Name: Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-03T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: למדו שיטה לגידול פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות לחקר מדעי המוח. הטכניקה שומרת על מבנה הרקמה וחיבורים סינפטיים למשך שבועיים בתרבית, ומאפשרת מחקר מדויק של פונקציית ההיפוקמפוס במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי NINDS - NIH R01NS060756

1. לפני תחילת הכנת פרוסות בהיפוקמפוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מבצעה רקמה על ידי הנחת פיסת סדין טפלון הרכבה להב חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את בתרבית רקמה (TC) ברדס עם אתנול 70% ולהגדיר את בתוך מיקרוסקופ לנתח. לעקר את מכסה המנוע, מיקרוסקופ, מבצעה רקמה וכל המכשירים לנתח במשך 15 דקות עם האור האולטרה סגול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ושש צלחות גם TC. הוספת 750 μL תרבות פרוסה התקשורת (SCM) לכל מקום היטב בתרבות מוסיף התא בכל טוב. ודא הקרומים רטובים לחלוטין, ללא בועות מתחת. מקמי את הצלחות באינקובטור ב 35 מעלות צלזיוס בגז עם 5% CO 2 עד הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 50 מ&quot;ל נמוך Na + ACSF (לנתח פתרון) לתוך כוס 100 מ&quot;ל ומניחים אותו על תערובת קרח ומלח. הבועה נמוך Na + ACSF עם 5% CO 2 / 95% O 2 עד שינויים בצבע ACSF צורות תערובת slurry של פתרון קפואים נוזלי (10-20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל עכברוש P5-P7 הגור. עד שלושה גורים ניתן להשתמש. </li></ol> 2. הכנת פרוסות בהיפוקמפוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הראש של החיה במספריים חדים השירות. חותכים את העור ולחשוף את הגולגולת. פתח את הגולגולת על ידי חיתוך מצד לצד לאורך קו interaural ואז לאורך תפר sagittal במספריים קטנים. לחתוך אופציונלי מצד לצד בחזית ניתן להקל על הסרת העצמות החשיפה של המוח. סקופ את המוח במהירות עם מרית כף מעוגלות מיקרו למקם אותו slurry של ביתור פתרון צמרמורת במשך דקה 1 ~. יוצקים ~ 10 מ&quot;ל של תמיסת קרים לנתח לצלחת 60 מ&quot;מ ולהעביר את המוח מן הכוס אל הצלחת. המוח צריך להיות מכוסה לנתח פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ הניתוחים: מניחים את המוח להחזיק אותו קו האמצע עם מלקחיים לנתח נלחץ אל החלק התחתון של צלחת 60 מ&quot;מ. השתמש בכלי ההיפוקמפוס לנתח כדי להפריד את האונות עוזב את המוח התיכון. Hippocampi חשופים אז על כל האונה. ואז בעדינות סקופ ההיפוקמפוס עם ההיפוקמפוס לנתח הכלי. השתמש איזמל המנתחים לחלוטין לבודד את ההיפוקמפוס לנקות אותו כמה שיותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה קיצצו של טיפ P1000 פיפטה לסנן, לשאוב בעדינות ההיפוקמפוס ולהעביר אותו גיליון טפלון על מבצעה את הרקמה. מקם את ההיפוקמפוס בצד הקעור שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את בניצב hippocampi ללהב להשיג חלקים העטרה ומסננים עודפי נוזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את hippocampi כל 400 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים ~ 10 מ&quot;ל קר SCM לצלוחית 60 מ&quot;מ ולהעביר פרוס hippocampi של מבצעה באמצעות אחר קיצצו P1000 קצה לסנן קר SCM. הימנע עושה בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מרית איריס מרית ישר בעדינות להפריד את הפרוסות זו מזו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד פרוסות מוגדר היטב ניזוק מן פרוסות פגום. </li></ol> 3. תרבות Slices בהיפוקמפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את שש גם צלחות עם SCM ותרבות מוסיף התא מן החממה. בעזרת קצה אחר P1000 קיצצו לסנן, להעביר את פרוסות בודדות על הממברנה. מניחים פרוסות 4-5 לכל הממברנה. היזהר שלא במקום הפרוסות או קרוב לקיר להוסיף או קרובים זה לזה. בעת הצורך, להשתמש במרית בקשתית פרוסות נפרדות. הסר בינוני עודף. מגע פרוסות מעט ככל האפשר פעם הם על הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה צלחת חזרה חממה ותרבות ב 35 ° C ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה SCM כל 48 שעות בתוך מכסה המנוע על ידי TC aspirating SCM עם פיפטה פסטר. הוספת 750 μL של טרי מראש חימם SCM לכל טוב. ודא שאין בועות נוצרות תחת הממברנה. </li></ol> 4. פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נמוכה Na + ACSF - פתרון הביתור עבור תרבויות פרוסה כדי deionized וסטרילי H 2 O להוסיף: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> עבור 500 מ&quot;ל </td><td> עבור מ&quot;ל 1000 </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 ז) </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 0.901 גרם </td><td> 1.802 גרם </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 0.149 גרם </td><td> 0.298 גרם </td><td> 4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> MgCl 2 (1 ז) </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 1.092 גרם </td><td> 2.184 גרם </td><td> 26 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 40 גרם </td><td> 80 גרם </td><td> 234 mM </td></tr><tr><td> הפתרון האדום פנול 0.5% ב DPBS </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 0.1% v / v </td></tr></tbody></table> מערבבים ~ 30 דקות Sterilize על ידי מעבר דרך מסנן 0.22μm בצע 50 מ&quot;ל aliquots ולאחסן ב 4 ° C לא יותר מ 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות Slice בינוני (SCM) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> עבור 500 מ&quot;ל </td><td> עבור מ&quot;ל 1000 </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> ממ הנשר בינוני </td><td> 4.2 גרם </td><td> 8.4 גרם </td><td> 8.4 g / l </td></tr><tr><td> סוס חום בסרום מומת </td><td> 100 מ&quot;ל </td><td> 200 מ&quot;ל </td><td> 20% </td></tr><tr><td> L-גלוטמין (200 מ&quot;מ) </td><td> 2.5 מ&quot;ל </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> CaCl 2 (1 ז) </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 (1 מ &#39;) </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> אינסולין (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל), מומס HCl 0.01 N </td><td> 0.5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ג / ליטר </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית, פתרון (25% w / v) </td><td> .024 מ&quot;ל </td><td> .048 מ&quot;ל </td><td> 0.00125% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 1.16g </td><td> 2.32g </td><td> 13 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 0.22g </td><td> 0.44g </td><td> 5.2 mM </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 3.58g </td><td> 7.16g </td><td> 30 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> מערבבים עד שהיא נמסה היטב ומביאים לטמפרטורת החדר. התאם את ה-pH 7.27-7.28 עם 1 N NaOH מדוד osmolarity. התאם עד 320 מילימול / ק&quot;ג עם deionized ו מעוקרים H 2 O. מצפים להוסיף כ 25-40 מ&quot;ל. בדוק osmolarity שוב. *** PH עשוי להשתנות מעט תוך התאמת osmolarity, זה בסדר, חשוב יותר כי osmolarity נמצאת בטווח הנכון (317-323). לעקר ע&quot;י מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. בצע 20 מ&quot;ל aliquots ולאחסן עד 2-3 שבועות 4 ° C. מניות Gluatamine: להכין בריכוז של 200 מ&quot;מ ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של 2.5 מ&quot;ל. חומצה אסקורבית המניות: להכין בריכוז של 25% (w / v) המאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס aliquots של μL 100. </li></ol> 5. נציג תוצאות: Slices צריך להיראות לבן תחת בהיקף לנתח בלי כתמים שחורים ומוגדרים היטב CA1 ניזוק, CA3, ואזורים gyrus משוננת. זיהום חיידקי נתפסת בקלות כמו כתמים שחורים נעים בטווח הבינוני או עכירות של SCM. כאשר הניח מתחת למיקרוסקופ, את פני השטח של הפרוסה צריך להיראות נקי אחרי 4 ימים בתרבות עם גופי התא ברורה ניכר בו. אם לא ברור גופי התא נראים ופסולת הרבה המכסה את פני השטח לאחר 4 ימים, אז לא פרוסה בריא.

<ol><li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. ntroduction <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+potentiation+and+structure+of+the+issue%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term potentiation and structure of the issue.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22The+synaptic+organization+of+the+brain%22">The synaptic organization of the brain</a>. , 5th edn, University Press. Oxford. (2004).</li>
<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+green+fluorescent+protein+%28GFP%29+into+hippocampal+neurons+through+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+rules+governing+AMPA+receptor+trafficking+to+synapses+in+hippocampal+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons.</a> Cell. 105, 331-343 (2001).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Esteban, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKA+phosphorylation+of+AMPA+receptor+subunits+controls+synaptic+trafficking+underlying+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity.</a> Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).</li>
<li>Mainen, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+in+living+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging in living brain slices.</a> Methods. 18, 231-239 (1999).</li>
<li>Barria, A., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit-specific+NMDA+receptor+trafficking+to+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses.</a> Neuron. 35, 345-353 (2002).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Simoni, A. D. e, Griesinger, C. B., Edwards, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+rat+CA1+neurones+in+acute+versus+organotypic+slices%3A+role+of+experience+in+synaptic+morphology+and+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity.</a> J Physiol. 550, 135-147 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטה זו מבוססת על השיטה שתוארה לראשונה על ידי Stoppini et al. 11 ומציע בצורה מהירה פרוסות תרבות בהיפוקמפוס. ההיבט החשוב ביותר של פרוטוקול זה היא לשמור על פרוסות סטרילי ולכן זה קריטי להשתמש בטכניקות סטרילי המתאים כראוי לחיטוי לעקר את כל החומר במגע עם רקמות. מקורות שונים serums יכולים להשפיע על איכות הפרוסות. אנו ממליצים על בדיקות קבוצות הראשונות. אם הזיהום הוא בעיה חוזרת, לבדוק החממה בתרבית רקמ...

<table><tbody><tr><td>מערכות השתלה לתרבית תאים (Inserts)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>פלטות 6 באריים</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>סורק רקמות (Tissue Slicer)</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425/51415</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Olympus Corporation</td><td>SZX7-ILLD2-100</td><td></td></tr><tr><td>כלי ניתוח להיפוקמפוס</td><td>F.S.T.</td><td>10099-15</td><td></td></tr><tr><td>מספרי עבודה גדולים, Perfection</td><td>F.S.T.</td><td>37500-00/37000-00 Right/ Left handed</td><td></td></tr><tr><td>שפכטל איריס</td><td>F.S.T.</td><td>10093-13</td><td></td></tr><tr><td>שפכטל ישר</td><td>F.S.T.</td><td>10094-13</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-שפכטל כף עגול</td><td>VWR international</td><td>57949-039</td><td></td></tr><tr><td>מחט ניתוח בעלת קצה חיתוך יחיד</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72946</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת ניתוח</td><td>Dumont</td><td>#2</td><td></td></tr><tr><td>מספרי ניתוח קטנים</td><td>F.S.T.</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>מדיום MEM Eagle</td><td>Cellgro</td><td>50-019 PB</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים שעבר אינאקטיבציה בחום</td><td>Invitrogen</td><td>26050-88</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין (1 mg/ml), מומס ב-HCl 0.01 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית, תמיסה (25%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Phenol Red בריכוז 0.5% ב-DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr></tbody></table>

organotypic slice תרבויות בהיפוקמפוס

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

ההיפוקמפוס, רכיב של המערכת הלימבית, משחק תפקידים חשובים בזיכרון לטווח ארוך וניווט מרחבי 1. נוירונים בהיפוקמפוס יכול לשנות את עוצמת הקשרים שלהם לאחר תקופות קצרות של הפעלה חזקה. תופעה זו, הידועה בשם potentiation לטווח ארוך (LTP) יכולה להימשך שעות או ימים הפך את המנגנון המועמד הטוב ביותר למידה וזיכרון 2. בנוסף, אנטומיה מוגדר היטב וקישוריות של ההיפוקמפוס 3 הפכה אותה מערכת מודל קלאסי ללמוד הילוכים הסינפטי ו 4 הפלסטיות הסינפטית. כפי הבנתנו את הפיזיולוגיה של סינפסות בהיפוקמפוס גדל שחקנים מולקולריים הפך מזוהה, צורך לתמרן חלבונים סינפטיים הכרח. תרבויות בהיפוקמפוס Organotypic להציע את האפשרות למניפולציות הגן קל התערבות פרמקולוגית מדויק אבל לשמור על ארגון הסינפטי הוא קריטי להבנת תפקוד הסינפסה בהקשר נטורליסטי יותר בתרבות שיטות שגרתיות נוירונים ניתק. כאן אנו מציגים שיטה להכין ותרבות פרוסות בהיפוקמפוס, כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. שיטה זו מאפשרת גישה קלה את פרוסות עבור מניפולציה גנטית באמצעות גישות שונות כמו זיהום ויראלי או 5,6 biolistics 7. בנוסף, פרוסות ניתן לשחזר בקלות עבור מבחני ביוכימיים 8, או להעביר מיקרוסקופים הדמיה 9 או בניסויים אלקטרו 10.

אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

ההיפוקמפוס, מרכיב במערכת הלימבית, ממלא תפקידים חשובים בזיכרון לטווח ארוך ובניווט מרחבי 1. נוירונים היפוקמפליים יכולים לשנות את ה...

המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. הדבר מושג תחילה על ידי הפקה של ההיפוקמפוס. השלב השני של ההליך הוא חיתוך ההיפוקמפוס לפרוסות.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הפרדה ומיון של פרוסות ההיפוקמפוס. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא תרבית של פרוסות ההיפוקמפוס. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פרוסות היפוקמפוס אורגניות בריאות באמצעות הדמיה עם מיקרוסקופ ניתוח או מיקרוסקופ.שלום, שמי ח'ימנה אופיץ ואני מדענית מחקר במעבדתו של ד"ר אנדרס באר באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. אני הדגמה של ההליך לתרבית של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל הצורך בניתוח וחיתוך מהירים של ההיפוקמפוס, ובשל הצורך למנוע זיהומים באמצעות שימוש בתמיסת ניתוח סטרילית ובתרבית פרוסות סטרילית.ניתן להכין את המצעים עד שלושה שבועות מראש ולאחסנם בטמפרטורה של 4°C כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לפני הכנת פרוסות ההיפוקמפוס, ניתן להכין את התרביות. יש לעקר כראוי הן את מנדף תרביות הרקמה והן את הציוד שישמש בדיסקציה.ראשית, נגב את פני השטח הפנימיים של מapay התרבית של הרקמה עם 70% ethanol. לאחר מכן, הנח את מיקרוסקופ הדיסקציה ואת כל מכשירי הדיסקציה בתוך המapay. הכן את חיתוך הרקמה על ידי הנחת יריעת Teflon נקייה על המשטח והרכבת להב חדש.הניחו את סרטן הרקמות בתוך מנדף תרביות הרקמה והשתמשו בתאור UV כדי לעקר את כל המשטחים והציוד במשך 15 דקות. כבו את האור לאחר סיום תהליך העיקור ב-UV. עבדו בתוך מנדף תרביות הרקמה.ראשית, הכינו את פלטות תרבית הרקמה בעלות שש בארות שישמשו לגידול פרוסות ההיפוקמפוס. טפטפו 750 µL של SEM לתוך כל בארה בפלטה בעלת שש הבארות. לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו תבנית תרבית תאים (cell culture insert) לתוך כל בארה בפלטת תרבית הרקמה.יש להקפיד לא לכלוא בועות אוויר מתחת למסננת. חשוב שמעטפת הממברנה של כל מסננת לתרבית תאים תהיה רטובה במדיום לתרבית פרוסות. אם הממברנה יבשה, יש לוודא שאין בועות אוויר.אם הממברנה נמצאת מעל המניסקוס של ה-SCM, ניתן להוסיף מצע נוסף לבאר. העבירו את פלטות התרבית שהוכנו לאינקובטור לתרביות רקמה. הגדירו טמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס עם 5% carbon dioxide עד למועד השימוש.לבסוף, מלאו דלי קרח בתערובת של קרח ומלח והניחו אותו לצד אזור עריפת הראש בזמן העבודה בתוך המנדף. מלאו כוס כימית של 100 milliliter בתמיסת דיסקציה. דחפו את הכוס הכימית לתוך תערובת הקרח והמלח והעבירו בועות של תערובת גזים המורכבת מ-5%carbon dioxide ו-95%oxygen למשך 10 עד 20 דקות, עד שהצבע משתנה מוורוד לכתום.ותמיסת הנתיחה יוצרת תערובת של תמיסה קפואה ונוזלית. כעת סביבת הנתיחה ופלטות תרבית הרקמה מוכנות לנתיחה. עטיפה מ-P3 עד P7.גורים משמשים להליך זה. פרוסות. ניתן להכין תרביות מעד שלושה גורים בו-זמנית. הליך זה יודגם באמצעות גור אחד.הוציאו במהירות את המוח מהבובת העטוף (wrap pup) לאחר decapitation והניחו אותו לכביסר של 100 milliliter המכיל את תמיסת הדיסקציה Slurry Chill למשך דקה אחת. במהלך זמן זה, הכינו צלחת דיסקציה על ידי הוספת כ-10 milliliter של תמיסת דיסקציה קרה מאוד לתחתית של צלחת תרבית רקמות של 60 millimeter. באמצעות כף מעוגלת או מיקרו-ספטולה, העבירו את המוח מהכביסר של 100 milliliter לצלחת של 60 millimeter המלאה במצע דיסקציה קר. ודאו שהמוח מכוסה לחלוטין בתמיסת הדיסקציה.הניחו את הצלחת המכילה את המוח תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. התבוננו דרך מיקרוסקופ הדיסקציה ואתרו את המוח. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר את המוח למרכז שדה הראייה.החזיקו את המוח בקו האמצע כאשר הפורספס של הניתוח לחוצים לתחתית הצלחת. בעזרת כלי הניתוח להיפוקמפוס, קלפו בעדינות את ההמיספרות הקורטיקליות מהמוח האמצעי תוך השארת המוח האמצעי במקומו, ובאופן אידיאלי מבלי לנתק את ההמיספרות הקורטיקליות משאר המוח; כעת ההיפוקמפוס חשוף. קחו את כלי הניתוח להיפוקמפוס ודללו את ההיפוקמפוס מהמיספירה אחת.לאחר מכן, השתמש במחט דיסקציה כדי לנקות כמה שיותר רקמה שאינה שייכת להיפוקמפוס. לאחר בידודו וניקיונו של ההיפוקמפוס הראשון, חזור על תהליך זה עבור ההיפוקמפוס השני מהhemisphere השנייה. לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים כדי לגזור את הקצה של טיפ פילטר של פיפטת P 1000.הנח טיפ של פיפט על פיפט P 1000 סטרילי. שאב בעדינות היפוקמפוס אחד והעבר אותו אל גיליון הטפלון שבסכיף לחיתוך רקמות (tissue slicer). לאחר מכן, העבר באופן דומה את ההיפוקמפוס השני אל הסכיף.מקמו את חצאי ההיפוקמפוס על צדדיהם הקעורים ויישרו אותם בניצב ללהב; שאבו נוזלים עודפים מגיליא הטפלון. הגדירו את המיקרומטר בעמדת האפס. פרסו את ההיפוקמפוס לפרוסות בעובי 400 µm.הכינו טיפ פילטר נוסף עבור P 1000 שקצו פיותו והרכיבו על פיפט P 1000 סטרילית. שפכו כ-10 milliliters של SCM קר לתוך צלחת תרבית רקמה סטרילית בקוטר 60 מילימטר. בעזרת הפיפט, הוסיפו מעט מדיום והעבירו את פרוסות ההיפוקמפוס מהסלייסר לצלחת.הימנעו מיצירת בועות לאחר חזרת על תהליך ההעברה עבור כל הפרוסות, והניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לבסוף, בעזרת מרית איריס ומרית ישרה, הפרידו בעדינות את הפרוסות זו מזו.הפרידו את הפרוסות המוגדרות היטב והבלתי פגועות מכל פרוסה פגועה. הפרוסות של ההיפוקמפוס המוגדרות היטב מוכנות כעת לתרבית. הוציאו מהאינקובטור את פלטות תרבית הרקמה בעלות שש בארות שהוכנו מראש, המכילות SCM וסרטי תרבית תאים, והעבירו ארבע עד חמש פרוסות בודדות לכל ממברנה באמצעות P 1000 עם קצה רחב קצוץ.במידת הצורך, השתמשו בשפכטל איריס כדי להפריד בין הפרוסות. היזהרו לא להניח את הפרוסות קרוב מדי לדופן המבחנה או בקרבה רבה זו לזו. תוך הקפדה לא לגעת בפרוסות, שאבו כל עודף של תוצר מתוך השכבה העליונה של תרבית התאים.הכנס את הממברנה. לבסוף, החזר את הפלטה, המכילה כעת את תרביות פרוסות ההיפוקמפוס, לאינקובטור לתרביות רקמה. הגדר את הטמפרטורה ל-35 °C וריכוז של 5% carbon dioxide.לאחר 48 שעות, הוצא את הפלטה מהאינקובטור תוך עבודה בתוך מנדף לתרביות רקמה. שאב את המצע באמצעות פיפטה. הוסף 750 µL של SCM טרי וחומם מראש לכל באר.שוב, ודאו שלא נוצרו בועות מתחת לממברנת המבנה להשבחת תרביות תאים. זוהי דוגמה לפרוסה בריאה של ההיפוקמפוס המוכנה לתרבית. אזורי ההיפוקמפוס CA1, CA3 והגירוס המשונן (dentate gyrus) נראים בבירור ואינם פגומים.כאן מוצג פרוס של היפוקמפוס פגום שלא שימש לתרבית. לבסוף, זוהי דוגמה לפרוס בריא של היפוקמפוס לאחר ארבעה ימים בתרבית. שימו לב שהפרוס נראה לבן תחת מיקרוסקופ הדיסקציה ופני השטח של הפרוס נקיים.אזורי ההיפוקמפוס, CA1, CA3 והגירוס המשונן (dentate gyrus), נראים בבירור ואינם פגומים. ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן יהיה לבצעה בתוך כשעה, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור להשתמש בטכניקות סטריליות מתאימות ולהיות עדינים עם הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי אופן התרביתו של רקמה אורגנוטיפית וליזיס של ההיפוקמפוס.תודה ובהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

תרבות organoptypic בהיפוקמפוס מודל פרוסה...

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

סרטון זה מדגים שיטה להכנת תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות ממוחו של גור חולדות. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בנתיחת ההיפוקמפוס, החיתוך ותנאי התרבית הדרושים לקידום קיום התאים וצמיחתם בפרוסות ההיפוקמפוס, ובסופו של דבר ליצירת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות.

הכנת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות מההיפוקמפוס של גור חולדות

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

הקלטות זוגות הן הקלטות סימולטניות של מהדק טלאי תא שלם משני נוירונים המחוברים סינפטית, מה שמאפשר אפיון אלקטרופיזיולוגי ופרמקולוגי מדויק של הסינפסות בין נוירונים בודדים. כאן אנו מתארים את המתודולוגיה והדרישות המפורטות לביסוס טכניקה זו בתרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות בכל מעבדה המצוידת באלקטרופיזיולוגיה.

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

פרוטוקול לתרבויות פרוסה organotypic entorhino-היפוקמפוס, המאפשר לשחזר היבטים רבים של פגיעה המוחית איסכמי, מוצג. על ידי לימוד לשינויים בתאי עצב שינויים של neurovasculature בנוסף, פרוטוקול זה הוא כלי תכליתי ללמוד שינויים פלסטיים ברקמה עצבית לאחר פציעה.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד neurogenesis לאחר הלידה בהיפוקמפוס באמצעות טכניקת התרבות הפרוסה organotypic. שיטה זו מאפשרת למניפולציה במבחנה של neurogenesis למבוגרים ומאפשרת היישום הישיר של סוכנים תרופתיים להיפוקמפוס התרבותי.

תרבויות Organotypic Slice ללימודים של אחרי לידה נוירוגנזה

Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.

Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים

אנו מתארים פרוטוקול עבור ביטוי מסוים בסוג תא של החיישן מקודד גנטית המבוסס על החיישנים ATeam 1.03ימק בתרבויות הפרוסות של העכבר הקדמי. יתר על כן, אנו מראים כיצד להשתמש בחיישן זה עבור הדמיה דינמית של רמות ATP סלולריים בנוירונים ו astrocytes.

הדמיה של ATP תאיים בפרוסות רקמה אורגנותית של המוח העכבר באמצעות חיישן מבוסס-הסריג ATeam 1.03ימק

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים ויכולים להיחשב מודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו מייצגת כלי מצוין לניטור הדינמיקה של פעילות ספונטנית, כמו גם להערכת ההתקדמות של תכונות נוירואינפלמטוריות לאורך כל מהלך אפילפטוגנזה.

מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

למדו שיטה לגידול פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות לחקר מדעי המוח. הטכניקה שומרת על מבנה הרקמה וחיבורים סינפטיים למשך שבועיים בתרבית, ומאפשרת מחקר מדויק של פונקציית ההיפוקמפוס במעבדה.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

גלה סרטונים נוספים