיים (biomarkers) לסריקת תרופות המגבירות רגישות לאינסולין.
- ערך תפעולי: קובע פרוטוקול ניתוחי ועירוי הניתן לשחזור, המתאים למחקרי אורך בין קבוצות טיפול שונות.
- מוכנות הבדיקה: מסייע בהכנת מודלי חיות עקביים לצורך הערכה של תרכובות בשלבים הבאים במודלים של מחלות מטבוליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מגשר בין מודולציית מטרה בשלב הגילוי לבין הערכת יעילות פרה-קלינית באמצעות נקודות קצה מטבוליות מדידות.
- רלוונטיות למחלה: ממדל באופן ישיר את הפתופיזיולוגיה של סוכרת מסוג 2 בבני אדם על ידי הערכת פינוי גלוקוז בהשראת אינסולין.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם תרכובות הבדיקה משפרות את הרגישות לאינסולין באמצעות הגברת ספיגת הגלוקוז ולא באמצעות השפעות עקיפות.
- תמיכה בקבלת החלטות פרה-קליניות: מספק מידע לקריטריונים של המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) בהתבסס על שינויים תלויי-מינון בשיעורי עירוי הגלוקוז.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
סגירת הclamps להיפראינסולינמיה-אאוגליקמיה משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, במיוחד לאחר זיהוי המטרה ולפני אופטימיזציה של המועמדים המובילים (lead optimization), כאשר נדרשת תיקוף פונקציונלי של הרגישות לאינסולין כדי לתעדף את המועמדים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מדידת ההשלכה הפיזיולוגית של מודולציה גנטית או פרמקולוגית של פעולת האינסולין.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של קטטריזציה, צום ועירוי, המניבים נתוני קצב עירוי גלוקוז ברי השוואה.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של קצב עירוי גלוקוז לאורך זמן, מה שמאפשר חישוב של שטח תחת העקומה (area-under-the-curve) וערכי מצב יציב (steady-state) לצורך השוואה בין קבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשר לתוקף פרה-קליני על ידי שיקוף תוצאות של clamp אינסולין בבני אדם, ובכך תומך בהלימה של ביומרקרים לתרגום קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לפנוטיפ יחיד מטבולי וכירורגי, הישימה במחקרי מודולטורים של אינסולין, נוטריצואטיקה ומכשירים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת ראיות ישירות לסילוק גלוקוז המתווך על ידי אינסולין.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות תחזוקה סטנדרטית של פתוחות הקטטר ושטיפה יומית בתמיסת סליין עם הפרין.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי קישור מעורבות המטרה לתוצאות מטבוליות תפקודיות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על יכולתן לשפר את הומאוסטזיס הגלוקוז במודל רלוונטי פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים כלי דם וטכניקות קטטרזציה במכרסמים.
- תלוי בדיוק משאבת ההזרקה ובמערכות לניטור גלוקוז לצורך התאמה בזמן אמת.
- מחייב טיפול סטנדרטי לאחר הניתוח וניטור משקל כדי להבטיח את תקינות המודל.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת פרוטוקולים בין זני חולדות שונים או מודלים של מחלות מטבוליות.
- מוגבל על ידי אורך חיי הקטטר, בדרך כלל 5–7 ימים, דבר המחייב תזמון של הניסוי בתוך חלון זמן זה.
