Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

אני טרוי גאסאי. אנחנו הולכים לדבר על בדיקת פרוסה אורגנוטיפית ששוכללה במעבדה שלי במהלך השנים האחרונות. בן ז'קט במעבדה שלי ידגים לכם כיצד מבוצעת בדיקה זו.

בדיקת הפרוסה האורגנוטיפית של המוח שלאחר הלידה היא שיטה רבת עוצמה לבדיקת גורמים שונים והתפקיד על נדידת עצבים במוח שלאחר הלידה ובזרם הנדידה של TRO. היי, אני בן ג'קיי. אני עמית פוסט-דוקטורט במעבדת ד"ר טרוי gge במכללה לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת צפון קרוליינה, ואני כאן היום כדי להראות לכם כיצד אנו מבצעים השתלת רקמות צולבות בין פרוסות מוח אורגנוטיפיות של עכבר על מנת לדמיין נוירובלסטים נודדים במוח שלאחר הלידה.

יש לבצע את כל הטכניקות המתוארות בסרטון זה בסביבה סטרילית, רצוי מכסה זרימה למינרי באמצעות כלים מעוקרים. טיפה של 150 מיקרוליטר של פרוסה בינונית מונחת במרכז הכוס, בחלק התחתון של הכלי עם מזרק חד פעמי המצויד במחט 23. מספר כתמי דבק מונחים מחוץ להחלקת הכיסוי התחתון של הזכוכית העגולה תוך השארת צד אחד לא מודבק להחלפת נוזלים A.לאחר מכן מניחים בעדינות קרום נקבוביות גרעיניות על גבי המדיום באמצעות מיקרו מלקחיים תוך הקפדה על בועות אוויר לא נלכדות מתחת לממברנה.

לאחר מכן משתמשים במלקחיים המעוקלים כדי לשטח את כתמי הדבק ולאבטח את הממברנה במקומה. מיליליטר אחד של מדיום פרוסה מתווסף על גבי הממברנה, ולבסוף מניחים את הכלים בחממה עד שהם מוכנים לשימוש. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר מכינים פרוסות מעכברים צעירים לאחר הלידה, P אחד עד P עשר תחילה, הראש מיוצב על ידי החזקת החוטם בעזרת מיקרו מלקחיים.

העור נכרת לאורך מהצוואר ועד החוטם. הקרקפת מתקלפת כדי לחשוף את העצם והגולגולת נחתכת לאורך ולפנים החל מעצם החזה על ידי ביצוע חתך מדיאלי אחד ושני חתכים לרוחב, אחד מכל צד. יש להקפיד למזער את המגע עם רקמת קליפת המוח הבסיסית.

כאשר דשי הגולגולת מוסרים מהמוח כדי לשפר את יציבות הרקמה. במהלך חתך הוויברם, ההיבטים הצדדיים ביותר והקודאליים של המוח מוסרים בעזרת סכין גילוח. שני חצאי הכדור נשלפים בזהירות מהגולגולת ומניחים את המשטח המדיאלי למטה בתבנית הטבעה.

הם מכוסים מיד בג'ל ורדים מומס של 3% DNA בדרגת AGA מומס במאגר הכנת רקמות הנשמר ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שתי דקות של ייצוב על משטח אופקי שטוח. כדי להבטיח התקשות אחידה של ורדי האגה, התבניות ממוקמות על קרח להשלמת ההגדרה.

לאחר שהג'ל המכיל את ההמיספרות מתייצב, הוא מוסר מהתבנית וגוזם סביב רקמת המוח. לאחר מכן, הרקמה המוטמעת בג'ל מותקנת על דיסק הדגימה של גוון הרטט עם משטח מדיאלי כלפי מעלה ומאובטחת עם דבק ציאנואקרילט. לאחר מכן הדיסק מותקן במגש דגימת הרטט המלא במדיום להכנת רקמות קרות כקרח, והמוח נחתך בעובי של 150 מיקרומטר.

לאחר שחרור פרוסות המכילות RMS מהלהב, הן נשלפות בזהירות באמצעות מרית שטוחה קטנה ומונחות שטוחות במרכז כלי התרבות. זה קריטי שהטיפול בפרוסות יישמר למינימום מכיוון שהרקמה שבירה מאוד. כמות המדיום בכלי התרבות מותאמת לרמה המספיקה כדי לכסות את חלקי המוח תוך מניעת תנועתם.

הכלים מסומנים ומועברים לחממה. מוחות התורמים מוכנים באופן דומה לזה של מוחות המקבלים, אלא שהחלקים נחתכים ב-250. עובי מיקרומטר ופרוסות נאספים בקרח.

הכנת רקמות קרות. פרוסות חיץ ממוקמות מיד תחת מיקרוסקופ מנתח עם יכולת פלואורסצנטית אפי. ה-RMS נראה כמבנה אפור בצורת U המשתרע מהאזור התת-אפנדימלי ועד לפקעת הריח.

ה-RMS הוא מיקרו-דיסקט בעדינות באמצעות מיקרו מלקחיים. מלקחיים אחד משמש לייצוב הפרוסה ואילו השני משמש לביצוע חתכים קטנים סביב ה-RMS עד לשחרורו מהפרוסה. לאחר מכן חותכים את ה-RMS שנכרת ל-x explan קטן בקוטר של כ-200 עד 500 מיקרומטר.

בדוגמה הזו, חצילים מוכנים מעכברים שמבטאים את החלבון הפלואורסצנטי האדום, זכוכית עגבניות TD. כלים תחתונים המכילים פרוסות מארח מוציאים מהחממה ומונחים מתחת למיקרוסקופ החיתוך באמצעות אור נראה. חתך קטן נעשה בקטע הראשוני של ה-RMS ובאמצעות צינור המצויד בקצה של 20 מיקרוליטר, RMS Explan של תורם יחיד מועבר לאתר החרוט ב-RMS המארח.

האקספלן נדחף בעדינות לתוך החתך כדי ליצור מגע בין שתי הרקמות. כדי להבטיח שמגע זה יציב, האקספלן נדחף מעט פנימה בין הפרוסה לממברנה הגרעינית המסכנה. לאחר מכן מחזירים את הכלים לחממה למשך שעה לפחות כדי לאפשר לחלקים להתיישב על הממברנה.

נוירובלסט אמור להתחיל לנדוד מהאקספלן ל-RMS המארח לאחר כשעה עד שעתיים. נדידת תאים מוצגת בצורה הטובה ביותר על ידי שימוש במטרות כוח של 20 מרחקי עבודה ארוכים במיוחד. הנושאים המתורבתים ברקמה מועברים מהאינקובטור לתא מודגר במיקרוסקופ.

ניתן לדמות נוירובלסט פלואורסצנטי במרווחים הנעים בין אפס ל-10 דקות בהתאם לסוג הניתוח הרצוי. פרוטוקול תרבית הפרוסות האורגנית הטיפוסית שלנו נבדק ביסודיות ומותאם במהלך השנים האחרונות לעקביות בדפוס הנדידה והכיוון ב-RMS. בדוגמה זו, ניתוח של תאים מהגרים מאקספלן, המתקבל מעכברים שבהם עגבניות TD מתבטאות מתחת לקן במקדם מגלה הגירה מכוונת ומהירה מאוד לתוך RMS המארח.

הגדלה גבוהה. ניתוח זמן-lapse מראה רזולוציה מצוינת של כל אורכו של נוירובלסט נודד במהלך סשן הדמיה של 20 דקות. לאחר השלמת ההדמיה, פרוסות העור מקובעות בקרח, קר ומוכן טרי, 4% פרפורם, אלדהיד ואימונוסטיין עבור רכיבים שונים של זרם הנדידה.

במקרה זה, אסטרוציטים חיוביים ל-GFAP בכחול וכלי דם חיוביים CD 31 בירוק נחשפים באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית, ניתוח הגדלה גבוהה של פרוסות צבועות עבור חלבוני השלד הציטו-שלד אקטין בכחול, וטובולין בירוק חושף ביטוי לא אחיד של רכיבים אלה על ידי התא. בעיצומה של הגירה. הפרוטוקול שלנו מציג כמה אתגרים הדורשים סבלנות, תרגול וזמן מחויב הן להכנה והן לניתוח התוצאות שלך.

אז הנה כמה הצעות שימושיות שיעזרו לך להפיק את התוצאות הטובות ביותר מהניסויים שלך. מניסיוננו, עכברים בטווח הגילאים P 1 עד P 10 מספקים את התוצאות הטובות ביותר. התאמת גיל בין מוחות התורם והמקבל משפרת גם את יכולת השחזור של הניסויים.

מכיוון שרוב הריאגנטים ומנות התרבות חייבים להיות מוכנים טריים, בדיקת הפרוסות שלנו דורשת מספר שעות של הכנה והדמיה ללא הפרעה ביום אחד. ברגע שהמוחות נקצרים, יש לבצע את שלבי התוצאה מהר ככל האפשר. בין עריפת הראש להכנת פרוסות, יש לבצע את כל השלבים באמצעות קרח, ריאגנטים קרים ומניפולציה של רקמות יש למזער למינימום על מנת למנוע שיבושים אנטומיים.

הכלים המשמשים לנתיחות אלה צריכים להיות סטריליים ושמורים למניפולציות רקמות חיות בלבד. לעולם אל תשתמש בכלים שהיו אי פעם במגע עם מקבעים כגון פורמלדהיד. הפרוסות קיימות בדרך כלל עד 36 שעות עם ירידה ניכרת בנדידה, במהירות ובכיוון בין 24 ל-36 שעות.

היזהר ממגבלה זו בעת תכנון הניסויים והניתוח שלך.