הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לבודד ולהרחיב תאי גזע עצביים ממוח של עכבר עוברי באמצעות בדיקת neurosphere. הפרוגדורה כוללת קצירת עוברי עכבר ביום E 14, ולאחריה מיקרו-דיסקציה של המוח לקצירת ה-ganglionic eminences, דיסוציאציה של הרקמה שנקצרה כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים, ולבסוף זריעת התאים בתרבית neurosphere. שלום, אני חסן עלי מהמעבדה של ד"ר ברנט פרנלס במכון המוח של אוניברסיטת פלורידה.

היום אראה לכם כיצד להקים תרבית של נוירוספירות (neurospheres) ממוח של עכבר עוברי באמצעות בדיקת הנוירוספירות. אנו משתמשים בבדיקה זו באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לבודד ולהרבות תאי גזע עצביים. אשמח שנתחיל.

הרדימה עכברה בהיריון עם זיווג תואם בזמן. ביום ה-14 להריון, בצע נתיקה של חוליי הצוואר ושטוף את הבטן ב-70% ethanol. אחוז את העור מעל הבטן באמצעות פינצטה גדולה, ולאחר מכן גזור את העור ואת הפסציה שמתחתיו באמצעות מספריים גדולים.

כדי לחשוף את חלל הבטן ואת קרני הרחם, הוציאו את קרני הרחם המכילות את העוברים והעבירו אותן לשפופרת קונית של 50 ml המכילה HEM קר. לאחר העברת רקמות הרחם למנדף PC2, הוציאו את ה-HEM מהשפופרת של ה-50 ml ושטפו את הרקמות בנפח מספיק של HEM קר וטרי כדי להסיר מזהמים כגון דם ושיער; בצעו שתי עד שלוש שטיפות באופן זה. העבירו את רקמות הרחם לצלחת פטרי של 10 ס"מ המכילה HEM קר.

פתח את קרני הרחם באמצעות פינצטה קמורה קטנה ומספריים, והעבר את העוברים לצלוחית חדשה המכילה hem קר. חזור על פעולה זו עד שכל העוברים נאספו. לאחר מכן, הנח את העוברים תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

הפרידו את ראשי העוברים בגובה חוט השדרה הצווארי והעבירו אותם לצלחת פטרי אחרת המכילה hem קר. החזיקו את הראש באמצעות פינצטה עגולה עדינה תוך שימוש במיקרו-מספריים. ראשית, בצעו חיתוך אופקי מעל האף ולאחר מכן המשיכו לחתוך בקו האמצע מהמצח לכיוון אחורי הראש.

יש לוודא כי החיתוך עובר דרך העור והגולגולת מבלי לפגוע במוח שמתחתיהם. הוצא את המוח מהגולגולת על ידי דחיפת קצוות החלק החתוך בתנועה אחורית באמצעות הפינצטה העקולת. המשך בפרוצדורה זו עד להוצאת כל המוחות מהגולגולות.

החזיקו את המוח בצורה יציבה באמצעות פינצטה קמורה כך שהצד הגבי פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן, בעזרת מיקרו-מספריים, גזרו דרך הקורטקס של כל המיספרה מהנורונים הריחניים ועד לחלק האחורי של המיספרה. כדי לחשוף את הבליטות הגנגליוניות, תוך כדי החזקת המוח במקומו, הוציאו את הבליטה הגנגליונית השלמה בעזרת פינצטה בעלת זווית של 45 מעלות והעבירו אותה לצ그러ת פטרי אחרת. הבליטה הגנגליונית מוצגת כאן בבירור יחד עם חלקיה המדיאליים והלטרליים.

לחלופין, ניתן לבצע דיסקציה של ה-ganglionic eminences על ידי הסרת הרקמות שסביבן באמצעות פינצטה עדינה. ניתן גם לחתוך את ה-eminence השלמה לחצי מדיאלי וחצי לטרלי, במידה וישנו עניין בגידול תאים מאחד מאזורים אלו.

חזור על הליך זה עד שכל המוחות יעברו מיקרו-דיסקציה. השתמש ב-1 milliliter של מצע תאי גזע עצביים כדי לאסוף את פיסות הרקמה והעבר אותן לשפופרת צנטריפוגה של 15 milliliter. אפשר לגושי הרקמה לשקוע בשפופרת ה-15 milliliter כדי להבטיח שלא תישאר רקמה מאחור.

הסיר חלק מהמדיום העליון (supernatant) ושטוף את בסיס צלחת הפטרי כדי להעביר כל רקמה נוספת למבחנה בנפח 15 ml. הנח את קצה הפ pipette בבסיס המבחנה. בצע פיפטור של התמיה למעלה ולמטה שלוש עד ארבע פעמים כדי לפרק את הרקמה ולהשיג סספנסיית תאים בודדים.

לאחר מכן, הניחו לת сусפנסיה לשקוע למשך דקה אחת, כך שהגושים שאינם מאוחדים ישקעו, והעבירו כמעט את כל תרחיף התאים למבחנה אחרת בנפח 15 ml. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום לתאי גזע עצביים (neuro stem cell medium) לגושים שנותרו ופרקו אותם לתאים בודדים. שאיפו את תכולת המבחנות.

לאחר מכן, סובבו את התמיה בצנטריפוגה במהירות של 700 RPM או 110 G למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשאיבו מחדש את התאים ב-1 mL של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים. קחו 10 µL מתמיחת התאים וערבבו היטב עם 90 µL של trypan blue.

לאחר מכן, קחו 10 µL מתליה של תרחיף זה והעבירו אותו להמוסייטומטר (hemo cytometer). בצעו ספירת תאים. העבירו סך הכל 20 ml של מצע גידול מלא לתאי גזע עצביים למבחנה קונית של 50 ml, על מנת לזרע בקבקבון מסוג T 80 אחד.

לאחר מכן, ערבבו את תרחיף התאים והוסיפו כמות מתאימה של תאים כדי להגיע לצפיפות כוללת של 200,000 תאים למיליליטר או 4 מיליון תאים לבקבוק T 80. הוסיפו EGF בריכוז סופי של 20 nanograms למיליליטר. ערבבו את התאים הנמצאים במצע תאי גזע עצביים מלא עם גורם הגדילה, והעבירו את תרחיף התאים לבקבוקי T 80.

סמנו את הבקראק ובחנו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שקיבלתם תרחיף של תאים בודדים ללא גושי רקמה. העבירו את הבקראק לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5%CO2 למשך חמישה עד שבעה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימים, העריכו את הבקראק תחת המיקרוסקופ.

בשלב זה, נוצרו נוירוספרים (neurospheres) שקוטרם צריך להיות בין 150 ל-200 מיקרון, והם מוכנים לתת-תרבית. אספו את תכולת הבקבוק למבחנה סטרילית לתרבית רקמות בגודל מתאים, צנטריפגו את המבחנה והסירו את הנוזל העליון. השעיו את הספירים ב-1 מיליליטר של טריפסין שחומם מראש, והניחו את המבחנה במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך שתי דקות.

לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של מעכב טריפסין וערבבו היטב אך בעדינות כדי לעצור את פעילות הטריפסין. סבבו שוב בצנטריפוגה והסירו את העלייה. לאחר מכן, השעיו שוב את התאים ב-1 Milliliter של מצע תרבית מלא לתאי גזע עצביים ובצעו ספירת תאים כפי שצוין קודם לכן. כדי לזרוע בקבוק T 1 75 אחד, העבירו סך הכל 40 mls של מצע תרבית מלא לתאי גזע עצביים למבחנה קונית של 50 ml.

לאחר מכן ערבבו את התאים והוסיפו כמות מתאימה של תאים לצפיפות כוללת של 50,000 תאים ל-M או 2 מיליון תאים לבקבוק T 1 75. לאחר מכן הוסיפו EGF בריכוז סופי של 20 nanograms per mil. ערבבו את התאים הנמצאים בתווך מלא של תאי גזע עצביים עם גורם הגדילה והעבירו את תרחיף התאים לבקבוק T 1 75.

סמנו את הבקבוק והעבירו אותו לאינקובטור למשך חמישה עד שבעה ימים. זוהי דוגמה לתרבית ראשונית של תאי גזע עצביים E 14. שלושה ימים לאחר הזריעה, החיצים מראים צבירים של תאי גזע עצביים בשלבי התרבות.

ניתן לראות גם תאים המודבקים למצע ושמובדלים. זוהי דוגמה לתרבית ראשונית של תאי גזע עצביים של E 14 שבעה ימים לאחר הזריעה. כפי שניתן לראות, קיימים ספירות בגדלים שונים.

קיימים גם תאים מובחנים. כמות השאריות נמוכה בהרבה מזו שבספירות של נוירונים בוגרים ראשוניים. כמו כן, הספירות אינן דחוסות ויש להן קוצים מיקרוסקופיים מסביב להיקף, מה שמעיד על כך שהספירות בריאות וחיוניות.

אין לאפשר לספירות לגדול יתר על המידה, שכן הן עלולות להחשיך בשל מוות תאי במרכזן. ספירות גדולות עלולות גם להיקשר לתשתית ולהתמיין. זוהי דוגמה לספירות עצביות (neurospheres) של E 14 במעבר ראשון, חמישה ימים לאחר הזריעה.

כאן ניתן לראות שוב את הבלטות המיקרוסקופיות (micro Spikes) בפריפריה של הספירות. הרגע הצגנו כיצד לגדל נוירוספירות מ-ganglionic eminences של עכבר ביום E 14, בהתאם לאותם נהלים המתוארים כאן. ניתן לגדל נוירוספירות גם מאזורים אחרים של המוח, כגון הקורטקס והמזנצפאלון (mesencephalon).

תודה שצפיתם בה and בהצלחה עם תרביות ה-neurosphere שלכם.