Name: הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T20:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: למד לבודד ולהרחיב תאי גזע עצביים ממוח עכבר עוברי באמצעות מבחן הנוירוספירה. הפרוטוקול כולל ניתוח מיקרו של המוח וגידול תרבית תאים לחקר נוירומדעים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מימון מקרן אוברסטריט.

1. יסוד הגדרת לפני שתמשיך Dissection: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח מתאים של המדיום המל"ל להשלים הוא מוכן על ידי ערבוב NeuroCult בינוני NSC הבסיס, NeuroCult NSC תוספי הפצת ביחס 9:01 בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדיום הוא התחמם בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני הקרה HEPES שנאגרו חיוני מינימום (שולי) עם ריכוז גבוה של אנטיביוטיקה (10%) מוכן לנתיחה ומטרה כביסה. לחלופין, המדיום NSC הבסיס עם תוספת אנטיביוטיקה עשוי לשמש גם למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 25-30 מ"ל של שולי קר המכילות אנטיביוטיקה הוא חילק לתוך צינורות 50 מ"ל סטרילי עבור אוסף של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה פלסטיק 10 ס"מ צלחות פטרי יש צורך להחזיק את העוברים ואת המוח במהלך דיסקציה וגם להחזיק רקמות גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלים כירורגיים, צריך להסיר את העוברים (מספריים גדולים, מספריים קטנים ומחודדים, מלקחיים גדולים, מלקחיים מעוקל קטן) או לניתוח מוח עובריים (מלקחיים קטנים, מלקחיים בסדר מעוקל, 45 ° מלקחיים בסדר זוויתי, ומספריים קטנים) הם מעוקרים באמצעות חרוז זכוכית מעקר ב 250 ° C או אחר שיטות החיטוי זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ Dissection הוא ניגב עם אלכוהול 70% ולהקים בתוך זרימה למינרית או ברדס PC2. </li></ol> 2. מסיק E14 מוח עכבר Micro-לנתיחה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן הזדווגו העכבר בהריון הוא הרדים ביום ה -14 של ההיריון על פי פרוטוקול חיה מוסדיים אחד מאושר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פריקה צוואר הרחם מתבצעת על מנת לוודא החיה אינה סובלת כאב ומצוקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר הרדים מונח על גבו על גבי נייר סופג רקמה, ואת הבטן היא שטפה עם אתנול 70% לחטא את האזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העור על הבטן נתפסת באמצעות מלקחיים גדולים, ולאחר מכן את העור ואת fascia הבסיסית היא לגזור במספריים גדולים כדי לחשוף את חלל הבטן ואת הרחם קרניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Uteri יוסרו עם מלקחיים ומספריים קטנים מועברים לתוך שפופרת המכילה 50 מ"ל חרוטי שולי קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות הרחם מועברים למכסה המנוע ושטף אז פעם או פעמיים עם נפח מספיק של שולי טרי קר סטרילי להסרת מזהמים אפשריים כמו דם ושיער. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות הרחם מועברים לצלחת פטרי המכילה 10 ס"מ שולי קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרניים הרחם נפתחים באמצעות מלקחיים מעוקל קטן מספריים העוברים מועברים צלחת 10 ס"מ חדש, אשר מכיל שולי קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשי העוברים מופרדים ברמת חוט השדרה הצווארי והועברו צלחת פטרי אחר המכיל שולי קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת פטרי מועבר תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להסיר את המוח מהגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשי מתקיימים עם מלקחיים מעוקל בסדר מהצד הזנב כדי בצד הגב של ראשים תפנינה כלפי מעלה. באמצעות מיקרו מספריים, תחילה חתך אופקי הוא עשה מעל העיניים ואז המשיכו קו האמצע מן המצח כלפי החלק האחורי של הראש. הקפד לחתוך דרך העור את הגולגולת ולא הנזק המוחי הבסיסי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח מוסר מהגולגולת על ידי דוחפים את הקצוות של המקטע לחתוך בתנועה לאחור באמצעות מלקחיים מעוקל. הליך זה נמשך עד שכל המוחות יוסרו מן הגולגולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח הוא יציב באמצעות מלקחיים מעוקל כך בצד הגבי פונה מעלה ולאחר מכן באמצעות microscissors חתך מבוצע דרך הקורטקס של האונה כל המשתרעת הנורות הריח לחלק האחורי של האונה לחשוף את יואילו הוד מעלתם ganglionic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מלקחיים מעוקל ביד אחת ואת 45 ° זווית מלקחיים השנייה, דשי חתך של הקורטקס מפוזרים ואת יואילו הוד מעלתם ganglionic הם גזור החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרקמה גזור ממוקם צלחת פטרי סטרילית 10 ס"מ, ועל הליך זה חוזר על עצמו עד שכל המוחות כבר מיקרו גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיסות רקמות נאספים באמצעות 1 מ"ל של מדיום NSC ב 1 מ"ל פיפטה קצה והועברו צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות הוא ניתק אז ביסודיות, אך בעדינות על ידי לחיצה על קצה פיפטה אל החלק התחתון של הצינור pipetting ההשעיה למעלה ולמטה. בדרך זו הם גושים שבור לתוך תאים בודדים. Pipetting מבוצע 3-4 פעמים כך ההשעיה כמו חלבי מושגת. לאחר מכן, ההשעיה מותר להתפשר על 1-2 דקות כדי לא ניתק גושים משקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמעט ההשעיה התא כולו מועבר צינור אחר ואז עוד 1 מ"ל של מדיום NSC מתווסף גושי הנותרים ניתק לתא בודד כמתואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכן של הצינורות הם אספו ו centrifuged במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, על 700rpm (110g). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant הוא שאב את עד גלולה בפועל, התאים הם resuspended ב 1 מ"ל של מדיום המל"ל להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדיום הוא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדייש השעיה הומוגנית תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μL ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90 μL של trypan כחול לבצע ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, התאים מצופה בצפיפות של 2x10 5 תאים / מ"ל במדיום המל"ל להשלים בתוספת גורם 20ng / mL הצמיחה אפידרמיס (EGF). 5 מ"ל בינוני משמש 20 מ"ל T25, T75 עבור מ"ל ו - 40 עבור T175 צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurospheres נוצרות 5-7 ימים כאשר מודגרות על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2. ב 6-7 ימים, הכדורים צריך למדוד בין 150-200 מיקרון יהיה מוכן תת (מעבר). </li></ol> 3. Passaging והרחבת NSCs עובריים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר neurospheres מוכנים תת (150-200 מיקרומטר קוטר), בינוני עם תחומי מושעה יוסר צלוחיות, להציב צינור סטרילי המתאים לגודל רקמת תרבות, centrifuged על 700 סל"ד (110 גרם) במשך 5 דקות ב טמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant נמחקת ואת התחומים הם resuspended ב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיית התא מודגרות אז אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים 2-3 דקות, ולאחר מכן נפח שווה של מעכבי טריפסין סויה משמש כדי לעצור את פעילות טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים התא pipetted בעדינות מעלה ומטה כדי להבטיח את טריפסין כבר מומת לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים התא centrifuged ב 700 סל"ד (110g) עבור 5 דקות. ואז, supernatant היא להסיר את התאים הם resuspended ב 1 מ"ל של מדיום המל"ל להשלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μL ההשעיה התא הוא מעורבב עם 90 μL של trypan כחול לבצע ספירת תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים מצופה בריכוז של 4 תאים 5x10 / מ"ל במדיום המל"ל להשלים בתוספת 20ng / mL EGF בתוך בקבוק בגודל המתאים רקמה תרבות. 5 מ"ל בינוני משמש 20 מ"ל T25, T75 עבור מ"ל ו - 40 עבור T175 צלוחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Neurospheres משניות נוצרות 5-7 ימים כאשר מודגרות על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2. </li></ol> 4. נציג תוצאות: בתרבות העיקרי NSC עובריים, רוב התאים יהפכו hypertrophic ולצרף את התרבות מנות רקמה על ציפוי. בעוד שרוב התאים יהיה גם למות או להבדיל, לאחר 2-3 ימים, שגשוג תאים לעשות אשכולות קטנים של תאים תנתק מן המצע (איור 1). כינונה של אגרגטים spheroidal גדול השעה-48 הראשונים של התרבות לא צריך להיות בטעות התחומים העיקריים. היווצרות מצטבר בעיקר תלוי בסכומים של פסולת ולא ניתק גושי רקמה בתרבות. Neurospheres נכון הם שלב בהיר יותר להיות כדורית כמו מגדילה גודל (איור 2). Microspikes קטן נראה על פני השטח החיצוניים של הספירות קיימא ובריא (איור 3). לאחר 5-7 ימים, הכדורים חייבים להיות עגול, אבל לא דחוס, ויש למדוד בין 150 ל -200 מיקרומטר קוטר. אם neurospheres מותר לגדל גדול מדי (אחרי 9-10 ימים בתרבות), הם עלולים ליצור אגרגטים או להפוך כהה בגלל מוות של תאים במרכז הספירות (ראה וידאו). Neurospheres גדול עשוי בסופו של דבר מתחילים להבחין באתרו (מצרף המצע נודדות לעבר הפריפריה). קשה גם לנתק neurospheres גדול תת אותם. <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ראשיים E14 תרבות NSC 3 ימים לאחר ציפוי. חצים מראים אשכולות מתרבים של NSCs. הגדלה מקורי; 20x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ראשיים E14 תרבות NSC 7 ימים לאחר ציפוי. הגדלה מקורי; 10x <img src="/files/ftp_upload/2457/2457fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. בקטע אחד E14 neurospheres 5 ימים לאחר ציפוי. הערה מיקרו קוצים (חיצים) בשולי הספירות. הגדלה מקורי: 20x

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+in+the+adult+mammalian+forebrain%3A+a+relatively+quiescent+subpopulation+of+subependymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells.</a> Neuron. 13, 1071-1082 (1994).</li>
<li>Craig, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+growth+factor+expansion+of+endogenous+subependymal+neural+precursor+cell+populations+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain.</a> J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).</li>
<li>Golmohammadi, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+the+frequency+and+distribution+of+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain.</a> Stem Cells. 26, 979-987 (2008).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li>
<li>Louis, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+neural+colony-forming+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay.</a> Stem Cells. 26, 988-996 (2008).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Assay neurosphere היא שיטת הבחירה של בידוד והרחבת בתאי גזע עצביים 1-5 בגלל הפשטות שלה reproducibility. Assay זהו כלי רב ערך עבור הדור בקנה מידה גדול של תאים במערכת העצבים המרכזית מובחן מבשר, אשר יכול לשמש הן במבחנה במחקרים vivo. יודגש כי neurospheres יכול להיווצר משני לתאי גזע עצביים בתום לב ואת אבות יותר מוגבלת. לפיכך, חישוב תדר להרכיב neurosphere פשוט מגזים בהערכת מספר NSCs בתום לב באוכלוסיה נתונה כל תא עצביות 6. כדי להעריך את תדירות NSCs בתום לב, ...

* כדי להפוך את המכפלת, לערבב 110L חבילה של מזכרות and160ml של HEPES 1M ולהביא את נפח L 8.75 בעזרת מים מזוקקים. הגדר את PH הסופי 7.4 ולאחסן אותו ב 4 ° C.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות assay neurosphere

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

ב mammalians, בתאי גזע מהווה גם מקור של תאים שלא עברו התמיינות לשמור בראשית התא התחדשות רקמות ואיברים שונים במהלך תוחלת החיים של החיה. הם יכולים באופן פוטנציאלי להחליף תאים אובדים בתהליך ההזדקנות או בתהליך של פציעה ומחלה. קיומו של בתאי גזע עצביים (NSCs) תוארה לראשונה במערכת יונקים בוגרים העצבים המרכזית (CNS) באמצעות נסיוב ללא הרומן בתרבות המערכת, assay neurosphere (NSA) של ריינולדס וייס (1992). שימוש assay, זה גם אפשרי לבודד להרחיב NSCs מאזורים שונים של מערכת העצבים העוברית. אלה ב NSCs במבחנה מורחבת multipotent הם יכולים להצמיח את שלושת סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית. בעוד NSA נראית פשוטה יחסית לביצוע, לב הנהלים הפגינו כאן נדרשת על מנת להשיג תוצאות אמינה ועקבית. סרט הווידאו הזה מדגים למעשה NSA ליצור ולהרחיב NSCs מיום עובריים 14-עכבר רקמת המוח ומספק פרטים טכניים כך אפשר להשיג תרבויות neurosphere לשחזור. ההליך כולל קצירת E14 עוברי עכברים, microdissection המוח לקצור את יואילו הוד מעלתם ganglionic, ניתוק של הרקמה שנקטפו במדיום NSC להשיג ההשעיה תא בודד, ולבסוף ציפוי התאים בתרבית NSA. לאחר 5-7 ימים בתרבות, neurospheres הראשוני וכתוצאה מכך הם passaged להרחיב עוד יותר את מספר NSCs ניסויים עתידיים.

זה פרוטוקול וידאו מדגים את היישום של assay neurosphere לבידוד והרחבת בתאי גזע עצביים מן יואילו הוד מעלתם ganglionic היום עובריים 14-עכבר המוח.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

בבני יונקים, תאי גזע משמשים כמקור של תאים לא מובחנים לצורך שמירה על גנזה (יצירת תאים) והתחדשות של תאים ברקמות ובאיברים שונים במהלך החיים...

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לבודד ולהרחיב תאי גזע עצביים ממוח של עכבר עוברי באמצעות בדיקת neurosphere. הפרוגדורה כוללת קצירת עוברי עכבר ביום E 14, ולאחריה מיקרו-דיסקציה של המוח לקצירת ה-ganglionic eminences, דיסוציאציה של הרקמה שנקצרה כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים, ולבסוף זריעת התאים בתרבית neurosphere. שלום, אני חסן עלי מהמעבדה של ד"ר ברנט פרנלס במכון המוח של אוניברסיטת פלורידה.היום אראה לכם כיצד להקים תרבית של נוירוספירות (neurospheres) ממוח של עכבר עוברי באמצעות בדיקת הנוירוספירות. אנו משתמשים בבדיקה זו באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לבודד ולהרבות תאי גזע עצביים. אשמח שנתחיל.הרדימה עכברה בהיריון עם זיווג תואם בזמן. ביום ה-14 להריון, בצע נתיקה של חוליי הצוואר ושטוף את הבטן ב-70% ethanol. אחוז את העור מעל הבטן באמצעות פינצטה גדולה, ולאחר מכן גזור את העור ואת הפסציה שמתחתיו באמצעות מספריים גדולים.כדי לחשוף את חלל הבטן ואת קרני הרחם, הוציאו את קרני הרחם המכילות את העוברים והעבירו אותן לשפופרת קונית של 50 ml המכילה HEM קר. לאחר העברת רקמות הרחם למנדף PC2, הוציאו את ה-HEM מהשפופרת של ה-50 ml ושטפו את הרקמות בנפח מספיק של HEM קר וטרי כדי להסיר מזהמים כגון דם ושיער; בצעו שתי עד שלוש שטיפות באופן זה. העבירו את רקמות הרחם לצלחת פטרי של 10 ס"מ המכילה HEM קר.פתח את קרני הרחם באמצעות פינצטה קמורה קטנה ומספריים, והעבר את העוברים לצלוחית חדשה המכילה hem קר. חזור על פעולה זו עד שכל העוברים נאספו. לאחר מכן, הנח את העוברים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.הפרידו את ראשי העוברים בגובה חוט השדרה הצווארי והעבירו אותם לצלחת פטרי אחרת המכילה hem קר. החזיקו את הראש באמצעות פינצטה עגולה עדינה תוך שימוש במיקרו-מספריים. ראשית, בצעו חיתוך אופקי מעל האף ולאחר מכן המשיכו לחתוך בקו האמצע מהמצח לכיוון אחורי הראש.יש לוודא כי החיתוך עובר דרך העור והגולגולת מבלי לפגוע במוח שמתחתיהם. הוצא את המוח מהגולגולת על ידי דחיפת קצוות החלק החתוך בתנועה אחורית באמצעות הפינצטה העקולת. המשך בפרוצדורה זו עד להוצאת כל המוחות מהגולגולות.החזיקו את המוח בצורה יציבה באמצעות פינצטה קמורה כך שהצד הגבי פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן, בעזרת מיקרו-מספריים, גזרו דרך הקורטקס של כל המיספרה מהנורונים הריחניים ועד לחלק האחורי של המיספרה. כדי לחשוף את הבליטות הגנגליוניות, תוך כדי החזקת המוח במקומו, הוציאו את הבליטה הגנגליונית השלמה בעזרת פינצטה בעלת זווית של 45 מעלות והעבירו אותה לצ그러ת פטרי אחרת. הבליטה הגנגליונית מוצגת כאן בבירור יחד עם חלקיה המדיאליים והלטרליים.לחלופין, ניתן לבצע דיסקציה של ה-ganglionic eminences על ידי הסרת הרקמות שסביבן באמצעות פינצטה עדינה. ניתן גם לחתוך את ה-eminence השלמה לחצי מדיאלי וחצי לטרלי, במידה וישנו עניין בגידול תאים מאחד מאזורים אלו.חזור על הליך זה עד שכל המוחות יעברו מיקרו-דיסקציה. השתמש ב-1 milliliter של מצע תאי גזע עצביים כדי לאסוף את פיסות הרקמה והעבר אותן לשפופרת צנטריפוגה של 15 milliliter. אפשר לגושי הרקמה לשקוע בשפופרת ה-15 milliliter כדי להבטיח שלא תישאר רקמה מאחור.הסיר חלק מהמדיום העליון (supernatant) ושטוף את בסיס צלחת הפטרי כדי להעביר כל רקמה נוספת למבחנה בנפח 15 ml. הנח את קצה הפ pipette בבסיס המבחנה. בצע פיפטור של התמיה למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים כדי לפרק את הרקמה ולהשיג סספנסיית תאים בודדים.לאחר מכן, הניחו לת сусפנסיה לשקוע למשך דקה אחת, כך שהגושים שאינם מאוחדים ישקעו, והעבירו כמעט את כל תרחיף התאים למבחנה אחרת בנפח 15 ml. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום לתאי גזע עצביים (neuro stem cell medium) לגושים שנותרו ופרקו אותם לתאים בודדים. שאיפו את תכולת המבחנות.לאחר מכן, סובבו את התמיה בצנטריפוגה במהירות של 700 RPM או 110 G למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשאיבו מחדש את התאים ב-1 mL של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים. קחו 10 µL מתמיחת התאים וערבבו היטב עם 90 µL של trypan blue.לאחר מכן, קחו 10 µL מתליה של תרחיף זה והעבירו אותו להמוסייטומטר (hemo cytometer). בצעו ספירת תאים. העבירו סך הכל 20 ml של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים למבחנה קונית של 50 ml, על מנת לזרע בקבקבון מסוג T 80 אחד.לאחר מכן, ערבבו את תרחיף התאים והוסיפו כמות מתאימה של תאים כדי להגיע לצפיפות כוללת של 200,000 תאים למיליליטר או 4 מיליון תאים לבקבוק T 80. הוסיפו EGF בריכוז סופי של 20 nanograms למיליליטר. ערבבו את התאים הנמצאים במצע תאי גזע עצביים מלא עם גורם הגדילה, והעבירו את תרחיף התאים לבקבוקי T 80.סמנו את הבקראק ובחנו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שקיבלתם תרחיף של תאים בודדים ללא גושי רקמה. העבירו את הבקראק לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5%CO2 למשך חמישה עד שבעה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימים, העריכו את הבקראק תחת המיקרוסקופ.בשלב זה, נוצרו נוירוספרים (neurospheres) שקוטרם צריך להיות בין 150 ל-200 מיקרון, והם מוכנים לתת-תרבית. אספו את תכולת הבקבוק למבחנה סטרילית לתרבית רקמות בגודל מתאים, צנטריפגו את המבחנה והסירו את הנוזל העליון. השעיו את הספירים ב-1 מיליליטר של טריפסין שחומם מראש, והניחו את המבחנה במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך שתי דקות.לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של מעכב טריפסין וערבבו היטב אך בעדינות כדי לעצור את פעילות הטריפסין. סבבו שוב בצנטריפוגה והסירו את העלייה. לאחר מכן, השעיו שוב את התאים ב-1 Milliliter של מצע תרבית מלא לתאי גזע עצביים ובצעו ספירת תאים כפי שצוין קודם לכן. כדי לזרוע בקבוק T 1 75 אחד, העבירו סך הכל 40 mls של מצע תרבית מלא לתאי גזע עצביים למבחנה קונית של 50 ml.לאחר מכן ערבבו את התאים והוסיפו כמות מתאימה של תאים לצפיפות כוללת של 50,000 תאים ל-M או 2 מיליון תאים לבקבוק T 1 75. לאחר מכן הוסיפו EGF בריכוז סופי של 20 nanograms per mil. ערבבו את התאים הנמצאים בתווך מלא של תאי גזע עצביים עם גורם הגדילה והעבירו את תרחיף התאים לבקבוק T 1 75.סמנו את הבקבוק והעבירו אותו לאינקובטור למשך חמישה עד שבעה ימים. זוהי דוגמה לתרבית ראשונית של תאי גזע עצביים E 14. שלושה ימים לאחר הזריעה, החיצים מראים צבירים של תאי גזע עצביים בשלבי התרבות.ניתן לראות גם תאים המודבקים למצע ושמובדלים. זוהי דוגמה לתרבית ראשונית של תאי גזע עצביים של E 14 שבעה ימים לאחר הזריעה. כפי שניתן לראות, קיימים ספירות בגדלים שונים.קיימים גם תאים מובחנים. כמות השאריות נמוכה בהרבה מזו שבספירות של נוירונים בוגרים ראשוניים. כמו כן, הספירות אינן דחוסות ויש להן קוצים מיקרוסקופיים מסביב להיקף, מה שמעיד על כך שהספירות בריאות וחיוניות.אין לאפשר לספירות לגדול יתר על המידה, שכן הן עלולות להחשיך בשל מוות תאי במרכזן. ספירות גדולות עלולות גם להיקשר לתשתית ולהתמיין. זוהי דוגמה לספירות עצביות (neurospheres) של E 14 במעבר ראשון, חמישה ימים לאחר הזריעה.כאן ניתן לראות שוב את הבלטות המיקרוסקופיות (micro Spikes) בפריפריה של הספירות. הרגע הצגנו כיצד לגדל נוירוספירות מ-ganglionic eminences של עכבר ביום E 14, בהתאם לאותם נהלים המתוארים כאן. ניתן לגדל נוירוספירות גם מאזורים אחרים של המוח, כגון הקורטקס והמזנצפאלון (mesencephalon).תודה שצפיתם בה and בהצלחה עם תרביות ה-neurosphere שלכם.

establishing-embryonic-mouse-neural-stem-cell-culture-using

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זה פרוטוקול וידאו מדגים את שיטת assay neurosphere ליצור ולהרחיב בתאי גזע עצביים מן האזור עכבר מבוגר periventricular, ומספק תובנות טכניות על מנת להבטיח ניתן להשיג תרבויות neurosphere לשחזור.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

זה פרוטוקול וידאו מדגים כיצד להפלות ו למנות בתום תאים בתום גזע עצביים באוכלוסייה מעורבת של תאים עצביים מבשר באמצעות assay עצביים המושבה יוצרי התא.

עצבית, המושבה יצירת Assay נייד: Assay להפלות בונה תאים בתום גזע עצביים מן ובתאים עצבית

זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה חדשה לייצור וטיהור הבאות של ובתאים עצביים ממקורות מתחדשים בתאי גזע עצביים (NSCs) מבוסס על (גרעיניות בגודל פנימי) הפיזי שלהם תכונות ניאון cytometry באמצעות טכנולוגיית הזרימה.

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

הסרטון מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של תאי גזע עצביים מהאזור התת-קלוסלי של מוח העכבר. זה כרוך בניתוח רקמות, דיסוציאציה אנזימטית, וטיפוח אותם עם גורמי התמיינות כדי להתפתח לתאים עצביים בוגרים.

בידוד וטיפוח של תאי גזע עצביים בוגרים מהאזור התת-קלוסלי של העכבר

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט לבידוד דפנות החדר הצידי ממוחו של עכבר בוגר וביצוע דיסוציאציה אנזימטית של רקמות להשגת תאים בודדים. תאים אלה נתונים לאחר מכן לתנאי תרבית ספציפיים המשפרים באופן סלקטיבי את התפשטות תאי גזע עצביים ומקדמים את התמיינותם לתרביות משותפות של אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים.

השגת תרבית אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים מעורבת מתאי גזע עצביים של עכברים בוגרים

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט לדור בו זמני של תרביות תאים עצביות מבשר, כמו גם monolayers או neurospheres חסיד, מאזור subventricular וgyrus משוננת של עכברים בוגרים בודדים.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

תאי גזע עצביים (NSCs) להתייחס לתאים אשר יכול עצמית לחדש ולבדל לשלוש השושלות עצביות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לקבוע תדירות המל"ל באוכלוסיית תא נתונה באמצעות neurosphere היווצרות והבחנה בתנאים משובטים.

ספירת בתאי גזע עצביים באמצעות מבחני המשובטים

. הנה, נדגים את הביצועים של מודל פגיעה בחוט השדרה מינימלי עכבר למבוגרים זה חוסך הנישה התעלה המרכזית דיור אנדוגני תאי גזע עצביים (NSCs). אנו מראים כיצד ניתן להשתמש וזמינותו neurosphere לכמת הפעלה והעברה של NSCs סופית ופרימיטיבי בעקבות פגיעה.

Neurosphere Assay כדי להעריך את הפעלת אנדוגני תאי גזע עצביים במודל של עכברים של פגיעה בחוט השדרה מינימלי

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

במאמר זה, אנו מתארים, בפרוטרוט, פרוטוקול עבור הדור של תרבויות נוירוספירה מתאי גזע העכבר הפוסט-לידתיים נגזר של נישות הראשי נוירוגניים העכבר. הנוירוספירות משמשות לזיהוי תאי גזע עצביים מרקמת מוח המאפשרים הערכה של מספרי תאים מקודמי. יתר על כן, אלה מבנים תלת-ממדיים יכול להיות מצופה בתנאים הדיפרנציאל, הענקת הנוירונים, oligodendrocytes הפוך ו astrocytes, המאפשר לימוד של הגורל התא.

בידוד והתרחבות של הנוירוספירות מפוסטנטאל (P1-3) העכבר גומחות נוירוגניים

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

למד לבודד ולהרחיב תאי גזע עצביים ממוח עכבר עוברי באמצעות מבחן הנוירוספירה. הפרוטוקול כולל ניתוח מיקרו של המוח וגידול תרבית תאים לחקר נוירומדעים.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

גלה סרטונים נוספים