Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא לתרבית פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של ההיפוקמפוס. השלב השני של ההליך הוא חיתוך ההיפוקמפוס.

השלב השלישי בהליך הוא להפריד ולמיין את פרוסות ההיפוקמפוס. השלב האחרון בהליך הוא תרבית פרוסות ההיפוקמפוס. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המציגות פרוסות היפוקמפוס אורגניות בריאות של ההיפופוטם באמצעות הדמיה עם היקף דיסקציה, או מיקרוסקופ.

שלום, שמי Jimena Opitz ואני מדענית חוקרת במעבדה של ד"ר אנדרס בר באוניברסיטת וושינגטון. בסיאטל, אדגים את ההליך עבור ההיפוקמפוס האורגנוטיפי, תרבות LICs. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הצורך לנתח ולפרוס במהירות את ההיפו קאמפי ולמנוע זיהום, תמיסת דיסקציה סטרילית ותרבות פרוסות.

ניתן להכין מדיה עד שלושה שבועות מראש ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס כמתואר בפרוטוקול הכתוב. לפני פרוסת ההיפוקמפוס ניתן להכין תרבויות. יש צורך לעקר כראוי הן את מכסה המנוע של תרבית הרקמות והן את הציוד שישמש בדיסקציה.

ראשית, נגב את המשטח הפנימי של מכסה המנוע עם 70% אתנול. לאחר מכן הנח את מיקרוסקופ החיתוך ואת כל מכשירי החיתוך בתוך מכסה המנוע. הכן את פורס הרקמות על ידי הנחת חתיכה נקייה של יריעת טפלון על הבמה והרכבת להב חדש.

הנח את פורס הרקמות בתוך מכסה המנוע באמצעות אור UV, עקר את כל המשטחים והציוד למשך 15 דקות. כבה את האור לאחר השלמת תהליך עיקור ה-UV. עבודה במכסה המנוע של תרבית רקמות.

ראשית, הכינו את שש צלחות תרבית רקמת הבאר שישמשו לתרבית פרוסות ההיפוקמפוס. פיפטה 750 מיקרוליטר SEM לכל באר של צלחת שש הבארות. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים סטריליים, הניחו תוספת תרבית תאים לכל באר של צלחת תרבית הרקמות.

הקפד לא ללכוד בועות אוויר מתחת לתוספת. חשוב שהקרום של כל תוספת תרבית תאים יהיה רטוב במדיום תרבית פרוסות. אם הממברנה יבשה, בדוק שאין בועות אוויר.

אם הממברנה יושבת מעל המניסקוס של ה- SCM, ניתן להוסיף מדיה נוספת לבאר. מניחים את צלחות התרבות המוכנות לחממת תרבית רקמות. הגדר על 35 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני עד הצורך.

לבסוף, מלאו דלי קרח בתערובת מלח קרח והניחו אותו ליד אזור עריפת הראש הפועל בתוך מכסה המנוע. מלאו של 100 מיליליטר בתמיסת חיתוך. דוחפים את הכוס לתערובת מלח הקרח ומבעבעים את התמיסה עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% חמצן למשך 10 עד 20 דקות עד שהצבע משתנה מוורוד לכתום.

ותמיסת החיתוך יוצרת תערובת slurry של תמיסה קפואה ונוזלית. כעת סביבת הדיסקציה וצלחות תרבית הרקמות מוכנות לדיסקציה. P שלוש עד P שבע עטיפות.

גורים משמשים להליך זה. פרוסה. ניתן להכין תרביות מעד שלושה גורי עטיפה בכל פעם. הליך זה יודגם באמצעות גור יחיד.

קצרו במהירות את המוח מגור העטיפה ערוף הראש והניחו אותו בכוס של 100 מיליליטר המכילה את תמיסת החיתוך Slurry Chill למשך דקה אחת. במהלך תקופה זו, הכינו צלחת דיסקציה על ידי הוספת כ -10 מיליליטר תמיסת ניתוח קרה כקרח לתחתית צלחת תרבית רקמות בגודל 60 מילימטר בעזרת כף מעוגלת, מיקרוס ספטולה, העבירו את המוח מכוס 100 מיליליטר לצלחת 60 מילימטר מלאה במדיום חיתוך קר. ודא שהמוח מכוסה במלואו על ידי תמיסת הניתוח.

הניחו את הצלחת המכילה את המוח מתחת למיקרוסקופ הניתוח. הסתכלו דרך המיקרוסקופ המנתח ואתרו את המוח. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את המוח למרכז שדה הראייה.

החזיקו את המוח בקו האמצע כשמלקחיים לחוצים לתחתית המנה. בעזרת כלי ניתוח ההיפוקמפוס, קלפו בעדינות את ההמיספרות בקליפת המוח הרחק מהמוח התיכון תוך השארת המוח התיכון במקומו, ובאופן אידיאלי מבלי לנתק את ההמיספרות בקליפת המוח משאר המוח, ההיפוקמפוס חשוף כעת. קחו את כלי ניתוח ההיפוקמפוס והוציאו את ההיפוקמפוס מחצי כדור אחד.

לאחר מכן השתמש במחט החיתוך כדי לנקות כמה שיותר רקמות שאינן היפוקמפוס. לאחר שההיפוקמפוס הראשון מבודד ומנקה, חזור על התהליך הזה עבור ההיפוקמפוס השני מההמיספרה השנייה. לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את קצה פיפטת המסנן P 1000.

הנח את קצה הפיפטה על פיפטה סטרילית P 1000. שאפו בעדינות היפוקמפוס אחד והניחו אותו על יריעת הטפלון בפורס הרקמות. לאחר מכן, באופן דומה, הניחו את ההיפוקמפוס השני על הפורס

מקם את חצאי ההיפוקמפוס על הצדדים הקעורים שלהם ויישר אותם בניצב ללהב שאב עודפי נוזלים מיריעת הטפלון. הגדר את ה-ver או המיקרומטר במיקום האפס. פורסים את ההיפוקמפוס לחלקים של 400 מיקרומטר.

הכן קצה מסנן P 1000 חתוך נוסף והרכיב אותו על פיפטה P 1000 סטרילית. שופכים כ -10 מיליליטר SCM קר לתבנית תרבית רקמות סטרילית בגודל 60 מילימטר. בעזרת הפיפטה מוסיפים מעט מדיה ומעבירים את פרוסות ההיפוקמפוס מהפורס לתבשיל.

הימנע מהכנת בועות לאחר חזרה על תהליך ההעברה של כל הפרוסות, הניח את המנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח. לבסוף, בעזרת מרית קשתית ומרית ישרה. מפרידים בעדינות את הפרוסות זו מזו.

הפרד את הפרוסות המוגדרות היטב והלא פגומות מכל הפרוסות הפגומות. פרוסות ההיפוקמפוס המוגדרות היטב מוכנות כעת לתרבית. הסר את שש צלחות תרבית הרקמה שהוכנו בעבר המכילות SCM ותוספות תרבית תאים מהחממה באמצעות P 1000 עם קצה חזיר רחב חתוך, העבירו ארבע עד חמש פרוסות בודדות לכל קרום.

במידת הצורך, השתמש במרית הקשתית כדי להפריד פרוסות. היזהר לא למקם את הפרוסות קרוב מדי לקיר ההכנסה או בסמיכות זו לזו. הקפד לא לגעת בפרוסות, שאב כל מדיום עודף מהמשטח העליון של תרבית התאים.

הכנס קרום. לבסוף, החזירו את הצלחת, המכילה כעת את תרביות פרוסות ההיפוקמפוס לחממת תרבית הרקמה. מוגדר על 35 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר 48 שעות, הסר את הצלחת מהחממה הפועלת בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות. שאפו את המדיה בעזרת פיפטה אחורית. הוסף 750 מיקרוליטר של SCM טרי חם מראש לכל .

ובכן, שוב, ודא שלא נוצרות בועות מתחת לקרום הכנסת תרבית התאים. זוהי דוגמה לפרוסת היפוקמפוס בריאה שמוכנה לתרבית. ה-CA one, CA 3 והפיתול המשונן, אזורי ההיפוקמפוס נראים בבירור ולא ניזוקו.

מוצגת כאן פיסת היפוקמפוס פגומה שאינה משמשת לתרבות. לבסוף, זו דוגמה לפרוסת היפוקמפוס בריאה אחרי ארבעה ימים בתרבית. שימו לב שהפרוסה נראית לבנה מתחת למיקרוסקופ הניתוח ופני השטח של הפרוסה נקיים.

ה-CA one, CA 3 והפיתול המשונן, אזורי ההיפוקמפוס נראים בבירור ולא ניזוקו. ברגע שתשלוט בזה. ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד לזכור להשתמש בטכניקות סטרואידים מתאימות ולהיות עדין עם הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתרבת אורגנוטיפית. ליזה בהיפוקמפוס.

תודה ובהצלחה בניסויים שלך.