Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס
3 בפברואר 2011
אנו מתארים שיטה להכין פרוסות בהיפוקמפוס organotypic כי ניתן להתאים בקלות לאזורים אחרים במוח. פרוסות המוח מוטלות על ממברנות נקבוביים התקשורת בתרבות מותר להקים ממשק. שיטה זו משמרת את הארכיטקטורה ברוטו של ההיפוקמפוס עד 2 שבועות בתרבות.
המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. הדבר מושג תחילה על ידי הפקה של ההיפוקמפוס. השלב השני של ההליך הוא חיתוך ההיפוקמפוס לפרוסות.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הפרדה ומיון של פרוסות ההיפוקמפוס. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא תרבית של פרוסות ההיפוקמפוס. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פרוסות היפוקמפוס אורגניות בריאות באמצעות הדמיה עם מיקרוסקופ ניתוח או מיקרוסקופ.
שלום, שמי ח'ימנה אופיץ ואני מדענית מחקר במעבדתו של ד"ר אנדרס באר באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. אני הדגמה של ההליך לתרבית של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל הצורך בניתוח וחיתוך מהירים של ההיפוקמפוס, ובשל הצורך למנוע זיהומים באמצעות שימוש בתמיסת ניתוח סטרילית ובתרבית פרוסות סטרילית.
ניתן להכין את המצעים עד שלושה שבועות מראש ולאחסנם בטמפרטורה של 4°C כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לפני הכנת פרוסות ההיפוקמפוס, ניתן להכין את התרביות. יש לעקר כראוי הן את מנדף תרביות הרקמה והן את הציוד שישמש בדיסקציה.
ראשית, נגב את פני השטח הפנימיים של מapay התרבית של הרקמה עם 70% ethanol. לאחר מכן, הנח את מיקרוסקופ הדיסקציה ואת כל מכשירי הדיסקציה בתוך המapay. הכן את חיתוך הרקמה על ידי הנחת יריעת Teflon נקייה על המשטח והרכבת להב חדש.
הניחו את סרטן הרקמות בתוך מנדף תרביות הרקמה והשתמשו בתאור UV כדי לעקר את כל המשטחים והציוד במשך 15 דקות. כבו את האור לאחר סיום תהליך העיקור ב-UV. עבדו בתוך מנדף תרביות הרקמה.
ראשית, הכינו את פלטות תרבית הרקמה בעלות שש בארות שישמשו לגידול פרוסות ההיפוקמפוס. טפטפו 750 µL של SEM לתוך כל בארה בפלטה בעלת שש הבארות. לאחר מכן, בעזרת פינצטה סטרילית, הניחו תבנית תרבית תאים (cell culture insert) לתוך כל בארה בפלטת תרבית הרקמה.
יש להקפיד לא לכלוא בועות אוויר מתחת למסננת. חשוב שמעטפת הממברנה של כל מסננת לתרבית תאים תהיה רטובה במדיום לתרבית פרוסות. אם הממברנה יבשה, יש לוודא שאין בועות אוויר.
אם הממברנה נמצאת מעל המניסקוס של ה-SCM, ניתן להוסיף מצע נוסף לבאר. העבירו את פלטות התרבית שהוכנו לאינקובטור לתרביות רקמה. הגדירו טמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס עם 5% carbon dioxide עד למועד השימוש.
לבסוף, מלאו דלי קרח בתערובת של קרח ומלח והניחו אותו לצד אזור עריפת הראש בזמן העבודה בתוך המנדף. מלאו כוס כימית של 100 milliliter בתמיסת דיסקציה. דחפו את הכוס הכימית לתוך תערובת הקרח והמלח והעבירו בועות של תערובת גזים המורכבת מ-5%carbon dioxide ו-95%oxygen למשך 10 עד 20 דקות, עד שהצבע משתנה מוורוד לכתום.
ותמיסת הנתיחה יוצרת תערובת של תמיסה קפואה ונוזלית. כעת סביבת הנתיחה ופלטות תרבית הרקמה מוכנות לנתיחה. עטיפה מ-P3 עד P7.
גורים משמשים להליך זה. פרוסות. ניתן להכין תרביות מעד שלושה גורים בו-זמנית. הליך זה יודגם באמצעות גור אחד.
הוציאו במהירות את המוח מהבובת העטוף (wrap pup) לאחר decapitation והניחו אותו לכביסר של 100 milliliter המכיל את תמיסת הדיסקציה Slurry Chill למשך דקה אחת. במהלך זמן זה, הכינו צלחת דיסקציה על ידי הוספת כ-10 milliliter של תמיסת דיסקציה קרה מאוד לתחתית של צלחת תרבית רקמות של 60 millimeter. באמצעות כף מעוגלת או מיקרו-ספטולה, העבירו את המוח מהכביסר של 100 milliliter לצלחת של 60 millimeter המלאה במצע דיסקציה קר. ודאו שהמוח מכוסה לחלוטין בתמיסת הדיסקציה.
הניחו את הצלחת המכילה את המוח תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. התבוננו דרך מיקרוסקופ הדיסקציה ואתרו את המוח. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר את המוח למרכז שדה הראייה.
החזיקו את המוח בקו האמצע כאשר הפורספס של הניתוח לחוצים לתחתית הצלחת. בעזרת כלי הניתוח להיפוקמפוס, קלפו בעדינות את ההמיספרות הקורטיקליות מהמוח האמצעי תוך השארת המוח האמצעי במקומו, ובאופן אידיאלי מבלי לנתק את ההמיספרות הקורטיקליות משאר המוח; כעת ההיפוקמפוס חשוף. קחו את כלי הניתוח להיפוקמפוס ודללו את ההיפוקמפוס מהמיספירה אחת.
לאחר מכן, השתמש במחט דיסקציה כדי לנקות כמה שיותר רקמה שאינה שייכת להיפוקמפוס. לאחר בידודו וניקיונו של ההיפוקמפוס הראשון, חזור על תהליך זה עבור ההיפוקמפוס השני מהhemisphere השנייה. לאחר מכן, השתמש במספריים סטריליים כדי לגזור את הקצה של טיפ פילטר של פיפטת P 1000.
הנח טיפ של פיפט על פיפט P 1000 סטרילי. שאב בעדינות היפוקמפוס אחד והעבר אותו אל גיליון הטפלון שבסכיף לחיתוך רקמות (tissue slicer). לאחר מכן, העבר באופן דומה את ההיפוקמפוס השני אל הסכיף.
מקמו את חצאי ההיפוקמפוס על צדדיהם הקעורים ויישרו אותם בניצב ללהב; שאבו נוזלים עודפים מגיליא הטפלון. הגדירו את המיקרומטר בעמדת האפס. פרסו את ההיפוקמפוס לפרוסות בעובי 400 µm.
הכינו טיפ פילטר נוסף עבור P 1000 שקצו פיותו והרכיבו על פיפט P 1000 סטרילית. שפכו כ-10 milliliters של SCM קר לתוך צלחת תרבית רקמה סטרילית בקוטר 60 מילימטר. בעזרת הפיפט, הוסיפו מעט מדיום והעבירו את פרוסות ההיפוקמפוס מהסלייסר לצלחת.
הימנעו מיצירת בועות לאחר חזרת על תהליך ההעברה עבור כל הפרוסות, והניחו את הצלחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לבסוף, בעזרת מרית איריס ומרית ישרה, הפרידו בעדינות את הפרוסות זו מזו.
הפרידו את הפרוסות המוגדרות היטב והבלתי פגועות מכל פרוסה פגועה. הפרוסות של ההיפוקמפוס המוגדרות היטב מוכנות כעת לתרבית. הוציאו מהאינקובטור את פלטות תרבית הרקמה בעלות שש בארות שהוכנו מראש, המכילות SCM וסרטי תרבית תאים, והעבירו ארבע עד חמש פרוסות בודדות לכל ממברנה באמצעות P 1000 עם קצה רחב קצוץ.
במידת הצורך, השתמשו בשפכטל איריס כדי להפריד בין הפרוסות. היזהרו לא להניח את הפרוסות קרוב מדי לדופן המבחנה או בקרבה רבה זו לזו. תוך הקפדה לא לגעת בפרוסות, שאבו כל עודף של תוצר מתוך השכבה העליונה של תרבית התאים.
הכנס את הממברנה. לבסוף, החזר את הפלטה, המכילה כעת את תרביות פרוסות ההיפוקמפוס, לאינקובטור לתרביות רקמה. הגדר את הטמפרטורה ל-35 °C וריכוז של 5% carbon dioxide.
לאחר 48 שעות, הוצא את הפלטה מהאינקובטור תוך עבודה בתוך מנדף לתרביות רקמה. שאב את המצע באמצעות פיפטה. הוסף 750 µL של SCM טרי וחומם מראש לכל באר.
שוב, ודאו שלא נוצרו בועות מתחת לממברנת המבנה להשבחת תרביות תאים. זוהי דוגמה לפרוסה בריאה של ההיפוקמפוס המוכנה לתרבית. אזורי ההיפוקמפוס CA1, CA3 והגירוס המשונן (dentate gyrus) נראים בבירור ואינם פגומים.
כאן מוצג פרוס של היפוקמפוס פגום שלא שימש לתרבית. לבסוף, זוהי דוגמה לפרוס בריא של היפוקמפוס לאחר ארבעה ימים בתרבית. שימו לב שהפרוס נראה לבן תחת מיקרוסקופ הדיסקציה ופני השטח של הפרוס נקיים.
אזורי ההיפוקמפוס, CA1, CA3 והגירוס המשונן (dentate gyrus), נראים בבירור ואינם פגומים. ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן יהיה לבצעה בתוך כשעה, אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור להשתמש בטכניקות סטריליות מתאימות ולהיות עדינים עם הרקמה. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכיבו הבנה טובה לגבי אופן התרביתו של רקמה אורגנוטיפית וליזיס של ההיפוקמפוס.
תודה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לגידול פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות, אותה ניתן להתאים לאזורי מוח אחרים. הטכניקה משמרת את מבנה ההיפוקמפוס למשך עד שבועיים בתרבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- תרבית תאים
- מחקר על ההיפוקמפוס
רקע
- תרביות אורגנוטיפיות הן חיוניות לחקר פיזיולוגיית המוח.
- פרוסות היפוקמפוס שומרות על קשרי סינפסה ועל הארכיטקטורה התאית.
- שיטות קיימות עשויות שלא לשמר את שלמות הרקמה לאורך תקופות תרבית ממושכות.
- שיטה זו שואפת לשפר את החיוניות ואת הישימות של פרוסות מוח במחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לגידול פרוסות של ההיפוקמפוס.
- מתן אפשרות למחקר של תפקודי ההיפוקמפוס בסביבה מבוקרת.
- אספקת פרוטוקול שניתן להתאים לאזורי מוח אחרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ה dissection של ההיפוקמפוס מרקמת מוח.
- חיתוך ההיפוקמפוס לפרוסות דקות.
- מיון והפרדה של פרוסות ההיפוקמפוס.
- תרבית של הפרוסות על ממברנות נקביות עם ממשק מדיה.
תוצאות עיקריות
- שימור מוצלח של ארכיטקטורת ההיפוקמפוס למשך שבועיים.
- פרוסות אורגנוטיפיות בריאות שנצפו באמצעות מיקרוסקופי ניתוח או מיקרוסקופים.
- הוכחת התאמת השיטה לאזורי מוח אחרים.
- פוטנציאל למחקרים עתידיים על תפקוד ופתולוגיה של ההיפוקמפוס.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חסונה לגידול פרוסות מההיפוקמפוס.
- היא מאפשרת תקופות מחקר ממושכות תוך שמירה על שלמות הרקמה.
- יישומים עתידיים עשויים לשפר את ההבנה של תפקודי המוח ומחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות מספקות מערכת ex vivo רלוונטית פיזיולוגית לחקר מנגנונים סינפטיים, ומאפשרות מניפולציה גנטית ופרמקולוגית מדויקת תוך שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית. פלטפורמה זו תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי תרופות למדעי העצב, ובכך מגשרת על הפער בין בדיקות in vitro למודלים in vivo. יכולת ההתאמה והשחזור שלה הופכות אותה לנכס בעל ערך למיון תיקי פיתוח ולהמשכיות של מחקרים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה תפקודית של חלבונים סינפטיים בהקשר של מעגל עצבי שנשמר.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי שמירה על הקישוריות והארכיטקטורה המולדת של ההיפוקמפוס.
- מקל על מניפולציה גנטית והבהרה של מסלולים באמצעות גישות ויראליות או ביוליסטיות.
- מספק מערכת חסונה להערכת מעורבות המטרה והרלוונטיות הביולוגית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות רקמות עצביות מתוקתקות וניתנות לשחזור עבור סריקת תרכובות המשך.
- תומך בדימות כמותי ובקריאות אלקטרופיזיולוגיות לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של פרוסות עבור בדיקות פרמקולוגיות מקביליות.
- מאפשר הערכה מהימנה של השפעות תרכובות על תפקוד סינפטי ופלסטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מעגלים עצביים הרלוונטיים למחלה לצורך חקירת ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שימור מורכבות הרקמה.
- מפחית סיכון תרגומי על ידי אספקת נתונים ניבויים על מודולציה סינפטית.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על תגובות רקמתיות תפקודיות.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות משתלבות ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם דרך זיהוי מובילים ומחקר פרה-קליני, ותומכות בבדיקה איטרטיבית של היפותזות ובהערכה מכניסטית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשר בדיקה מונחית-היפותזה של תפקוד סינפטי ושל מודולציה של מסלולים בסביבה דמוית טבעית.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור הערכת תרכובות ופיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: תומך בדימות, באלקטרופיזיולוגיה ובבדיקות ביוכימיות לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין מחקרי in vitro למחקרי in vivo על ידי שימור ארכיטקטורה עצבית הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה לשימוש חוזר במחקרי מדעי המוח (neuroscience R)&תוכניות D.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק הכנות רקמה סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובעלות יכולת הרחבה עבור צוותים רב-תחומיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של נכסי מדעי העצבים (neuroscience) בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטרילי, טיפול ברקמות וטכניקות של תרביות פרוסות.
- דורש גישה למכסות תרביות רקמה, מיקרוסקופים וציוד חיתוך ייעודי.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך שחזור והשוואת נתונים.
- ניתן להסבה לאזורי מוח אחרים באמצעות התאמות בפרוטוקול כפי שנתמך על ידי השיטה.
- תלוי בטיפול זהיר לשמירה על חיוניות הפרוסות ולמזעור זיהומים.
