Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה
11 בדצמבר 2010
פרוטוקול זה מתאר assay פרוסה organotypic אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות הדמיה של הגירה neuroblast בזרם נודדות מקורי.
אני טרוי גסאי. אנחנו הולכים לדבר על בדיקת פרוסות אורגנוטיפית ששופרה במעבדה שלי במהלך השנים האחרונות. בן ג'קט מהמעבדה שלי ידגים לכם כיצד מבוצעת בדיקה זו.
בדיקת פרוסות אורגנוטיפיות של המוח לאחר הלידה היא שיטה רבת עוצמה לבחינת גורמים שונים ותפקידם בנדידה עצבית במוח לאחר הלידה ובזרם הנדידה של ה-TRO. שלום, אני בן ג'קאי. אני עמית פוסט-דוקטורט במעבדתו של ד"ר טרוי ג'ג במכללה לרפואה וטרינרית של אוניברסיטת מדינת צפון קרוליינה, ואני כאן היום כדי להראות לכם כיצד אנו מבצעים השתלת רקמה צולבת בין פרוסות אורגנוטיפיות של מוח עכבר, במטרה להדמות נוירובלסטים נודדים במוח לאחר הלידה.
יש לבצע את כל הטכניקות המתוארות בסרטון זה בסביבה סטרילית, רצוי במנדף זרימה למינרית תוך שימוש בכלים שעברו סטריליזציה. טיפה של 150 µL של תמיסת slice מושמת במרכז החלק התחתון מזכוכית של הצלחת באמצעות מזרק חד-פעמי המצויד במחט gauge 23. מספר נקודות דבק מונחות מחוץ לכיסוי הזכוכית העגול של התחתית, כאשר צד אחד נשאר ללא דבק לצורך חלפת נוזלים A. לאחר מכן, ממбраנה של nuclear pore מונחת בעדינות על גבי התמיסה באמצעות פינצטה מיקרוסקופית, תוך וידוא שבעבועות אוויר לא נלכדו מתחת לממбраנה.
לאחר מכן משתמשים בפינצטה קמורה כדי להשטיח את נקודות הדבק ולקבע את הממברנה במקומה. מתווסף 1 mL של תמיסת slice medium מעל הממברנה, ולבסוף, הצלחות מוcephalas בתוך אינקובטור עד למועד השימוש. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר הפרוסות מוכנות מעכברים צעירים לאחר לידה, P1 עד P10; ראשית, מייצבים את הראש על ידי החזקת האף עם מיקרו-פינצטה.
העור נגזר לאורכו מהצוואר ועד לחרטום. קרקפת הראש מקולפת כדי לחשוף את העצם, והגולגולת נחתכת לאורכה ובכיוון קדמי, החל מה-sternum magna, על ידי ביצוע חתך מדיאלי אחד ושני חתכים לטרליים, אחד בכל צד. יש לנקוט זהירות כדי לצמצם את המגע עם הרקמה הקורטיקלית שמתחתיה.
את כיסויי הגולגולת מסירים מהמוח כדי לשפר את יציבות הרקמה. במהלך החיתוך במיקרוטום רטט (vibrotome), מסירים את ההיבטים הלטרליים והזנביים ביותר של המוח באמצעות להב תער. את שני ההמיספרים מוציאים בזהירות מהגולגולת ומניחים אותם בתבנית השכבה כאשר הפני השטחיים הפנימיים (medial surface) פונים כלפי מטה.
הם מכוסים מיד בג'ל agarose בדרגת DNA בריכוז 3% מומס במאפר תכשיר רקמה, השומרים על טמפרטורה של 37 °C. לאחר שתי דקות של התייצבות על משטח אופקי שטוח, וכדי להבטיח התקשחות אחידה של ה-agarose, מניחים את התבניות על קרח להשלמת תהליך ההתגבשות.
לאחר שהג'ל המכיל את חצאי המוח התקשח, מוציאים אותו מהתבנית וגוזרים את השוליים מסביב לרקמת המוח. הרקמה הטמונה בג'ל מורכבת על דיסק הדגימות של הוibratome כאשר הפני השטחי המדיאלי פונה כלפי מעלה, ומקובעת באמצעות דבק ציאנואקרילט. לאחר מכן, מותקנת הדיסק במגש דגימות הוibratome המלא בתמיכה להכנת רקמות קרה מאוד, והמוח נחתך בעובי של 150 micrometer.
לאחר שפרוסות ה-RMS משתחררות מהלהב, הן נשאבות בזהירות בעזרת שפכטל שטוח קטן ומונחות בצורה שטוחה במרכז צלחות התרבית. קריטי לצמצם ככל האפשר את הטיפול בפרוסות, מכיוון שהרקמה שבירה מאוד. כמות המצע בצלחות התרבית מותאמת לרמה המספיקה לכיסוי חתכי המוח תוך מניעת תזוזתם.
מסמנים את הצלחות ומעבירים אותן לאינקובטור. מכינים את מוחות התורם באופן דומה למוחות המקלטים, למעט העובדה שהחתכים נגזרים בעובי של 250 Micrometer והפרוסות נאספות בקרח.
הכנת רקמה קרה. פרוסות בבופר מונחות מיד תחת מיקרוסקופ דיסקציה בעל יכולת פלואורסצנציה אפיגנסטית. ה-RMS נראה כמבנה אפור בצורת U הנמתח מהאזור הסוב-אפנדימלי ועד לנורון הריח (olfactory bulb).
מבצעים מיקרו-דיסקציה עדינה של ה-RMS באמצעות פינצטות מיקרוסקופיות. פינצטה אחת משמשת לייצוב הפרוסה, בעוד שהשנייה משמשת לביצוע חתכים קטנים מסביב ל-RMS עד לשחרורו מהפרוסה. את ה-RMS שהוצא חותכים לאחר מכן למקטעים קטנים בקוטר של כ-200 עד 500 micrometers.
בדוגמה זו, מוכנים השתלים מעכברים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי האדום, TD tomato glass. צלחות תחתונות המכילות פרוסות מאכסן מוצאות מהאינקובטור ומונחות תחת מיקרוסקופ dissection תוך שימוש באור נראה. חתך קטן מבוצע במקטע הראשוני של ה-RMS, ובאמצעות פיפטור המצויד בטיפ של 20 µL, מועבר Explan בודד של RMS מתורם לאתר החתך ב-RMS של המאכסן.
את השתל דוחפים בעדינות לתוך החתך כדי ליצור מגע בין שתי הרקמות. כדי להבטיח שמגע זה יהיה יציב, דוחפים את השתלים מעט בין הפרוסה לבין הממברנה נקבובית הגרעין. לאחר מכן מחזירים את הצלחות לאינקובטור למשך שעה אחת לפחות כדי לאפשר לחתכים להתמקם על הממברנה.
הנוירובלאסטים צפויים להתחיל לנדוד מהאקספלאנט אל תוך ה-RMS של המאכסן לאחר כשעה עד שעתיים. נדידת התאים נראית בצורה הטובה ביותר באמצעות עדשות אובייקטיביות בהגדלה של 20 עם מרחק עבודה ארוך במיוחד. רקמות התרבית מועברות מהאינקובטור לתא אינקובציה המותקנת על המיקרוסקופ.
ניתן לצלם נוירובלסטים פלואורסצנטיים במרווחי זמן הנעים בין אפס ל-10 דקות, בהתאם לסוג הניתוח הרצוי. פרוטוקול תרבית פרוסות האורגניות התואמיות שלנו נבדק ונאופטימיזה ביסודיות במהלך השנים האחרונות כדי להבטיח עקביות בדפוסי הנדידה ובאוריינטציה ב-RMS. בדוגמה זו, ניתוח של תאים הנודדים מהאקספלנט, שהושג מעכברים שבהם TD tomato מבוטא תחת מקדם nestin, חושף נדידה מהירה בעלת אוריינטציה גבוהה אל תוך ה-RMS של המארח.
הגדלה גבוהה. ניתוח של צילומי Time lapse מראה רזולוציה מצוינת של כל אורכו של נוירובלסט נודד במהלך סשן דימוי של 20 דקות. עם השלמת הדימוי, ניתן לקבע את הפרוסות באמצעות Paraformaldehyde 4% טרי שהוכן בקירור, ולבצע צביעה אימונוהיסטוכימית לרכיבים שונים של זרם הנדידה.
במקרה זה, אסטרוציטים חיוביים ל-GFAP בכחול וכלי דם חיוביים ל-CD 31 בירוק נחשפים באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית; ניתוח בהגדלה גבוהה של חתכים שנצבעו עבור החלבונים השלדיים actin בכחול ו-tubulin בירוק חושף ביטוי לא אחיד של רכיבים אלו על ידי תא בתהליך נדידה. הפרוטוקול שלנו מציב מספר אתגרים הדורשים סבלנות, תרגול והקדשת זמן הן להכנה והן לניתוח התוצאות.
להלן מספר הצעות מועילות שיסייעו לכם להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהניסויים שלכם. מניסיוננו, עכברים בטווח גילאים של P1 עד P10 מספקים את התוצאות הטובות ביותר. התאמת גילים בין מוחות התורם והמקבל משפרת גם היא את השחזוריות של הניסויים.
מכיוון שרוב הרכיבים וצלחות התרבית חייבים להיות מוכנים טריים, בדיקת הפרוסות שלנו דורשת מספר שעות של הכנה ודימוג רציפים ביום אחד. לאחר הוצאת המוחות, יש לבצע את השלבים הבאים במהירות רבה ככל האפשר. בין העריפה להכנת הפרוסות, יש לבצע את כל השלבים באמצעות קרח ורכיבים קרים, ויש לצמצם למינימום את המניפולציות ברקמה כדי למנוע שיבושים אנטומיים.
הכלים המשמשים לדיסקציות אלו חייבים להיות סטריליים ולשמש למניפולציות ברקמה חיה בלבד. אין להשתמש בכלים שהיו במגע עם מקבעים כגון formaldehyde. הפרוסות הן בדרך כלל חיות למשך עד 36 שעות, כאשר נצפית ירידה ניכרת בנדידה, במהירות ובכיון בין השעה ה-24 לשעה ה-36.
יש להביא בחשבון מגבלה זו בעת תכנון הניסויים והניתוחים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר בדיקת פרוסות אורגנוטיפיות (organotypic slice assay) שעברה אופטימיזציה עבור המוח לאחר הלידה, והדמיית time-lapse ברזולוציה גבוהה של נדידת נוירובלסטים בזרם הנדידה הרוסטרלי (rostral migratory stream). השיטה מאפשרת ויזואליזציה של נוירובלסטים נודדים במוח לאחר הלידה באמצעות השתלה צולבת של רקמות בין פרוסות אורגנוטיפיות של מוח עכבר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירוביולוגיה
- נדידת תאים
רקע
- בדיקות של פרוסות אורגנוטיפיות הן כלים עוצמתיים לחקר נדידה עצבית.
- הזרם הנדיד הראשוני (rostral migratory stream) הוא קריטי להבנת הנוירוגנזה במוח לאחר הלידה.
- טכניקות דימוי ברזולוציה גבוהה משפרות את התצפית על התנהגות הנוירובלסטים.
- מחקר זה מתמקד במוח לאחר הלידה, אשר נחקר פחות בהשוואה לשלבים עובריים.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של בדיקת פרוסות אורגנוטיפיות עבור המוח הפוסטנטלי.
- לחקירת הגורמים המשפיעים על נדידה עצבית בזרם הנדידה הרוסטרלי (rostral migratory stream).
- להדמיית נדידת נוירובלסטים באמצעות טכניקות דימוי מתקדמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת פרוסות אורגנוטיפיות ממוחות עכברים לאחר הלידה.
- השתלה הדדית של רקמות בין פרוסות מוח.
- דימות רב-רזולוציוני בשיטת Time-lapse.
- ניתוח דפוסי נדירה של נוירובלסטים.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של נדידת נוירובלסטים במוח לאחר הלידה.
- הדגמת יעילותו של ניסוי הפרוסות האורגנוטיפיות.
- תובנות לגבי הדינמיקה של נדידה נוירונלית.
- השלכות פוטנציאליות להבנת תהליכי התפתחות נוירונלית.
מסקנות
- בדיקת פרוסות אורגנוטיפיות היא שיטה בעלת ערך לחקר הגירה של נוירובלאסטים.
- גישה זו עשויה להוביל להבנה טובה יותר של התפתחות המוח לאחר הלידה.
- מחקרים עתידיים יוכלו להתבסס על ממצאים אלה כדי לבחון נתיבים טיפוליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בדיקת הפרוסות האורגנוטיפיות זו מאפשרת הדמיית time-lapse ברזולוציה גבוהה של נדידת נוירונים במוח לאחר הלידה, ובכך מספקת מערכת בעלת רלוונטיות פיזיולוגית להערכת ויסות אוטונומי ותלוי-סביבה של תנועת נוירובלאסטים. על ידי תמיכה בגישות של השתלה צולבת מרקעים גנטיים שונים, הבדיקה מקלה על תיקוף מטרות והסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים. היא מציעה ביטחון חזוי לצורך תיעדוף מועמדים טיפוליים המשפיעים על נתיבי נדידה נוירונלית בהפרעות התפתחותיות של מערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של נדידה מכוונת ומהירה של נוירובלסטים בזרם הנדידה הרוסטרלי (rostral migratory stream) תחת תנאים חוץ-תאיים קרובים למצב פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות הערכה כמותית של מהירות הנדידה, הכיוון והדפוס בתגובה להפרעות גנטיות או פרמקולוגיות.
- ערך ניבוי: תומך בסינון ותעדוף של פורטפוליו על ידי אספקת מדדים מדידים הניתנים לשחזור, המתואמים עם פעילות ביולוגית במערכת הרלוונטית למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקה בהמשך, על ידי שמירה על תנאים חוץ-תאיים אחידים המדמים את הסביבה in vivo עבור נוירובלסטים נודדים.
- ערך תפעולי: מספק תכנונים סטנדרטיים ו可שחזרים במינימום טיפול, ובכך מפחית שונות בתוצאות של דימיון time-lapse.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה תחת תנאים ניסיוניים מרובים, מה שמאפשר השוואה עקבית של פנוטיפי נדידה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה תחומי נוירוגנזה פוסטנטלית — האזור הסוב-אפנדימלי, זרם הנדידה הרוסטרלי והבצולת הריחית — כדי לחקור מנגנונים שניתן ליישם ישירות על מנגנונים של הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה, שבה ניתן לנטר את דינמיקת הנדידה באופן לונגיטודי.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשכת הפיתוח (go/no-go) על ידי חשיפת ביטוי לא אחיד של חלבוני שלד התא במהלך הנדידה, דבר המדגיש השפעות פוטנציאליות לא יעד (off-target) על המכניקה התאית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה של מטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לאישור פרה-קליני, ובמיוחד עבור משפעים של נדידה נוירונלית בהתפתחות המוח לאחר הלידה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על נדידת נוירובלאסטים בתגובה למשתנים ניסיוניים.
- סינון (Screening): מספק מוכנות למדידה באמצעות הכנה סטנדרטית של פרוסות והשתּלה, ובכך מפיק תוצאות כמותיות על מסלול ומהירות הנדידה.
- אנליטיקה: מייצר נתוני time-lapse ברזולוציה גבוהה ותוצרי אימונוהיסטוכימיה המאפשרים לצומי מחקר להשוות תנאים על בסיס תקינות הנדידה והדינמיקה של השלד התאי.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודות פרה-קליניות על ידי מידול מערכת רלוונטית למחלה שבה נדידה נוירונלית היא תהליך פתופיזיולוגי מרכזי.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר במגוון פרויקטים, ובכך מפחית פיתוח כפול של מודלים ומאפשר השוואה בין מחקרים של פנוטיפים של נדידה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במבחני נדידה עצבית באמצעות הדמיה ישירה ברזולוציה גבוהה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות פרוטוקולי תרבית פרוסות אופטימליים ומינימום טיפול ברקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות המשפיעות על נדידה, ובכך מפחית כישלונות בשלבים מאוחרים עקב השפעות ביולוגיות בלתי צפויות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נקודות סיום כמותיות מבוססות הדמיה, המנחות החלטות קידום במסלולי פיתוח נוירולוגיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח מוח לאחר לידה, חיתוך באמצעות ויברטור (vibratory sectioning) וטיפול סטרילי ברקמות לשמירה על חיוניות הפרוסות.
- תלוי במיקרוסקופיית פלואורסצנציה עם עדשות בעלות מרחק עבודה ארוך במיוחד ובקרת סביבה לצילומי time-lapse.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הפרוסות, השתלה ותזמון הדמיה כדי להבטיח קריאות נדידה שניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הבדיקה על רקעים גנטיים או מודלים של מחלות שונים, ובמיוחד בנוגע להתאמת גיל בין התורם למקבל.
- מוגבל על ידי חיוניות הפרוסות למשך עד 36 שעות, עם ירידה במהירות ובכיוון הנדידה לאחר 24 שעות, מה שמחייב השלמת הניסוי באותו יום.
