Name: Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: למד שיטת חיתוך אורגנוטיפית לדימות נדידת נוירובלסטים במוח לאחר הלידה. הפרוטוקול משתמש בהשתלת רקמת צלב בין פרוסות מוח עכברים לצפייה ברזולוציה גבוהה בזרם הנדידה הרוסטרלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים דן McWhorter עבור המספרת על פרוטוקול בסרטון. עבודה זו נתמכת על ידי NIH גרנט 5R01NS062182, מענק הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות, מוסדיים וקרנות הוענק HTG.

<ol><li>Ghashghaei, H. T., Lai, C., Anton, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+adult+brain%3A+are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the adult brain: are we there yet.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 141-151 (2007).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neocortex%3A+a+perspective+from+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 724-735 (2009).</li>
<li>Jaglin, X. H., Chelly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-related+cortical+dysgeneses%3A+microtubule+dysfunction+underlying+neuronal+migration+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tubulin-related cortical dysgeneses: microtubule dysfunction underlying neuronal migration defects.</a> Trends Genet. 25, 555-566 (2009).</li>
<li>Carro, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+network+for+mesenchymal+transformation+of+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The transcriptional network for mesenchymal transformation of brain tumours.</a> Nature. 463, 318-325 (2010).</li>
<li>Wu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+guidance+of+neuronal+migration+in+the+olfactory+system+by+the+protein+Slit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directional guidance of neuronal migration in the olfactory system by the protein Slit.</a> Nature. 400, 331-336 (1999).</li>
<li>Hu, H., Tomasiewicz, H., Magnuson, T., Rutishauser, U., U, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+polysialic+acid+in+migration+of+olfactory+bulb+interneuron+precursors+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The role of polysialic acid in migration of olfactory bulb interneuron precursors in the subventricular zone.</a> Neuron. 16, 735-743 (1996).</li>
<li>Shapiro, E. M., Gonzalez-Perez, O., Garcia-Verdugo, M. anuel, Alvarez-Buylla, J., &amp, A., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+the+migration+of+neuronal+precursors+generated+in+the+adult+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of the migration of neuronal precursors generated in the adult rodent brain.</a> Neuroimage. , (2006).</li>
<li>Vreys, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+visualization+of+endogenous+neural+progenitor+cell+migration+along+the+RMS+in+the+adult+mouse+brain%3A+validation+of+various+MPIO+labeling+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">MRI visualization of endogenous neural progenitor cell migration along the RMS in the adult mouse brain: validation of various MPIO labeling strategies.</a> Neuroimage. 49, 2094-2103 (2010).</li>
<li>Davenne, M., Custody, C., Charneau, P., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+migrating+neurons+in+the+mammalian+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of migrating neurons in the mammalian forebrain.</a> Chem. Senses. 30, Suppl 1. 115-116 (2005).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subventricular+zone+en-face%3A+wholemount+staining+and+ependymal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The subventricular zone en-face: wholemount staining and ependymal.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Shen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche%3A+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li>
<li>Tavazoie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+vascular+niche+for+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A specialized vascular niche for adult neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cells+Confer+Unique+Pinwheel+Architecture+to+the+Ventricular+Surface+in+Neurogenic+Regions+of+the+Adult+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cells Confer Unique Pinwheel Architecture to the Ventricular Surface in Neurogenic Regions of the Adult Brain.</a> Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).</li>
<li>Polleux, F. &amp, Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+slice+overlay+assay%3A+a+versatile+tool+to+study+the+influence+of+extracellular+signals+on+neuronal%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal.</a> Sci. STKE. , L9-L9 (2002).</li>
<li>Murase, S. &amp, Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleted+in+colorectal+carcinoma+and+differentially+expressed+integrins+mediate+the+directional+migration+of+neural+precursors+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).</li>
<li>Suzuki, S. O. &amp, Goldman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cell+populations+in+the+early+postnatal+subventricular+zone+take+distinct+migratory+pathways%3A+a+dynamic+study+of+glial+and+neuronal+progenitor+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple cell populations in the early postnatal subventricular zone take distinct migratory pathways: a dynamic study of glial and neuronal progenitor migration.</a> J. Neurosci. 23, 4240-4250 (2003).</li>
<li>Ghashghaei, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuregulin-ErbB4+interactions+on+the+proliferation+and+organization+of+cells+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">The role of neuregulin-ErbB4 interactions on the proliferation and organization of cells in the subventricular zone.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 1930-1935 (2006).</li>
<li>Khodosevich, K., Seeburg, P. H., Monyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+signaling+pathways+in+migrating+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Major signaling pathways in migrating neuroblasts.</a> Front Mol. Neurosci. 2, 7-7 (2009).</li>
<li>Jacquet, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuronal+proliferation%2C+migration+and+differentiation+in+the+postnatal+brain+using+equine+infectious+anemia+virus-based+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuronal proliferation, migration and differentiation in the postnatal brain using equine infectious anemia virus-based lentiviral vectors.</a> Gene Ther. 16, 1021-1033 (2009).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי צפון קרוליינה סטייט קולג&#39; שלה לרפואה וטרינרית. אין ניגודי אינטרסים הכריז.

נדידת נוירונים ב-RMS היא מרכיב חיוני של neurogenesis הלידה של נורות ההרחה 1. הגירה דרך RMS מתרחשת במטוס משיק אל פני השטח של המוח. Neuroblasts בעקיפין נודדות נבדלים רדיאלית נודדות תאים בהתבסס על המיקום של מקור אב שלהם, כמו גם גורלם השונה של מוצרים העצבית הסופי 1, 2, 3. אוכלוסיית טהור יחסית של תאים נודדים בעקיפין ב RMS לאחר הלידה הופך האזור הזה להגדרה אנטומית פלטפורמה אופטימלית לחקר המנגנונים של הגירה משיק. פענוח המנגנונים תאית ומולקולרית של הגירה העצבית היא קר...

assay slice organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis במוח לאחר הלידה תלוי ותחזוקה של שלושה אירועים ביולוגיים: הפצת ובתאים, הגירה של neuroblasts, כמו גם ההבחנה והאינטגרציה של נוירונים חדשים לתוך מעגלים עצביים הקיימים. עבור neurogenesis הלידה של נורות חוש הריח, אירועים אלה הם נפרדים בתוך שלושה תחומים מובחנים מבחינה אנטומית: התפשטות מתרחשת בעיקר באזור subependymal (SEZ) של החדרים לרוחב, נודדות neuroblasts לעבור דרך הנחל נודדות מקורי (RMS), ו נוירונים חדשים להבדיל לשלב בתוך נורות חוש הריח (OB). שלושת התחומים לשמש פלטפורמות אידיאליות ללמוד את מנגנוני הסלולר, המולקולרית, ואת פיזיולוגיים המווסתים את כל האירועים ביולוגי מובהק. מאמר זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור רקמת המוח לאחר הלידה, שבה התנאים תאיים מקרוב לחקות את הסביבה vivo להעברת neuroblasts. אנו מראים כי assay שלנו מספק לתנועה אחידה, אוריינטציה, ומהירה של neuroblasts בתוך RMS. Assay זה יהיה מתאים במיוחד ללימוד תקנה תא אוטונומית ובלתי אוטונומי של הגירה העצבית על ידי ניצול צולבות השתלת גישות מעכברים על רקע גנטי שונה.

פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

נוירוגנזה במוח לאחר הלידה תלויה בשמירה על שלושה אירועים ביולוגיים: פרוליפרציה של תאי אב, נדידה של נוירובלסטים, כפי ש...

אני טרוי גסאי. אנחנו הולכים לדבר על בדיקת פרוסות אורגנוטיפית ששופרה במעבדה שלי במהלך השנים האחרונות. בן ג'קט מהמעבדה שלי ידגים לכם כיצד מבוצעת בדיקה זו.בדיקת פרוסות אורגנוטיפיות של המוח לאחר הלידה היא שיטה רבת עוצמה לבחינת גורמים שונים ותפקידם בנדידה עצבית במוח לאחר הלידה ובזרם הנדידה של ה-TRO. שלום, אני בן ג'קאי. אני עמית פוסט-דוקטורט במעבדתו של ד"ר טרוי ג'ג במכללה לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת מדינת צפון קרוליינה, ואני כאן היום כדי להראות לכם כיצד אנו מבצעים השתלת רקמה צולבת בין פרוסות אורגנוטיפיות של מוח עכבר, במטרה להדמות נוירובלסטים נודדים במוח לאחר הלידה.יש לבצע את כל הטכניקות המתוארות בסרטון זה בסביבה סטרילית, רצוי במנדף זרימה למינרית תוך שימוש בכלים שעברו סטריליזציה. טיפה של 150 µL של תמיסת slice מושמת במרכז החלק התחתון מזכוכית של הצלחת באמצעות מזרק חד-פעמי המצויד במחט gauge 23. מספר נקודות דבק מונחות מחוץ לכיסוי הזכוכית העגול של התחתית, כאשר צד אחד נשאר ללא דבק לצורך חלפת נוזלים A. לאחר מכן, ממбраנה של nuclear pore מונחת בעדינות על גבי התמיסה באמצעות פינצטה מיקרוסקופית, תוך וידוא שבעבועות אוויר לא נלכדו מתחת לממбраנה.לאחר מכן משתמשים בפינצטה קמורה כדי להשטיח את נקודות הדבק ולקבע את הממברנה במקומה. מתווסף 1 mL של תמיסת slice medium מעל הממברנה, ולבסוף, הצלחות מוcephalas בתוך אינקובטור עד למועד השימוש. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר הפרוסות מוכנות מעכברים צעירים לאחר לידה, P1 עד P10; ראשית, מייצבים את הראש על ידי החזקת האף עם מיקרו-פינצטה.העור נגזר לאורכו מהצוואר ועד לחרטום. קרקפת הראש מקולפת כדי לחשוף את העצם, והגולגולת נחתכת לאורכה ובכיוון קדמי, החל מה-sternum magna, על ידי ביצוע חתך מדיאלי אחד ושני חתכים לטרליים, אחד בכל צד. יש לנקוט זהירות כדי לצמצם את המגע עם הרקמה הקורטיקלית שמתחתיה.את כיסויי הגולגולת מסירים מהמוח כדי לשפר את יציבות הרקמה. במהלך החיתוך במיקרוטום רטט (vibrotome), מסירים את ההיבטים הלטרליים והזנביים ביותר של המוח באמצעות להב תער. את שני ההמיספרים מוציאים בזהירות מהגולגולת ומניחים אותם בתבנית השכבה כאשר הפני השטחיים הפנימיים (medial surface) פונים כלפי מטה.הם מכוסים מיד בג'ל agarose בדרגת DNA בריכוז 3% מומס במאפר תכשיר רקמה, השומרים על טמפרטורה של 37 °C. לאחר שתי דקות של התייצבות על משטח אופקי שטוח, וכדי להבטיח התקשחות אחידה של ה-agarose, מניחים את התבניות על קרח להשלמת תהליך ההתגבשות.לאחר שהג'ל המכיל את חצאי המוח התקשח, מוציאים אותו מהתבנית וגוזרים את השוליים מסביב לרקמת המוח. הרקמה הטמונה בג'ל מורכבת על דיסק הדגימות של הוibratome כאשר הפני השטחי המדיאלי פונה כלפי מעלה, ומקובעת באמצעות דבק ציאנואקרילט. לאחר מכן, מותקנת הדיסק במגש דגימות הוibratome המלא בתמיכה להכנת רקמות קרה מאוד, והמוח נחתך בעובי של 150 micrometer.לאחר שפרוסות ה-RMS משתחררות מהלהב, הן נשאבות בזהירות בעזרת שפכטל שטוח קטן ומונחות בצורה שטוחה במרכז צלחות התרבית. קריטי לצמצם ככל האפשר את הטיפול בפרוסות, מכיוון שהרקמה שבירה מאוד. כמות המצע בצלחות התרבית מותאמת לרמה המספיקה לכיסוי חתכי המוח תוך מניעת תזוזתם.מסמנים את הצלחות ומעבירים אותן לאינקובטור. מכינים את מוחות התורם באופן דומה למוחות המקלטים, למעט העובדה שהחתכים נגזרים בעובי של 250 Micrometer והפרוסות נאספות בקרח.הכנת רקמה קרה. פרוסות בבופר מונחות מיד תחת מיקרוסקופ דיסקציה בעל יכולת פלואורסצנציה אפיגנסטית. ה-RMS נראה כמבנה אפור בצורת U הנמתח מהאזור הסוב-אפנדימלי ועד לנורון הריח (olfactory bulb).מבצעים מיקרו-דיסקציה עדינה של ה-RMS באמצעות פינצטות מיקרוסקופיות. פינצטה אחת משמשת לייצוב הפרוסה, בעוד שהשנייה משמשת לביצוע חתכים קטנים מסביב ל-RMS עד לשחרורו מהפרוסה. את ה-RMS שהוצא חותכים לאחר מכן למקטעים קטנים בקוטר של כ-200 עד 500 micrometers.בדוגמה זו, מוכנים השתלים מעכברים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי האדום, TD tomato glass. צלחות תחתונות המכילות פרוסות מאכסן מוצאות מהאינקובטור ומונחות תחת מיקרוסקופ dissection תוך שימוש באור נראה. חתך קטן מבוצע במקטע הראשוני של ה-RMS, ובאמצעות פיפטור המצויד בטיפ של 20 µL, מועבר Explan בודד של RMS מתורם לאתר החתך ב-RMS של המאכסן.את השתל דוחפים בעדינות לתוך החתך כדי ליצור מגע בין שתי הרקמות. כדי להבטיח שמגע זה יהיה יציב, דוחפים את השתלים מעט בין הפרוסה לבין הממברנה נקבובית הגרעין. לאחר מכן מחזירים את הצלחות לאינקובטור למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לחתכים להתמקם על הממברנה.הנוירובלאסטים צפויים להתחיל לנדוד מהאקספלאנט אל תוך ה-RMS של המאכסן לאחר כשעה עד שעתיים. נדידת התאים נראית בצורה הטובה ביותר באמצעות עדשות אובייקטיביות בהגדלה של 20 עם מרחק עבודה ארוך במיוחד. רקמות התרבית מועברות מהאינקובטור לתא אינקובציה המותקנת על המיקרוסקופ.ניתן לצלם נוירובלסטים פלואורסצנטיים במרווחי זמן הנעים בין אפס ל-10 דקות, בהתאם לסוג הניתוח הרצוי. פרוטוקול תרבית פרוסות האורגניות התואמיות שלנו נבדק ונאופטימיזה ביסודיות במהלך השנים האחרונות כדי להבטיח עקביות בדפוסי הנדידה ובאוריינטציה ב-RMS. בדוגמה זו, ניתוח של תאים הנודדים מהאקספלנט, שהושג מעכברים שבהם TD tomato מבוטא תחת מקדם nestin, חושף נדידה מהירה בעלת אוריינטציה גבוהה אל תוך ה-RMS של המארח.הגדלה גבוהה. ניתוח של צילומי Time lapse מראה רזולוציה מצוינת של כל אורכו של נוירובלסט נודד במהלך סשן דימוי של 20 דקות. עם השלמת הדימוי, ניתן לקבע את הפרוסות באמצעות Paraformaldehyde 4% טרי שהוכן בקירור, ולבצע צביעה אימונוהיסטוכימית לרכיבים שונים של זרם הנדידה.במקרה זה, אסטרוציטים חיוביים ל-GFAP בכחול וכלי דם חיוביים ל-CD 31 בירוק נחשפים באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית; ניתוח בהגדלה גבוהה של חתכים שנצבעו עבור החלבונים השלדיים actin בכחול ו-tubulin בירוק חושף ביטוי לא אחיד של רכיבים אלו על ידי תא בתהליך נדידה. הפרוטוקול שלנו מציב מספר אתגרים הדורשים סבלנות, תרגול והקדשת זמן הן להכנה והן לניתוח התוצאות.להלן מספר הצעות מועילות שיסייעו לכם להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהניסויים שלכם. מניסיוננו, עכברים בטווח גילאים של P1 עד P10 מספקים את התוצאות הטובות ביותר. התאמת גילים בין מוחות התורם והמקבל משפרת גם היא את השחזוריות של הניסויים.מכיוון שרוב הרכיבים וצלחות התרבית חייבים להיות מוכנים טריים, בדיקת הפרוסות שלנו דורשת מספר שעות של הכנה ודימוג רציפים ביום אחד. לאחר הוצאת המוחות, יש לבצע את השלבים הבאים במהירות רבה ככל האפשר. בין העריפה להכנת הפרוסות, יש לבצע את כל השלבים באמצעות קרח ורכיבים קרים, ויש לצמצם למינימום את המניפולציות ברקמה כדי למנוע שיבושים אנטומיים.הכלים המשמשים לדיסקציות אלו חייבים להיות סטריליים ולשמש למניפולציות ברקמה חיה בלבד. אין להשתמש בכלים שהיו במגע עם מקבעים כגון formaldehyde. הפרוסות הן בדרך כלל חיות למשך עד 36 שעות, כאשר נצפית ירידה ניכרת בנדידה, במהירות ובכיון בין השעה ה-24 לשעה ה-36.יש להביא בחשבון מגבלה זו בעת תכנון הניסויים והניתוחים שלך.

an-organotypic-slice-assay-for-high-resolution-time-lapse-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מציגים שיטה להכין פרוסות organotypic של אמצע ההיריון עוברי עכברים הדמיה טיפוח זמן לשגות תולדה של עצבים היקפיים.

פורסים תרבות Organotypic של ה-GFP-לבטא עוברי עכברים עבור הדמיה בזמן אמת תולדה של עצבים היקפיים

שיטה לייצר פרוסות organotypic מן המוח התיכון E12.5 העוברי Murine מתואר. תרבויות פרוסה organotypic ניתן להשתמש כדי לבחון את התנהגות של נוירונים דופאמינרגיים או נוירונים המוח התיכון הגחון.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

הרקמה העוברית הדמיה בזמן אמת הוא מאתגר לאורך תקופות זמן ארוכות. כאן אנו מציגים assay לניטור שינויים הסלולר משנה הסלולר בחוט השדרה חומוס לתקופות ארוכות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. טכניקה זו יכולה להיות מותאם לאזורים אחרים של מערכת העצבים בעובר המתפתח.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

אנו מתארים פרוטוקול עבור videoimaging בזמן האמת של הנדידה עצבית במוח הקדמי בעכבר. ההגירה של מבשרי נוירונים שכותרת-ויראלי או מושתלים נרשמה בפרוסות חיות חריפות באמצעות הדמית ניאון שדה רחב עם מרווח רכישה מהירה יחסית כדי ללמוד את השלבים השונים של נדידת תאים, כולל את משכי הזמן של שלבי הגירה והנייחת והמהירות הגירה.

הדמית זמן לשגות הגירת Neuroblast בפרוסות חריפות של המוח הקדמי המאוס למבוגרים

Source: Wiegreffe, C., et. al.,  הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017) סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

הגירת neuroblast היא אירוע מהותי בנוירוגנזה לאחר לידה. אנו מתארים פרוטוקול תיוג יעיל של neuroblasts ידי in vivo electroporation לאחר לידה ולאחר מכן להדמיה של ההגירה שלהם באמצעות זמן לשגות הדמיה של פרוסות מוח חריפות. אנו כוללים תיאור לניתוח כמותי של דינמיקת neuroblast ידי מעקב וידאו.

In vivo electroporation ואחרי הלידה וזמן לשגות הדמיה של neuroblast הגירה בעכבר חריפה פרוסות המוח

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה וחזקה לחקר גדילת אקסון באתרו ודינמיקת חרוט גדילה. הוא מתאר כיצד להכין פרוסות מוח חריפות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית ex vivo ומספק צינור ניתוח ידידותי למשתמש.

באתרו הדמיה של גדילה וצמיחה של דינמיקת חרוט אקסון בתרביות פרוסות מוח עובריות אקס-ויוו חריפות

במהלך התפתחות קליפת המוח, נוירונים ותאי גלייה מקורם באזור החדר המצפה את החדר ונודדים לעבר פני המוח. גנים רבים מעורבים בתהליך זה. פרוטוקול זה מציג את הטכניקה לדימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה.

דימות בהילוך מהיר של נוירונים נודדים ואבות גלייה בפרוסות מוח עובריות של עכבר

למד שיטת חיתוך אורגנוטיפית לדימות נדידת נוירובלסטים במוח לאחר הלידה. הפרוטוקול משתמש בהשתלת רקמת צלב בין פרוסות מוח עכברים לצפייה ברזולוציה גבוהה בזרם הנדידה הרוסטרלי.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

גלה סרטונים נוספים