חלבון לוקליזציה ב 3D תרבות גזע עצביים נייד: מתודולוגיה ויזואליזציה היברידי

כאשר הן גדלות בתליה, תאי פרוגניטור עצביים שבודדו מנישות נוירוגניות במוח מתרבים ליצירת נוירוספירות. כאן אנו מציגים את הבידוד והחיתוך הסדרתי של נוירוספירות צפות, המופקות מהיפוקמפוס לאחר הלידה, במטרה לאתר ביטוי חלבון בתוך הנוירוספירה התלת-ממדית. נבצע צביעה אימונוהיסטוכימית לחלבון העניין, שבמקרה זה הוא Conexion 29, ולאחריה הרכבה ותרגום של תמונות מיקרוסקופיות דו-ממדיות לשחזור תלת-ממדי של הנוירוספירה.

ויזואליזציה של חלבונים בהקשר של מבניהם התלת-ממדיים הטבעיים, כגון ספירה עצבית צפה או רקמה, מאפשרת הבנה טובה יותר של תפקוד החלבון בהתבסס על מיקומו בתוך מבנים אלו, וכן מאפשרת הסקת מסקנות לגבי כללים אפשריים עבור חלבונים עם לוקליזציה ידועה אך תפקודים לא ידועים. שלום, אני סופיה אמבו מהמעבדה להתחדשות עצבית באוניברסיטת אוטווה. ואני ניקולס ואלנזואלה מסטודיו המדיה האימרסיבית של קרלטון באוניברסיטת קרלטון באוטווה.

היום נדגים כיצד לבודד, להרחיב ולבצע חיתוך רציף של תאי אב עצביים פוסט-נטאליים מהיפוקמפוס כנוירוספירות (nerve spheres). כדי למקם ביטוי של חלבונים באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית, נשתמש בתמוהים דו-ממדיים של חיתוכים רציפים של נוירוספירות שנאספו לאחר הצביעה, כדי להמחיש שיטה לשחזור של מיקום תאים וחלבונים במבנה תלת-ממדי, ובכך להעריך את הארגון המרחבי של ביטוי החלבון לאורך הנוירוספירות. אז בואו נתחיל.

לאחר איסוף המוחות, הכינו אותם להנחה על הצ'אק (chuck) על ידי יצירת משטח שטוח עליו ינוחו המוחות כראוי. תהליך זה נקרא חסימה (blocking). חסמו את המוח הקטן (cerebellum) באמצעות להב תער ופינצטה.

בשלב הבא, הניחו טיפה של דבק מהיר (crazy glue) על הצ'אק (chuck) וקבעו עליו את המוח הראשון, כאשר הצד הקדמי (anterior) פונה כלפי מעלה והצד הגבי (dorsal) פונה אליכם. המשיכו כך עם שאר המוחות; עבור המוח האחרון, מומלץ למקם את הצד הגבי הרחק מכם, כיוון שהחיתוך אינו תמיד מלא בכיוון זה. במידה והחיתוך אינו מלא, השתמשו בסכין מנתחים (scalpel) כדי לחתוך דרך הרקמה ולאסוף את הפרוסה.

המהירות היא קריטית בשלב ההדבקה, מכיוון שלא ניתן להשאיר את המוחות חשופים לאוויר למשך זמן רב מדי. לאחר שכל המוחות הודבקו, מניחים את הצ'אק בתוך הוויברטור וממלאים את התמיכה ב-CSF קר מאוד.

כוון את הוויברטור לתדר של 8.5 ולמהירות של 3.5 עד 4.5. הבא את הלהב למגע עם ה-A CSF והגדר את החיתוך האוטומטי. כעת נחתוך פרוסות בעובי של 500 micron.

שמרו את הפרוסות המכילות את ההיפוקמפוס. הניחו אותן בתוך צלחת מלאה ב-A CSF קר מאוד (בטמפרטורת קרח) והשליכו את שאר הפרוסות. לאחר איסוף כל הפרוסות, עברו לשלב הדיסקציה של ההיפוקמפוס.

באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקומי, אנו לוקחים רק את ההיפוקמפוס הגבי (dorsal hippocampus) בטווח שבין bgma למינוס 1.65 millimeters למינוס 2.10 millimeters בקירוב. הניחו את ההיפוקמפוסים בצלחת ריקה קרה על קרח. כאשר כל ההיפוקמפוסים נאספו מהפרוסות, יש להעבירם למCב מזרים (flow hood) לצורך דיסוציאציה מכנית.

התיזו על להב סקאלפל 70% ethanol ועקרו אותו באמצעות להבה. חתכו את הרקמה בעזרת הסקאלפל עד שמרקמה ייראה נוזלי. כעת, בעזרת מדיום דיסוציאציה המכיל כבר pepane DNAs ו-neural protease, אספו את הרקמה באמצעות פיפטינג והעבירו אותה למבחנה בנפח 15 milliliter.

עבור ניתוח אנזימטי, הכניסו את המבחנה לתנור מסתובב המוגדר ל-37 °C והמתינו לסיום העיכול במשך 45 דקות עד שעה. עם השלמת העיכול, הוסיפו 10 mL של PBS סטרילי לתרביות רקמה כדי לעצור את התגובה האנזימטית, וסבבו את התאים ב-300 ×g למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supranatant) והשעיקו מחדש את המשקע.

בחמישה מיליליטר של PBS, השתמש בפיפטת פסטור (pasteur pipette) ובצע טריטורציה (tate) לדגימה כדי לפרק את הרקמה עוד יותר. המשך בטריטורציה עד שחלקי הרקמה לא יקטינו יותר את גודלם. בנקודה זו, השקע שוב את התאים.

הסר את ה-PBS ושחזר את המשקע בשלושה מיליליטר של תווך תחזוקה. לאחר מכן, בצע טריטורציה יסודית לדגימה. קח אליקוט של 15 µL וערבב אותו עם נפח שווה של tripan blue.

קחו שתי דגימות של 10 µL וטענו המוציטומטר (hemo cytometer) לספירת תאים. ספרו את התאים משלושה שדות בכל חלק, לסך כולל של שישה שדות. חשבו את הממוצע של המספרים כדי לחשב את צפיפות התאים.

יש לזכור כי הדגימה מדוללת. צבעו בתריאן בלו (trypan blue) והעבירו את התאים לכלי עם הידבקות נמוכה בצפיפות של 2.5 × 10⁵ תאים לכלי בנפח סופי של 5 mL של מדיום תחזוקה. אם כלי עם הידבקות נמוכה אינם זמינים, ניתן להשתמש בצלחות פטרי.

במקרה זה, יהיה עליך להקיש על הנוירוספירות בכל בוקר ואחר הצהריים במהלך ששת הימים הראשונים כדי שהנוירוספירות לא יידבקו לתחתית הצלחת. הוסף EG, F ו-FGF לפני הנחת הצלחות באינקובטור. יהיה צורך להשלים גורמי גדילה אלו מדי יומיים לאורך כל תקופת התרבית. ביום in vitro 14, קבע את הנוירוספירות באמצעות פורמאלדהיד בריכוז סופי של כ-4% על ידי הוספתו ישירות לתרבית ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

שקעו את התאים על ידי סבב במ centri-fuge ב-300 ×g למשך חמש דקות. שטפו את התאים פעמיים ב-PBS והשעיו אותם בתמיסת סוכרוז 15 עד 20% שהוכנה בבופר פוספט 10 millimolar. השאירו להגנה קריוגנית (cryoprotection) בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות לפחות לפני החיתוך בקריוסטט.

הוציאו את הנוירוספירות (neurospheres) המוגנות בקריו-פרוטקטור מהמקרר והניחו אותן בצלחת בקוטר 60 מילימטר. עבור חיתוך סדרתי שבו איסוף של כל נתח הוא קריטי, מצאתי כי הדרך הטובה ביותר היא לבחור נוירוספירות בעלות גודל וצורה תקינים באמצעות מיקרוסקופ סטריאומשקוף; בעזרת פיפטור, העבירו נוירוספירה לתבנית קריו מלאה בתרכובת OCT. סמנו על תבנית הקריו את המיקום שבו נמצאות הנוירוספירות.

שלב זה יסייע באיתור ה-neurosphere במהלך החיתוך. לאחר שהנחתם במהירות חמישה עד 10 ספירות לתוך התבנית, הקפיאו אותן באמצעות CO2. בעזרת הסימונים שעל תבנית הקריו, סמנו ישירות על בלוק ה-OTC הקפוא את מיקומן של ה-neurospheres.

הוצא את בלוק ה-OCT מהתבנית והנח אותו על ראש הקירוסטט (chuck). קבע את התבנית לראש באמצעות CO2 והכנס אותה לתוך הקירוסטט. אפשר לדגימות להגיע לשיווי משקל למשך 30 דקות לפחות.

לאחר סיום פעולה זו, חתכו במהירות עד לסימונים שנעשו על התבנית, ולאחר מכן התחילו לאסוף כל חיתוך מעתה ואילך. בדקו היכן מתחילים חיתוכי ה-neurosphere באמצעות מיקרוסקופ אור. עם השלמת החיתוך, אחסנו את השקופיות במקפיא עד לרגע ביצוע האימונוכימיה. לשלב זה, הוציאו את השקופיות המכילות את אחד ה-neurospheres שנחתכו בסדרה, והוסיפו את השקופיות עם חמישה חיתוכים קודמים וחמישה חיתוכים עוקבים.

פעולה זו תבטיח שתדגמי את כל ה-neurosphere. שימוש בצביעה נגדית של הגרעין הוא הכרחי כדי למצוא את כל החתכים של ה-neurosphere שלך. לכן, קחי זאת בחשבון בעת תכנון הצביעה האימונולוגית שלך. בעוד השקופיות עוברות שטיפה ב-PBS ומגיעות לטמפרטורת החדר במשך חמש דקות לפחות, אנו משתמשים בתמיסת עיכוב נוגדנים המכילה 0.3% Triton X 100 לצורך חדירות ו-3% bovine serum albumin לצורך חסימה.

דללו את הנוגדן הראשוני שלכם באופן מתאים בבופר זה והדגירה בתא האנושי למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות. השתמשו ב-PBS כדי להצוף את הפאראפורם מהנוירוספירות והסירו אותו בזהירות באמצעות פינצטה. זהו השטיפה הראשונה מתוך ארבע שטיפות PBS של חמש דקות כל אחת.

יש למריח את הנוגדן המשני על השקופיות ולהדגיר אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. כפי שבוצע קודם לכן, יש להצוף את ה-paraform מהשקופית באמצעות PBS ולהסירו בעזרת פינצטה. שוב, זהו השטיפה הראשונה מתוך ארבע שטיפות של חמש דקות ב-PBS.

בשטיפה השלישית, אנו כוללים HOS 3 3 2, 5 8 כצבע נגד גרעיני, המדולל ל-0.5 micrograms per milliliter. לאחר השטיפה ב-hos, מתבצעת שטיפה נוספת אחת של חמש דקות ב-PBS. ברגע שכל השטיפות הושלמו, יש למרוח כמות נדיבה של מדיום קיבוע (mounting medium) לתחתית השקופית ולכסות בכיסוי זכוכית.

אבטחו את הפינות בעזרת לק לציפורניים. לאחר שכל השקופיות כוסו בזכוכית כיסוי, אבטחו את שאר קצוות זכוכית הכיסוי. צלמו את השקופית מיד או שמרו אותן בטמפרטורה של 20- Until תהיו מוכנים לעשות זאת.

במהלך הדמיה, מציאת התאים על הפיתח היא החלק הקשה ביותר; יהיה קל לזהות תאים השייכים לספירה אם תחפשו אותם באמצעות הצביעה הנגדית של הגרעין. ברגע שתמצאו את תחילתה של ספירת הנוירונים, שעשויה להכיל תאים בודדים בלבד, דמיינו כל חתך מכאן ואילך. צלמו את הצביעה הגרעינית, את החלבון או החלבונים המבוקשים ותמונת ניגודיות פאזה.

תמונת ניגודיות הפאזה (phase contrast) זו תהיה חשובה מאוד בשלבי המידול. תמונות עם סרגי מידה מובנים של 10 micrometers ו-50 micrometers שהוגדרו בתוכנת open lab 3.56 מיובאות ל-Photoshop CS4 תוך שימוש בגודל קנבס סטנדרטי של 3,300 על 2,550 פיקסלים.

כל תמונות החתכים הסדרתיים נשמרות כקבצי TIFF תוך שמירה על גודל הקנבס הסטנדרטי. פתח את תמונות הניגודיות של השלב הראשון והשני של החתכים הסדרתיים של הנוספרים (neurospheres). הגדל את השקיפות של החתך השני תחת לשונית התמונה (image tab), פתח את הגדרות סיבוב התמונה ובחר באפשרות "שרירותי" (arbitrary).

סובב את החתך השני עד שתוכל לזהות נקודות של רציפות גיאומטרית ומבנית בין התמונות. חזור על הפעולה עבור כל החתכים הסדרתיים, ושמור כל חתך כשכבה נפרדת. ודא שכל שכבת תמונה המתאימה לניגודיות פאזה (phase) ולביטוי חלבונים מקושרת, כך שכל הסיבובים עבור כל ערוץ יבוצעו בו-זמנית.

צרו ב-Maya מישור בעל פרופורציות זהות לקובץ הפוטושופ, בהתאם לשורת הסטטוס בממשק המשתמש של Maya. שנו את הגדרת סרגל התפריטים מברירת המחדל של אנימציה (animation) למשטחים (surfaces). השתמשו בכדור תת-חלוקה פרימיטיבי (primitive subdivision sphere) כדי ליצור את גוף התא, כאשר הכדור נבחר.

התחילו להוות מניפולציה על הקודקודיים שלו על ידי לחיצה ימנית עם לחצן העכבר הימני על האובייקט ובחירה ב-vertex מהתפריט הסימון. לאחר מכן, פרטו את פני השטח של הכדור על ידי שינוי רמת התצוגה מהתפריט הסימון תחת לשונית ה-subdivision surfaces של התפריט הראשי. פתחו את תיבת אפשרויות ה-collapse hierarchy והגדירו את מספר הרמות לשתיים.

בצעו קריסה (Collapse) של הכדור. שנו את סרגל התפריטים מ-surfaces ל-polygons כאשר הכדור בחור. פתחו את כלי ה-sculpt geometry מלשונית ה-mesh בתפריט הראשי.

שכללו את פני התא לצורתו הסופית. השתמשו בסט כלי הפיסול הגאומטרי (sculpt geometry) מתוך לשונית הגדרות הכלים. חזרו על תהליך זה עבור כל תא בטיפולוגיה שלכם כדי לסמל את המגוון של תאי המוצא הנוכחים בנוירוספירות.

בהדגמה זו, 10 תאי פרוגניטור שונים יהוו את הבסיס לספירה העצבית. בחרו את טיפולוגיית התאים והקפיאו את התמירות עם התאים של הטיפולוגיה שלכם. שני שיידרים למשטח (surface shaders) יעוצבו כדי לייצג הן תאים המבטאים את החלבון connects in 29 והן תאים שבהם החלבון אינו קיים.

פתחו את חלון ה-hyper shade מרכיב העריכה של רינדור החלונות (windows rendering editor) בתפריט הראשי. בחרו ב-ramp shader מלשונית חומרי השטח (surface materials). פתחו את עורך המאפיינים (attribute editor) והגדירו את מאפייני הצבע של השיידר, ה-incandescent, ה-ambient color, ה-bump, ה-map וה-specular color.

שייכו טקסטורת Brownian 3D לצומת הצבע הסביבתי (ambient color node) וטקסטורת פרקטל 2D לצומת מיפוי הבליטות (bump mapping node). בחרו את חיבורי הקלט והפלט של השיידר שהתקבל וייצאו את הרשת שנבחרה. בחרו את טיפולוגיית התא ופתחו את תיבת אפשרויות הייצוא של הבחירה.

בחרו בסוג הקובץ Maya A-S-C-I-I ובטלו את סימון תיבת ה-include these inputs תחת export selection. פתחו את קובץ החתכים הסדרתיים המיושרים בתוכנת Adobe Photoshop. קבעו מקרא של סימוני עיפרון כדי לסמן את מיקומו של כל תא מקור (progenitor cell) בחתכים הסדרתיים.

בהדגמה זו, נעשה שימוש במקרא הכולל שלושה סממנים: ריבוע מלא, ריבוע עם קו מקווקו וריבוע עם איקס, כדי לציין אם תא נמצא במקטע אחד, שניים או שלושה.

מקרא סימונים זה מוגדר כך שצבע אדום מייצג תאים המבטאים conexion 29 וצבע לבן מייצג תאים שאינם מבטאים Conexion 29. הפעילו את שכבת הפאזה והתחילו לסמן את מרכזו של כל תא פרוגניטורי באמצעות סימון עיפרון לבן. השתמשו בשכבה נפרדת בתוך תיקיות הSections כדי לבנות את המפות שלכם.

עברו בין החתכים כדי לאתר את מיקום התאים, תוך הבטחה שתאים המופיעים ביותר מחתך אחד יסומנו כראוי. כאשר שכבת CX 29 מופעלת, בחרו את התאים הנמצאים באזורים שבהם CX 29 מבוטא באופן חיובי.

בחרו בפקודת ה-fill (מילוי) מתוך לשונית העריכה (edit) בשורת התפריטים הראשית של Photoshop ושנו את הקווים הלבנים לאדומים לאחר השלמת המפות. שמרו כל חלק כתמונת JPEG נפרדת בתיקיית תמונות המקור (source images) של פרויקט Maya. כדי לבצע זאת, תחילה יש ליצור פרויקט Maya חדש משורת המצב בממשק המשתמש של Maya.

שנה את הגדרת האנימציה של סרגל התפריטים מברירת המחדל ל-polygons וייבא את המישורים. בצע ma וסרגל קנה מידה. קבצי ma מתיקיית ה-projects seen כאשר המישור נבחר.

הקצו Lambert shader על ידי לחיצה באמצעות המקש הימני של העכבר על האובייקט ופתיחת הלשונית assign new material בעורך התכונות (attribute editor). לחצו על התיבה המשובצת מימין למאפיין הצבע של החומרים בתפריט הנפתח. בחרו ב-file מסעיף ה-2D texture תחת סעיף ה-file בעורך התכונות.

לחצו על סמל הקובץ מימין למאפיין שם התמונה. בחרו את הסקציה הראשונה מתיקיית תמונות המקור. העבירו את המצלמה של חלון סביבת העבודה מתצורת הפרספקטיבה לתצורת עלה אורתוגרפית (Top view) כברירת מחדל על ידי פתיחת הלשונית של פאנל זה.

בחרו את כלי יצירת הפוליגון (create polygon) מלשונית הרשת (mesh) בתפריט הראשי ועקבו אחר קווי המתאר של החתך. בחרו את המפה הראשונה מתיקיית תמונות המקור והקצו אותה למישור הפוליגון שנוצר. לאחר ביצוע השלבים שנקבעו ליצירת מישור הפוליגון כאשר האובייקט נבחר, בחרו ב-UV מתפריט הסימון על ידי לחיצה ימנית עם העכבר על המישור.

בחר את כל נקודות ה-UV של המישורים ופתח את עורך טקסטורת ה-UV מלשונית windows של התפריט הראשי, ושנה את קנה המידה של ה-UVS באופן פרופורציונלי כך שיתאימו למישור החתך. חזור על תהליך זה עבור כל חלק של כדור ה-neuros, תוך וידוא שהמרווחים בין כל חלק תואמים לגובה של סרגל המقياس משורת המצב של ממשק המשתמש של Maya. שנה את סרגל התפריטים מהגדרת ה-animation כברירת מחדל ל-dynamics, והשאר רק את החלק הראשון של כדור ה-neuros גלוי.

הסתירו את כל שאר הסעיפים על ידי שינוי הגדרות התצוגה מתוך לשונית התצוגה בתפריט הראשי; כאשר תיבת האפשרויות של כלי עקומות ה-CV פתוחה, בחרו ב-one linear מהגדרות עקומות ה-CV. צפו בסצנה ממבט עילי (top view camera) והתחילו בסימון נקודות על מפות התאים, תוך יצירת עקומה אחת עבור תאי CX 29 שליליים ועקומה אחת עבור תאי CX 29 חיוביים. העקומות שהתקבלו הן שטוחות כאשר צופים בהן ממבט צדי (side view camera).

העריכו את עובי החתכים על ידי הזזת נקודות העקומה בציר Y, תוך שימוש בסרגל המقياس כמדריך. חזרו על תהליך זה עבור כל חתך של ה-neuros sphere.

ייבאו את קובץ ה-cell typology.ma מתיקיית ה-scenes של הפרויקט ושכפלו את ה-cell typology עבור ה-CX 29 negative וה-CX 29 positive.Progenitors. פתחו את חלון ה-hyper shade דרך לשונית ה-rendering editors בתפריט ה-windows הראשי.

ייבאו את השיידרים שנבנו קודם לכן והקצו אותם לתאי הטיפולוגיה מחלון ה-outliner. הסירו את שם הקובץ מתחילתם של האובייקטים המיובאים. פעולה זו תהיה חשובה בשלבים מאוחרים יותר של תהליך המידול.

בחרו בלשונית החלקיקים (particles) מהתפריט הראשי וצרו פולט חלקיקים עבור עקומת ה-CV הראשונה. פתחו את לשונית צורת החלקיקים (particle shape one) ותחת מאפייני פליטה (emission attributes), שנו את מספר המקסימום (max count) ממינוס אחת למספר הנקודות בעקומה הראשונה שלכם. בלשונית מאפייני רינדור (render attributes), שנו את סוג רינדור החלקיקים (particle render type) ל-blobby surface.

לחצו על תיבת סוג הרינדור הנוכחית למטה ושנו את רדיוס החלקיקים ל-0.01. הצמידו את החלקיקים לקודקודי העקומה על ידי בחירה תחילה בחלקיקים, ולאחר מכן בחירה של העקומה תוך לחיצה על מקש ה-Shift.

פתחו את אפשרויות המטרה (goal options) מתוך לשונית החלקיקים (particles) בתפריט הראשי והגדירו את משקל המטרה ל-1. לחצו על create. בחרו את התאים ממספר 1 עד 10 לפי הסדר בחלון ה-outliner, ופתחו את תיבת אפשרויות ההחלפה המיידית (in instant replacement options) מתוך לשונית החלקיקים בתפריט הראשי.

בתיבת אובייקטי המופעים (instance objects), כל 10 התאים צריכים להופיע ברשימה לפי הסדר. בחרו את שם צורת החלקיק הנכונה מרשימת הגלישה של לשונית אובייקט החלקיק למופע (particle object to instance). לחצו על create. כברירת מחדל, רק התא הראשון שנבחר יחליף את החלקיקים לאורך העקומה; כדי שכל 10 התאים יופיעו ויחליפו זה את זה באופן אקראי בין החלקיקים, יש להשתמש בביטוי (expression).

ביטוי שני יבטיח שהתאים יפלוט באופן אקראי באותה צורה בכל פעם. שורת הבחירה (range slider) ממוקמת מחדש כאשר הפולט (emitter) נבחר. פתח את עורך המאפיינים בלשונית בצורת חלקיק תחת הוספת מאפיין דינמי (add dynamic attribute).

לחצו על התיבה הכללית תחת long name. כתבו random underscore index ב-attribute type, שנו את הבחירה מ-scaler ל-per particle array ולחצו על add בלשונית per particle array attributes. תיבת random underscore index נוספה.

לחצו באמצעות המקש הימני של העכבר על השטח הריק ובחרו "create expression" מתיבת הבחירה. הקלידו את הטקסט הבא בתיבת הביטוי כדי להשלים את הביטוי. פתחו את הלשונית "instant search geometry replacement" בעורך התכונות (attribute editor) ובאפשרויות הכלליות (general options) בחרו ב-"object index".

בחר אינדקס קו תחתון אקראי מרשימת הבחירה. העבר את סרגל הזמן לפריים הראשון ולחץ על play. סוגי התאים מפוזרים כעת באופן אקראי בין החלקיקים.

חזור על תהליך זה עבור כל חלק של ה-neuros sphere. ודא שכל מופע חדש של פולט (emitter) וכל אינדקס אקראי מובדלים על ידי שם ומאורגנים כראוי בחלון ה-outliner ברינדור. באמצעות חלקם של הגדרות הרינדור (render settings window), שנה את הרינדור מ-Maya software ל-mental ray.

פתחו את לשונית האיכות (quality) ותחת מעקב קרניים (ray tracing) שנו את הגדרת ההחזר (reflection) לאפס. פתחו את לשונית חוצץ הפריימים (frame buffer) ושנו את חיתוך הצבע (color clip) מ-raw ל-alpha ובטלו את הסימון ב-Pre multiply.

פתחו את עורך השכבות של תיבת הערוצים (channel box layer editor) ושנו את הגדרות עורך השכבות מ-display ל-render. בחרו את התאים המיובאים של הטיפולוגיה, לחצו על האייקון ליצירת שכבה חדשה והקצאת האובייקטים שנבחרו (create new layer and assign selected objects), ושנו את שם השכבה ל-ambient occlusion.

לחצו על המקש הימני של העכבר מעל השכבה שנוצרה זה עתה, ובחרו "attributes" מהתפריט שמימינו לתיבת ה-render layer. לחצו על כפתור ה-presets ובחרו "occlusion" מרשימת הגלילה. בחרו בלשונית MIB_AMB_occlusion 1 ושנו את מספר הדגימות (samples) מ-16 ל-256.

פתח מחדש את עורך השכבות של תיבת הערוצים (channel box layer editor) ותחת לשונית האפשרויות, פתח את תיבת האפשרויות של "render all layers", בחר ב-composite והשאר את שכבת ה-ambient occlusion בחירה. שנה את ההגדרה מ-normal ל-multiply מהתיבה הנפתחת שמעל רשימת השכבות, ובצע רינדור של שני מעברים (passes) עבור כדור הנוירונים – פעם אחת כאשר שכבת ה-ambient occlusion מופעלת ופעם אחת כאשר שכבת ה-master מופעלת. שמור את התמונות כקבצי IFF בתיקיית התמונות של הפרויקט.

פתחו את שתי התמונות ב-Adobe Photoshop. מקמו את שכבת ה-ambient occlusion מעל שכבת ה-master והגדירו אותה כ-multiply. צרו רקע ואחדו את השכבות (flatten).

הרגע הדגמנו כיצד לגדל תאי עצב ממקור היפוקמפלי כנוירוספירות, כיצד לבצע חיתוך סדרתי של תרבית נוירוספירות באמצעות קריוסטט, וכיצד לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית לחלבון נבחר. כמו כן, הדגמנו כיצד למדל את המיקום המרחבי של ביטוי החלבון בשלושה ממדים, באמצעות שילוב של רישום (registration) של תרביות תאים ותוכנה למידול תלת-ממדי.

אנו מקווים שמידע זה יסייע לכם, ובתשלומי הצלחה בניסוייכם.